何 洋 施紅梅 杜彥麗 豆騰飛 王 坤 賈俊靜 葛長榮

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

法氏囊最早由意大利解剖學(xué)家Hieronymus Fabricius于1621年發(fā)現(xiàn)，并因此而得名[1]，它是禽類的腸道相關(guān)淋巴組織(Gut-associated lymphoid tissue,GALT)，也是禽類特有的免疫器官，在抗原的刺激下，法氏囊能作為初級免疫器官為B細(xì)胞的發(fā)育成熟提供必要微環(huán)境，也能作為次級免疫器官參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[2]。目前，眾多學(xué)者已從解剖學(xué)與免疫學(xué)角度較為完整地揭示了法氏囊的結(jié)構(gòu)發(fā)育過程[3-4]。如圖1所示，法氏囊的發(fā)育伴隨著造血干細(xì)胞的定植而始于胚胎早期，并在出生后發(fā)育完全，同時(shí)會(huì)隨著機(jī)體年齡的增長而發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)退化直至完全消失。法氏囊的免疫功能與其結(jié)構(gòu)發(fā)育密切相關(guān)，其結(jié)構(gòu)的損傷將會(huì)導(dǎo)致法氏囊免疫功能的紊亂，進(jìn)而造成機(jī)體的免疫缺陷，不利于禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益與健康發(fā)展。因此，從結(jié)構(gòu)發(fā)育的角度對法氏囊的免疫功能進(jìn)行剖析具有重要意義，而與之密切相關(guān)的問題如造血干細(xì)胞向法氏囊的定向遷移機(jī)制、法氏囊增齡性退化的發(fā)生機(jī)制以及法氏囊對淋巴B細(xì)胞的篩選與促進(jìn)作用等還未得到全面的解答，這也成為現(xiàn)今法氏囊相關(guān)研究的焦點(diǎn)。本文基于這些問題的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，總結(jié)法氏囊結(jié)構(gòu)發(fā)育與免疫功能的研究新進(jìn)展，并對導(dǎo)致法氏囊免疫功能紊亂的因素進(jìn)行概述，旨在為今后的法氏囊相關(guān)研究提供方向，對抗病育種進(jìn)程以及高效疫苗的開發(fā)具有重要意義。

依據(jù)參考文獻(xiàn)[3-4]進(jìn)行繪制。The figure was drawn according to the reference[3-4].圖1 禽法氏囊的發(fā)育與結(jié)構(gòu)Fig.1 Development and structure of avian fabricius

1 法氏囊發(fā)育新進(jìn)展

1.1 法氏囊原基的起源

法氏囊的發(fā)生發(fā)育包含2個(gè)關(guān)鍵步驟，首先是法氏囊原基出現(xiàn)，其次是不同批次的造血干細(xì)胞在法氏囊中的定植。對于法氏囊原基的起源是存有爭議的，早期研究認(rèn)為法氏囊起源于內(nèi)胚層，由內(nèi)胚層空泡化形成的法氏囊腔是其最有利的證據(jù)，但是內(nèi)胚層的標(biāo)記分子—音猬因子(Sonic hedgehog,Shh)并未從法氏囊上皮中被檢測，這導(dǎo)致法氏囊原基的起源受到質(zhì)疑。在后續(xù)的研究中，利用人工構(gòu)建的“雞-鵪鶉”法氏囊原基嵌合體還原法氏囊的發(fā)育過程后，發(fā)現(xiàn)僅有鵪鶉外胚層尾芽與雞法氏囊間質(zhì)進(jìn)行重組的法氏囊原基在孵育的過程中會(huì)形成法氏囊濾泡，表明法氏囊原基應(yīng)起源于外胚層[5]。而最新的研究表明，并不只是內(nèi)胚層會(huì)發(fā)生空泡化現(xiàn)象，一些內(nèi)卷的外胚層也出現(xiàn)了空泡化，即法氏囊原基的起源與內(nèi)外胚層均存在聯(lián)系[6]。

