夏露，黃敏，梅潔，顏林志

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325027

宮頸癌是影響婦女健康的四大常見癌癥之一[1]。據(jù)估計(jì)，每年有超過31.1萬人死于宮頸癌，其中85%以上的死亡發(fā)生在不發(fā)達(dá)國家。我國宮頸癌的發(fā)病率和病死率居高不下，宮頸癌的主要治療方法包括放射治療和化療[2]，但放化療的療效有限，患者預(yù)后不佳。研究人員不斷尋找含有低毒和廣泛抗癌活性的植物衍生化合物的替代抗癌療法[3]。阿魏酸（ferulic acid, FA）是一種羥基肉桂酸，是蔬菜和水果中含量豐富的酚類植物化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化和抗腫瘤的生物活性。之前研究表明FA是一種有效的抗氧化劑，通過降低氧化應(yīng)激來保護(hù)DNA免受氧化損傷，防止脂質(zhì)過氧化[4]。FA可誘導(dǎo)許多腫瘤細(xì)胞毒性，如人骨肉瘤細(xì)胞、人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞[5-6]。此外，之前的研究還發(fā)現(xiàn)FA可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。然而，關(guān)于FA對(duì)宮頸癌的抗癌作用報(bào)道甚少。本文研究FA對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞株的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器 HeLa人宮頸癌細(xì)胞系來源于美國ATCC，購自BeNa Culture Collection（北京），胎牛血清以及高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，F(xiàn)A購自黃石飛云制藥有限公司，用高效液相色譜法測(cè)定FA純度為≥99.5%，并溶于二甲基亞砜（DMSO）中，4 ℃儲(chǔ)存。DMSO購于美國Sigma公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）試劑盒購于日本同仁公司。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）相關(guān)試劑購自北京TaKaRa公司。Transwell小室及培養(yǎng)板購自美國Corning公司。MitoTracker購自美國Invitrogen公司。JC-1染色試劑盒購自北京索萊寶公司?；|(zhì)膠購自美國BD公司。倒置生物顯微鏡購于德國徠卡公司。Bio-Rad 550酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖測(cè)定：為評(píng)價(jià)FA對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活性的影響，將細(xì)胞（3×103個(gè)/孔）接種于96孔板中，在100 μL的完全生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)24后，細(xì)胞以不同濃度的FA（1、2和4 mmol/L）處理，24 h后用PBS清洗各個(gè)孔中的細(xì)胞。隨后在每孔中加入100 μL PBS+10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)板在37 ℃下避光孵育1 h；control組的孔中加入100 μL PBS+10 μL CCK-8溶液。取出培養(yǎng)板，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在波長450 nm處測(cè)定每孔的吸光度，并計(jì)算各孔的細(xì)胞增殖活性。每個(gè)樣品每次含有2個(gè)復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖活性=[（實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度）/（control組吸光度-空白組吸光度）]×100%。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)：不同濃度FA（1、2和4 mmol/L）處理HeLa細(xì)胞24 h后，用TRIzol試劑從各組HeLa細(xì)胞中提取總RNA。然后使用PrimScriptTMRT試劑盒和gDNA Eraser將該mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR分析。引物序列來源于NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，見表1。對(duì)于RT-qPCR反應(yīng)，20 μL的反應(yīng)體系由10 μL Tli RNAseH Plus，0.8 μL的正向引物和0.8 μL的反向引物，6.4 μL的去RNA酶水以及2 μL cDNA組成。反應(yīng)條件在95 ℃下反應(yīng)3 min，1個(gè)循環(huán)，然后再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。特定引物對(duì)的Tm為30 s，然后使用熱循環(huán)儀進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，分別為95 ℃下5 s、62 ℃下34 s和95 ℃下15 s。以β-actin作為內(nèi)對(duì)照基因。結(jié)果用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析，每個(gè)樣品每次含有2個(gè)復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。

表1 RT-qPCR所用的引物序列

1.2.3 線粒體標(biāo)記（Mitotracker）染色：將接種于12孔板上的HeLa細(xì)胞用不用濃度的FA（1、2和4 mmol/L）處理24 h后，用PBS輕柔清洗3遍。隨后每孔中加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3遍，加入0.1% Triton通透10 min，PBS清洗3遍。最后將Mitotracker熒光染料加入到各個(gè)孔中，常溫避光孵育2 h后，用PBS清洗3遍，洗凈多余染料，加入DAPI孵育5 min，用PBS清洗3遍，加入抗熒光淬滅劑封固。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體。

