程 露 項(xiàng) 陽 逄洪波,* 職銘陽 趙宗耀 金 明 陳 強(qiáng) 鄭曉明

(1.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,沈陽 110034;2.沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,沈陽 110034;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所,北京 100081)

水稻是亞洲人口的主糧之一[1-2]，在全球的糧食安全中占有重要地位。我國是水稻大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約90%的世界水稻種植和產(chǎn)量均集中在亞洲，其中我國水稻產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的45%。但水稻屬喜溫作物，其生長發(fā)育的各個(gè)階段均易受到冷害威脅[3-4]。在我國，平均每4～5年就會發(fā)生一次大面積冷害，引起水稻大幅度減產(chǎn)甚至絕收[5-6]。故研究水稻耐冷機(jī)理、建立方便、精準(zhǔn)的耐冷評價(jià)體系對于水稻耐冷品種的選育具有十分重要的意義。

近年來，研究人員已經(jīng)針對水稻苗期耐冷種質(zhì)資源的篩選做了很多工作。商水根等[7]以苗期存活率為評價(jià)指標(biāo)，從1 542 份核心種質(zhì)資源中篩選出73 份耐冷性較強(qiáng)的材料；肖宇龍等[8]以苗期葉片的赤枯度作為耐冷性評價(jià)指標(biāo)，從江西省23份早稻中篩選出8 份耐冷性較強(qiáng)的材料；蔡志歡等[9]以死苗率作為評價(jià)指標(biāo)，從230份水稻種質(zhì)資源中篩選出19份耐冷性較強(qiáng)的材料；王代鑫等[10]以抗壞血酸過氧化物酶活性等4個(gè)生理指標(biāo)為評價(jià)指標(biāo)，從吉林省21份晚熟水稻苗期種質(zhì)資源中篩選出5份耐冷性較強(qiáng)的材料。這些研究結(jié)果表明，苗期葉片的赤枯度、存活率和死亡率等一系列生理指標(biāo)均可用于苗期耐冷性評價(jià)。但耐冷性屬于多個(gè)因素共同決定的數(shù)量性狀，僅用某一個(gè)或幾個(gè)評價(jià)指標(biāo)具有一定的局限性，不能精準(zhǔn)地鑒定出水稻的苗期耐冷性。故應(yīng)同時(shí)采用形態(tài)學(xué)指標(biāo)黃葉率和6個(gè)光合生理指標(biāo)，分別是初始熒光(Fo)、最大熒光產(chǎn)量(Fm)、PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)、原初光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)、葉綠素含量(SPAD)、葉片性能(PI)，以期對水稻苗期耐冷性進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定評價(jià)。

主成分分析是一種可將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)(即主成分)的多元統(tǒng)計(jì)方法。每個(gè)綜合指標(biāo)可涵蓋原始變量的絕大部分信息，有效避免了指標(biāo)間存在的信息重疊[11]，經(jīng)常與相關(guān)性分析、隸屬函數(shù)法和回歸分析等多種統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合使用，目前已應(yīng)用在水稻和小麥等多種農(nóng)作物的耐鹽和耐旱等抗逆性綜合評價(jià)中[12-15]。如馬帥國等[16]以165份粳稻為材料，以苗高、根長和SPAD值等12個(gè)形態(tài)學(xué)性狀作為評價(jià)指標(biāo)，通過主成分分析法、聚類分析和逐步回歸分析對苗期耐鹽性進(jìn)行綜合評價(jià)，篩選出5份耐鹽性較強(qiáng)的材料；袁杰等[17]以株高、根長和苗鮮重等6個(gè)形態(tài)學(xué)性狀作為評價(jià)指標(biāo)，通過相關(guān)性分析和主成分分析結(jié)合隸屬函數(shù)法對42份水稻苗期耐鹽性進(jìn)行綜合評價(jià)，篩選出5份耐鹽性較強(qiáng)的材料；孔憲旺等[18]以20份優(yōu)異水稻種質(zhì)資源為材料，以苗高、根長和莖葉鮮重等9個(gè)形態(tài)學(xué)性狀為評價(jià)指標(biāo)，通過差異性顯著分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，綜合評價(jià)了苗期耐旱性，篩選出3份耐旱性較強(qiáng)的材料。目前，已對作物的一些抗逆性，如耐鹽和耐旱等進(jìn)行了綜合評價(jià)，而對水稻苗期耐冷性的綜合評價(jià)鮮見報(bào)道。本研究以52份水稻種質(zhì)資源作為研究對象，采用人工低溫脅迫法，測定其形態(tài)學(xué)指標(biāo)黃葉率和6個(gè)光合生理指標(biāo)，應(yīng)用主成分分析、隸屬函數(shù)法、聚類分析和回歸分析等多種統(tǒng)計(jì)方法，對水稻苗期耐冷性進(jìn)行綜合鑒定評價(jià)，旨在建立更加精準(zhǔn)的耐冷性綜合評價(jià)體系，以期為培育苗期耐冷品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所選用的52份水稻種質(zhì)資源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，分別來自中國、菲律賓、馬來西亞、斯里蘭卡及日本5個(gè)國家。具體品種信息，見表1。