1.2 造血干細(xì)胞在法氏囊中的定植

多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，至少有3個(gè)批次的造血干細(xì)胞在不同的時(shí)間內(nèi)完成在法氏囊中的定植，它們能分化形成形態(tài)各異的功能細(xì)胞，并參與法氏囊的免疫功能。以雞為例，在造血功能發(fā)生的同時(shí)(孵育期2～3 d)，卵黃囊血島內(nèi)出現(xiàn)了3種形態(tài)及表面抗原存在差異的造血干細(xì)胞(圖1)，分別是大而圓，具有CD45/51/61/Grl1/Grl2免疫活性的血小板前體細(xì)胞；體型小而不規(guī)則，具有CD45/Grl2/Lep100/AcPhos免疫活性的巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞；外型分叉具有CD45/MHC II免疫活性的淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞，這些細(xì)胞從主動(dòng)脈簇及主動(dòng)脈旁遷移至全身各處[7]。在孵育期第8天至出殼前，圓形細(xì)胞短暫聚集于法氏囊間質(zhì)遠(yuǎn)端，并在出殼后第二天完全消失。在孵育期第9～12天時(shí)，不規(guī)則型細(xì)胞及分叉型細(xì)胞先后定植于法氏囊間質(zhì)，不規(guī)則型細(xì)胞可分化為網(wǎng)狀上皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞以及分泌樹突細(xì)胞等，它們一同構(gòu)成法氏囊濾泡的髓質(zhì)部分并為之后分叉型細(xì)胞的定植提供環(huán)境[8-10]。而分叉型細(xì)胞作為B淋巴細(xì)胞的前體向法氏囊遷移，并在遷移過程中伴隨著細(xì)胞表面免疫球蛋白(Surface immunoglobulin,SIg)V(D)J基因的重組[11]。

目前尚不清楚影響造血干細(xì)胞對法氏囊中定向遷移的具體因素，但普遍認(rèn)為該過程與細(xì)胞因子(Cytokines)相關(guān)[12]。細(xì)胞因子是一組由多種細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)，它們能作為細(xì)胞間的介質(zhì)調(diào)控淋巴細(xì)胞增殖發(fā)育[13]，并促進(jìn)機(jī)體先天免疫反應(yīng)與適應(yīng)性免疫應(yīng)答[14]，而細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的遷移也受其調(diào)控，該過程主要由趨化因子(Chemokines)負(fù)責(zé)。淋巴細(xì)胞表面7跨膜G蛋白伴侶受體(Seven transmembrane G protein coupled receptors)通過與趨化因子結(jié)合而被激活[15]，從而促使免疫細(xì)胞發(fā)生遷移，如當(dāng)法氏囊感染傳染性法氏囊病(Infectious bursa disease,IBD)時(shí)，會(huì)造成感染者法氏囊的嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致法氏囊內(nèi)的B細(xì)胞快速損耗從而引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫抑制[16]，此時(shí)CC趨化因子19(CC chemokine ligand 19,CCL19)與其趨化因子受體CCR7(Chemokine receptor 7)能引起外周淋巴細(xì)胞向法氏囊遷移，導(dǎo)致法氏囊內(nèi)T細(xì)胞的數(shù)量增加[17]；CXCL12(也稱作間質(zhì)衍生因子1(Stromal derived factor 1))與其受體CXCR4(Chemokine receptor)作為哺乳動(dòng)物正?；蚍钦０l(fā)育狀態(tài)下細(xì)胞遷移指標(biāo)而受到關(guān)注[18-20]，而禽類的CXCL12與哺乳動(dòng)物相比，表現(xiàn)出高度保守性[21]。在法氏囊發(fā)育過程中，CXCL12的動(dòng)態(tài)表達(dá)與B細(xì)胞的增殖分化及之后向外周淋巴組織的遷移相關(guān)[22]，敲除雞脾臟B細(xì)胞的CXCR4受體則會(huì)抑制該細(xì)胞向法氏囊的遷移[23]，這個(gè)結(jié)果一定程度上解釋了法氏囊發(fā)育過程不同批次造血干細(xì)胞的遷移機(jī)制，即CXCL12-CXCR4軸在禽法氏囊發(fā)育過程中扮演了重要角色。