1.2.4 線粒體JC-1染色：將HeLa細(xì)胞接種到6孔板上。待細(xì)胞粘附到板上后，向細(xì)胞中加入不同濃度的FA（1、2和4 mmol/L）處理24 h。隨后用PBS清洗3遍，每孔加入0.5 mL JC-1染色液，37 ℃下染色20 min，PBS清洗3遍后，加入0.5 mL培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位，綠色/紅色熒光強(qiáng)度比為線粒體活性及膜電位情況。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：使用Matrigel Transwell小室（孔徑8 μm，康寧，美國）檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。首先用不同濃度的FA（1、2和4 mmol/L）預(yù)處理HeLa細(xì)胞24 h，消化收集HeLa細(xì)胞，將大約1×104個(gè)細(xì)胞100 μL接種到上室。在底室中加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基600 μL作為化學(xué)誘導(dǎo)劑。孵育24 h后，用棉簽將殘留在上室的細(xì)胞擦拭，侵入下室的細(xì)胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，然后用0.2%結(jié)晶紫染色20 min。在倒置光學(xué)顯微鏡下拍攝侵入的細(xì)胞，并從隨機(jī)選擇的6個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察FA對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響。用200 μL黃色槍頭尖端損傷已經(jīng)融合的單層HeLa細(xì)胞，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次，在新鮮培養(yǎng)基中孵育48 h，用倒置顯微鏡觀察0和48 h時(shí)同一損傷邊緣細(xì)胞向損傷處遷移的情況，并使用ImageJ軟件進(jìn)行分析計(jì)算，劃痕面積比率（%）=（0 d劃痕面積-2 d的劃痕面積）/0 d的劃痕面積×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s Post-hoc檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FA對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活性的影響 FA處理組作用24 h后，與control組（99.33%±0.84%）比，HeLa細(xì)胞的增殖活性隨著FA濃度的增加而下降，F(xiàn)A 1 mmol/L組為（87.31%±8.43%），F(xiàn)A 2 mmol/L組為（58.21%±2.54%），F(xiàn)A 4 mmol/L組為（29.40%±0.76%），不同濃度的FA處理組間HeLa細(xì)胞的增殖活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示FA對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用具有藥物劑量依賴性。同時(shí)觀察FA處理后HeLa細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)起泡、細(xì)胞收縮、核固縮和碎裂，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡，見圖1。

圖1 FA對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響（光鏡）

2.2 FA對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響 隨著FA濃度增高，凋亡保護(hù)因子Bcl-2的表達(dá)水平相較于control組逐漸下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A；FA處理組的凋亡促進(jìn)因子Bax以及Cleavedcaspase-3的表達(dá)水平相較于control組逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B和2C。說明HeLa細(xì)胞的凋亡水平隨著FA濃度的增加而上升，提示FA對(duì)HeLa細(xì)胞的促凋亡作用具有明顯的藥物劑量依賴性。

圖2 FA對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3 FA對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體功能及活性的影響 隨著FA濃度增高，與control組比，F(xiàn)A處理組Mitotraker的熒光強(qiáng)度逐漸顯著減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。這提示HeLa細(xì)胞的線粒體數(shù)量及功能隨著FA濃度的增加而減弱。與control組比，F(xiàn)A處理組的綠色/紅色熒光強(qiáng)度比逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。這提示FA可以通過調(diào)節(jié)線粒體的膜電位增加HeLa細(xì)胞的線粒體凋亡水平。

圖3 Mitotracker染色檢測(cè)FA對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體的影響

圖4 JC-1染色檢測(cè)FA對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.4 FA對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與control組比（154.00± 23.07）個(gè)，F(xiàn)A處理組的HeLa細(xì)胞的侵襲能力隨著藥物濃度的提高其侵襲數(shù)量逐漸降低，不同濃度的FA處理組間HeLa細(xì)胞的侵襲能力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組劃痕面積比，F(xiàn)A處理組HeLa細(xì)胞隨著藥物濃度的提高其遷移降低，不同濃度的FA處理組間HeLa細(xì)胞的遷移能力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FA對(duì)HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FA對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

作為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[8]，宮頸癌是全球第三大確診的癌癥類型，發(fā)病率高[9]。由于先進(jìn)的醫(yī)療保健系統(tǒng)，發(fā)達(dá)國家的宮頸癌發(fā)病率在過去十年中有所下降[10]，但在發(fā)展中國家仍然很高[10]。盡管宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但研究人員普遍認(rèn)為HPV感染與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最近有研究報(bào)道，30歲以下女性的宮頸癌病死率有明顯的上升趨勢(shì)[11]。因此，明確宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有重要意義。

大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FA具有廣泛的生物活性。然而，盡管已知FA的重要治療特性包括抗癌功能[5-6]，但此前鮮見關(guān)于FA對(duì)宮頸癌的抗癌作用研究。本研究遷移侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著FA濃度的增加，HeLa細(xì)胞的遷移和侵襲能力隨之減弱，這說明在FA的作用下，HeLa細(xì)胞基本的發(fā)生發(fā)展受到抑制，從而降低其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率，并通過Bcl-2蛋白家族誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)受多種因素控制的復(fù)雜過程，如Bcl-2、Bax等。Bcl-2蛋白定位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，是一種有效的凋亡保護(hù)因子，已被報(bào)道可以減少細(xì)胞收縮、染色質(zhì)凝聚和DNA切割[10-12]。Bax蛋白是Bcl-2家族的一員，被激活以應(yīng)對(duì)壓力和損傷。所以，Bcl-2和Bax蛋白被認(rèn)為是決定細(xì)胞能否進(jìn)入凋亡過程的關(guān)鍵因素[13]。本研究發(fā)現(xiàn)FA可以通過增加Bcl-2的表達(dá)以及抑制Bax的表達(dá)來調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)Bcl-2家族的成員通過調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C從線粒體向胞漿的釋放，在固有的凋亡途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-15]。因此，通過對(duì)HeLa細(xì)胞中線粒體功能的探查，以及凋亡相關(guān)基因和蛋白的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FA處理線粒體膜電位及線粒體功能遭到破壞，且凋亡相關(guān)基因和蛋白都顯著增加，從而促進(jìn)了線粒體驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡，這表明FA可以通過調(diào)節(jié)線粒體功能以及凋亡相關(guān)基因，發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。