表1 用于本試驗(yàn)水稻品種詳細(xì)信息Table 1 Details of rice varieties used in this study

表1(續(xù))

1.2 幼苗培養(yǎng)

種子置于50 ℃ 72 h打破休眠后，光照氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(30 ℃，光照 12 h/黑暗 12 h，光強(qiáng)12 000 lx)至三葉一心后，選取健壯、長勢較一致的3盆苗進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)分為3組，對照組(CK)：放置于人工氣候培養(yǎng)箱(30 ℃，光照 12 h/黑暗 12 h，光強(qiáng)12 000 lx)培養(yǎng)；試驗(yàn)A組：放置于人工氣候培養(yǎng)箱(10 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光強(qiáng)12 000 lx)進(jìn)行48 h 低溫脅迫后測定生理指標(biāo)；試驗(yàn)B組：放置于人工氣候培養(yǎng)箱(4 ℃，光照12 h/黑暗12 h，光強(qiáng)12 000 lx)進(jìn)行24 h 低溫脅迫后測定黃葉率。

1.3 生理指標(biāo)的測定

參考Zhao等[19]的研究，選取低溫脅迫前與低溫脅迫后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定，測定位置選取水稻第二葉的中上部，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)取平均值。

1.3.1葉綠素含量的測定

采用SPAD-502 Plus葉綠素儀(浙江托普儀器公司)進(jìn)行測定。

1.3.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

使用英國 Hansatech 公司的pocket PEA 便攜式熒光儀測定Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm和PI指標(biāo)。測定前水稻葉片進(jìn)行暗適應(yīng)30 min。

1.4 形態(tài)指標(biāo)的測定

測定4 ℃低溫脅迫24 h后幼苗黃葉的數(shù)量，葉片發(fā)黃超過一半以上則記為黃葉，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010計(jì)算原始數(shù)據(jù)均值，利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析以及逐步回歸分析，相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式和方法參考付麗君等[20]的方法。

1.5.1耐冷系數(shù)

對于所測得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對照組所測3次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行平均值計(jì)算，取其平均值；處理組同對照組，取其平均值。

(1)

式中：CTC為52個(gè)水稻品種其7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的耐冷系數(shù)，T為試驗(yàn)組中各單項(xiàng)指標(biāo)低溫脅迫后3次測定值的平均值，CK為對照組中各單項(xiàng)指標(biāo)30 ℃ 3次測定值的平均值。

1.5.2綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值(U(Xj))

(2)

式中：Xj、Xmin和Xmax依次表示每個(gè)試驗(yàn)材料中第j個(gè)綜合指標(biāo)值、最小值和最大值。

1.5.3權(quán)重(Wj)

(3)

式中：Pj為所有試驗(yàn)材料第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

1.5.4耐冷性綜合評價(jià)值(D)

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下各指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表2可知，在低溫脅迫下52份水稻種質(zhì)資源6個(gè)光合生理指標(biāo)與形態(tài)學(xué)指標(biāo)黃葉率之間均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中Fo、Fv/Fo、SPAD與黃葉率呈顯著負(fù)相關(guān)，F(xiàn)m與黃葉綠呈極顯著負(fù)相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)到-0.416；Fm與Fo、Fv/Fo、Fv/Fm、PI及黃葉率之間均呈極顯著正相關(guān)，其中與Fv/Fm之間的相關(guān)系數(shù)最大，為0.823。此外，這些指標(biāo)之間均呈顯著相關(guān)關(guān)系，導(dǎo)致信息重疊，無法通過這些指標(biāo)準(zhǔn)確的鑒定出水稻的苗期耐冷性，故本研究通過主成分分析法對水稻的耐冷性進(jìn)行綜合評價(jià)。