1.3 法氏囊的增齡性退化

伴隨著禽類性成熟以及產(chǎn)蛋的開始，法氏囊出現(xiàn)增齡性退化，Bickfor等[24]詳細(xì)地描述了整個(gè)法氏囊退化的過程，法氏囊的退化按組織變化可分為早中晚3個(gè)時(shí)期，以雞為例，最早于公雞20周齡，母雞24周齡便可觀察到法氏囊退化的發(fā)生。法氏囊退化的早期(公雞20周齡，母雞24周齡)以褶皺結(jié)構(gòu)變化及淋巴細(xì)胞的出逃為特征，具體表現(xiàn)為法氏囊褶皺上皮增厚，密度變大而導(dǎo)致法褶皺間發(fā)生粘連，部分褶皺上皮出現(xiàn)稀薄、折疊以及脫離現(xiàn)象，導(dǎo)致濾泡相關(guān)上皮(Follicle associated epithelium，F(xiàn)AE)失去屏障與吞噬能力，促使淋巴細(xì)胞從萎縮的法氏囊濾泡內(nèi)溢出至法氏囊腔內(nèi)，同時(shí)法氏囊濾泡的髓質(zhì)區(qū)域發(fā)生液化性壞死，并伴隨著皮質(zhì)碎片化，形成由一層立方上皮薄膜包覆的髓質(zhì)腫塊；法氏囊退化中期(公雞24周齡，母雞26周齡)的顯著特征是濾泡間結(jié)締組織增多，此時(shí)法氏囊褶皺粘連導(dǎo)致上皮結(jié)構(gòu)的完全喪失，同時(shí)肌層收縮擠壓致使法氏囊腔消失而形成肌層殘基，殘基內(nèi)充斥萎縮的濾泡、浸潤的噬異性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及纖維結(jié)締組織，而在萎縮的濾泡中，髓質(zhì)腫塊周圍聚集大量不規(guī)則的壞死淋巴細(xì)胞，部分髓質(zhì)腫塊中充斥著壞死殘基以及一些細(xì)胞碎屑和膽固醇結(jié)晶；在法氏囊退化晚期(公雞26周齡，母雞28周齡)，殘基周圍的肌層收縮，此時(shí)的殘基由相對致密包含膽固醇結(jié)晶病灶與濾泡殘骸的結(jié)締組織組成。