表2 低溫脅迫下水稻苗期各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 2 Correlation coefficient matrix of rice seedling indicators under low temperature stress

2.2 主成分分析

由表3可知，主成分1、2、3的特征值依次為3.338、1.602和0.939，均>0.90，且前3個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別是47.686%、22.892%和13.412%，累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)83.991%，包含了絕大多數(shù)信息。因此，本研究選取前3個(gè)主成分(CI1、CI2和CI3)，即將最初的7個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成3個(gè)相對獨(dú)立的綜合指標(biāo)對苗期耐冷性進(jìn)行綜合評價(jià)。

表3 各綜合指標(biāo)的特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic value and contribution rate of each comprehensive index

由表4可知，在主成分1(CI1)中，F(xiàn)m、Fv/Fo和Fv/Fm為主要作用因子，其因子載荷分別為0.917、0.940、和0.899；主成分2(CI2)中，F(xiàn)o、SPAD和黃葉率為主要作用因子，其因子載荷分別為0.743、0.720 和-0.533；而主成分3(CI3)中，F(xiàn)o、SPAD和PI為主要作用因子，其因子載荷分別為0.492、-0.477 和-0.451。

表4 各綜合指標(biāo)值的因子載荷矩陣Table 4 Factor loading matrix of each comprehensive index value

2.3 水稻苗期耐冷性綜合評價(jià)

由表5可知，對于同一個(gè)綜合指標(biāo)CI1而言，‘東農(nóng)4號’在10 ℃低溫脅迫下的綜合指標(biāo)值(CI1)最大，達(dá)到3.598，且對應(yīng)的隸屬函數(shù)值U1=1，說明如果將主成分1作為苗期耐冷性評價(jià)指標(biāo)，‘東農(nóng)4號’品種的耐冷性最強(qiáng)；而‘IRIS 313-15901’CI1值最小，且U1值為0，說明其耐冷性最差。根據(jù)各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率結(jié)合公式(3)，求出3個(gè)綜合指標(biāo)權(quán)重W分別為0.568、0.273和0.160，說明主成分1所占的權(quán)重較大。根據(jù)公式(4)，求出各品種的耐冷性綜合評價(jià)值(D)(表5)，且D與耐冷性成顯著正相關(guān)。

表5 低溫脅迫下52個(gè)水稻品種的綜合指標(biāo)值(CI)及其權(quán)重(W)、隸屬函數(shù)值(U)、耐冷性評價(jià)值(D)及排序Table 5 Comprehensive index value (CI)and its weight (W),membership function value (U),cold tolerance evaluation (D)and ranking of 52 rice varieties under low temperature stress

表5(續(xù))

表5(續(xù))

2.4 聚類分析

根據(jù)D，將52份水稻品種進(jìn)行耐冷性劃分為5類，見圖1，分別為極強(qiáng)耐冷、強(qiáng)耐冷、中耐冷，弱耐冷及冷敏感。極強(qiáng)耐冷組中是‘合江4號’、‘津原85’和‘東農(nóng)4號’3份材料；強(qiáng)耐冷分組中有16份材料，分別是‘北稻1號’、‘特青’、‘勝優(yōu)2號’、‘鎮(zhèn)稻2號’、‘京稻21’、‘京花103’、‘富禾99’、‘南粳37’、‘特三矮2’、‘元豐6號’、‘龍粳14’、‘石狩白毛’、‘藤系138’、‘五優(yōu)稻1號’、‘沈農(nóng)129’和‘開粳2號’；中耐冷組有26個(gè)品種，分別是‘雙桂1號’、‘豫秈9號’、‘IRIS 313-11882’、‘IRIS 313-12236’、‘廣場13’、‘IRIS 313-11951’、‘揚(yáng)稻5號’、‘IRIS 313-11885’、‘中花8號’、‘IRIS 313-11866’、‘IRIS 313-11911’、‘IRIS 313-12273’、‘鹽粳48’、‘鎮(zhèn)秈96’、‘IRIS 313-11929’、‘IRIS 313-12135’、‘IRIS 313-11968’、‘IRIS 313-11986’、‘科砂1號’、‘特優(yōu)2035’、‘廣場矮3784’、‘IRIS 313-12012’、‘珍珠矮11’、‘BG90-2’、‘IRIS 313-11887’和‘馬來紅’；弱冷寒組有3個(gè)品種，分別是‘IRIS 313-11859’、‘臨秈22’和‘IRIS 313-11884’；冷敏感組有4份材料，分別是‘IRIS 313-15901’、‘鎮(zhèn)稻272’、‘瀘紅早1號’和‘秈小占’。

Ⅰ，強(qiáng)耐冷；Ⅱ，極強(qiáng)耐冷；Ⅲ，弱耐冷；Ⅳ，中耐冷；Ⅴ，冷敏感。虛線表示歐式距離2.5。Ⅰ,strong cold tolerance;Ⅱ,extremely strong cold tolerance;Ⅲ,weak cold tolerance;Ⅳ,moderate cold tolerance;Ⅴ,cold sensitivity.The dotted line represents Euclidean distance 2.5.圖1 基于D的52份水稻種質(zhì)資源的耐寒性聚類分析Fig.1 Cluster analysis of cold tolerance of 52 rice germplasm resources based on D value

2.5 回歸模型建立與苗期耐冷性主要評價(jià)指標(biāo)的篩選

為了進(jìn)一步確定水稻苗期耐冷性評價(jià)指標(biāo)，以D作為因變量y，7個(gè)相關(guān)指標(biāo)作為自變量x，進(jìn)行了逐步回歸分析，回歸方程如下：

Y=-0.043+0.244X1+0.208X2+0.100X3+
0.152X4+0.123X5-0.016X6-0.110X7。

式中：X1-7依次代表Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD、PI和黃葉率，方程判定系數(shù)R2=1，P=0，7個(gè)自變量幾乎可決定D的全部變異，由此可見。這7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)與水稻苗期耐冷性顯著相關(guān)，其中Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm和SPAD共5個(gè)指標(biāo)與其耐冷性呈顯著正相關(guān)，葉片性能PI和黃葉率與其耐冷性呈顯著負(fù)相關(guān)，可以作為水稻苗期耐冷性的主要評價(jià)指標(biāo)。

3 討 論

3.1 水稻苗期耐冷指標(biāo)篩選

植物受逆境脅迫的影響與逆境種類、逆境強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間等多種因素緊密相連，且與植物種類有關(guān)[21-23]。研究表明，低溫脅迫對水稻的外部形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)均會產(chǎn)生影響[24-28]。形態(tài)學(xué)指標(biāo)是一種直接的診斷工具，可以直接反映植物受低溫?fù)p傷的程度[29-30]。相對于形態(tài)學(xué)指標(biāo)而言，生理學(xué)指標(biāo)可進(jìn)一步反映植物在逆境條件下體內(nèi)各代謝過程的變化[31-32]，水稻在低溫脅迫下會減少葉綠素合成，故葉綠素含量和葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)的參數(shù)通常被作為判斷植物耐受逆境脅迫能力的重要指標(biāo)[25]。本研究選用形態(tài)學(xué)指標(biāo)黃葉率并在此基礎(chǔ)上結(jié)合Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD及PI 6個(gè)光合生理指標(biāo)作為水稻苗期耐寒性的評價(jià)指標(biāo)。

3.2 水稻苗期耐冷性綜合評價(jià)

植物耐冷特性是一個(gè)由多種因素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜機(jī)制[33]，僅用單一的某個(gè)指標(biāo)評價(jià)植物的耐冷性具有一定的局限性，可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。多個(gè)評價(jià)指標(biāo)可以從不同方面反映出耐冷性，但多個(gè)指標(biāo)間往往存在一定的相關(guān)性，數(shù)據(jù)出現(xiàn)信息重疊，導(dǎo)致難以正確判斷各個(gè)指標(biāo)對于某一性狀的影響。應(yīng)用主成分分析法，可有效消除各項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性，且指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)越大，分析效果越好。此外，主成分分析可將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成相對獨(dú)立的幾個(gè)綜合指標(biāo)，且按照方差大小依次排序，通常選擇累計(jì)貢獻(xiàn)率≥80%的主成分，包含絕大部分原始數(shù)據(jù)信息。如王麗艷等[34]以11份水稻種質(zhì)資源的種子萌發(fā)和幼苗生長指標(biāo)為耐冷評價(jià)依據(jù)，唐雙勤等[35]以供試的41份水稻種質(zhì)資源芽期的7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)為耐冷評價(jià)依據(jù)，通過主成分分析、聚類分析并結(jié)合隸屬函數(shù)值方法對其進(jìn)行耐冷性綜合評價(jià)。目前已有的主成分分析研究中，有關(guān)水稻苗期耐冷性的研究相對較少，并且由于生理指標(biāo)的評定工作量大且繁瑣，因此絕大多數(shù)研究均采用形態(tài)學(xué)指標(biāo)，只有少數(shù)研究采用生理學(xué)指標(biāo)。本研究選用了形態(tài)學(xué)指標(biāo)黃葉率，并在此基礎(chǔ)上添加了葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為生理指標(biāo)，以上生理指標(biāo)可直接通過儀器測定，簡便易行，工作量小。已有研究表明，光合作用可反映植物在逆境條件下自身的生長發(fā)育狀態(tài)，葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的大小可作為植物耐受逆境的生理指標(biāo)[36]。

3.3 不同水稻品種間的耐冷性差異

本試驗(yàn)基于耐冷性綜合評價(jià)值(D)將52份種質(zhì)資源聚類分為5個(gè)耐冷等級。其中極強(qiáng)耐冷品種3個(gè)，均屬于粳稻；強(qiáng)耐冷品種共16份，13份是粳稻；弱耐冷的3個(gè)品種與冷敏感4個(gè)品種均為秈稻。從結(jié)果上看，粳稻的耐冷性普遍強(qiáng)于秈稻，這也與以往的研究結(jié)果相一致[29,37]。3個(gè)極強(qiáng)耐冷品種‘合江4號’、‘東農(nóng)4號’和‘津原85’是來自黑龍江省和天津市培育成的品種。同時(shí)本研究中有3份秈稻屬于強(qiáng)耐冷品種，說明秈稻中也存在較好的耐冷資源，這3份材料是來自廣東省的‘特青’、‘勝優(yōu)2號’和‘特三矮2’。廣東省位于中國南部，屬亞熱帶和熱帶季風(fēng)氣候，其北靠南嶺山脈，南臨南海，稻區(qū)遼闊，從低海拔的潮田到海拔千米的山區(qū)梯田都有水稻種植，且很多地區(qū)是雙季稻。且這3個(gè)秈稻品種是早秈稻。這也反映出水稻品種的耐冷性不僅僅是由其自身遺傳因素所決定的，還可能與當(dāng)?shù)胤N植的習(xí)俗有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究選用形態(tài)學(xué)性狀指標(biāo)黃葉率，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合Fo、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm、SPAD及PI等6個(gè)光合生理指標(biāo)，對52份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行苗期耐冷性鑒定，通過相關(guān)性分析，表明低溫脅迫下7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)之間存在不同程度的相關(guān)性；通過主成分分析，將7個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成3個(gè)相對獨(dú)立的綜合指標(biāo)；并結(jié)合隸屬函數(shù)法得到各主成分的權(quán)重及52個(gè)水稻品種耐冷特性的綜合評價(jià)值(D)；通過聚類分析將52份水稻種質(zhì)資源劃分成5個(gè)耐冷等級；基于D篩選出3份極強(qiáng)耐冷種質(zhì)資源，分別為‘東農(nóng)4號’、‘合江4號’、‘津原85’；通過回歸分析對水稻苗期耐冷性進(jìn)行預(yù)測，其結(jié)果與隸屬函數(shù)法所得結(jié)果相吻合，綜合主成分分析和回歸分析篩選出的這7個(gè)指標(biāo)可以作為鑒定水稻苗期耐冷特性的可靠指標(biāo)。