關(guān)于法氏囊生理性退化的機(jī)制，目前主流的觀點(diǎn)均集中于機(jī)體內(nèi)激素水平變化導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境改變而造成法氏囊不可逆退化的發(fā)生，但哪種激素起主導(dǎo)作用則尚存爭議。過往研究中普遍把法氏囊的退化與體內(nèi)性固醇激素水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)，體內(nèi)性固醇激素的上升導(dǎo)致FAE活性改變，引起法氏囊濾泡內(nèi)的淋巴細(xì)胞大量溢出，特別是雄性法氏囊退化時(shí)間早于雌性，強(qiáng)調(diào)了性激素類型在法氏囊退化中的重要性[24]。另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為法氏囊的退化與體內(nèi)生長激素水平相關(guān)[25-26]。生長激素主要由垂體分泌，參與機(jī)體蛋白合成、脂質(zhì)降解等重要的生物過程。研究發(fā)現(xiàn)，除垂體外一些組織器官同樣能夠分泌生長激素，其中包括法氏囊[27]。對于體液循環(huán)中的生長激素總量，垂體外組織器官所分泌的生長激素占比不到1%，提示由它們分泌的生長激素更多參與自分泌與旁分泌功能。此外，生長激素能夠激活PI3K/AKT通路而發(fā)揮抗凋亡的功能[28-29]，因而生長激素能抑制法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞與上皮細(xì)胞的凋亡，以維持法氏囊的結(jié)構(gòu)與功能，但生長激素會(huì)隨著年齡增長而減少分泌，這會(huì)引起法氏囊內(nèi)細(xì)胞的快速凋亡，導(dǎo)致法氏囊的退化。另外一些研究發(fā)現(xiàn)外源性糖皮質(zhì)類固醇激素(Glucocorticoid)能夠引起雞法氏囊結(jié)構(gòu)組織的萎縮，法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞的凋亡，并造成嚴(yán)重的免疫抑制[30]。在哺乳動(dòng)物中，由胸腺分泌的內(nèi)源性GC作為重要的旁分泌因子協(xié)同由腎上腺分泌的GC參與了胸腺器官的穩(wěn)態(tài)以及T細(xì)胞的發(fā)育及選擇[31-32]。最近研究發(fā)現(xiàn)雞法氏囊自身也具有糖皮質(zhì)類固醇激素合成所需的所有酶和輔助因子[33]，屬于腎上腺外的糖皮質(zhì)類固醇(Extra-adrenal glucocorticoid)激素合成組織[34]。雖然目前尚不清楚法氏囊合成GC的目的以及這些GG對法氏囊免疫功能的影響，但結(jié)合內(nèi)外源性GC對免疫器官與細(xì)胞的雙向作用來看，推測法氏囊合成的GC應(yīng)與對B細(xì)胞的篩選以及法氏囊增齡性結(jié)構(gòu)組織變化存在聯(lián)系，但這需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 法氏囊免疫功能研究新進(jìn)展

2.1 法氏囊對B細(xì)胞的篩選

禽法氏囊對B淋巴細(xì)胞的成熟至關(guān)重要，幾乎完全參與了B細(xì)胞的整個(gè)發(fā)育階段，包括篩選、維持以及促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化，而對B淋巴細(xì)胞的篩選又可分為2個(gè)階段。當(dāng)B淋巴細(xì)胞前體遷移至法氏囊基質(zhì)，依據(jù)其基因重組的形式，細(xì)胞表面會(huì)產(chǎn)生功能性SIg(SIg+)與非功能性(SIg-)2種受體復(fù)合物，其中SIg+型的細(xì)胞進(jìn)入法氏囊濾泡繼續(xù)增殖，而SIg-型細(xì)胞則會(huì)被線粒體或FAS介導(dǎo)的凋亡途徑剔除[35]。SIg+型細(xì)胞進(jìn)入法氏囊濾泡后，以不同尺寸同時(shí)存在，相較于小尺寸細(xì)胞，大尺寸細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖分化活性[36]，并能維持較長的生命周期，而小尺寸細(xì)胞在短暫的分化后便快速凋亡。法氏囊在整個(gè)篩選過程中會(huì)剔除95%的B淋巴細(xì)胞，僅有5%的細(xì)胞能夠成熟并進(jìn)入外周免疫器官。

研究表明，2個(gè)篩選階段具有完全不同的機(jī)制，法氏囊對SIg+型細(xì)胞篩選的關(guān)鍵點(diǎn)在于其表面IgM的表達(dá)。IgM能協(xié)助表面B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)的信號傳導(dǎo)聚合物—Igα在SIg+型細(xì)胞表面表達(dá)，從而確保B淋巴細(xì)胞前體在法氏囊濾泡的定植[37]。而法氏囊對濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞的篩選則與腸道抗原密切相關(guān)，當(dāng)腸道抗原與法氏囊內(nèi)B細(xì)胞的BCR結(jié)合后，能延長B細(xì)胞的壽命以完成之后的發(fā)育過程[38]。

由于腸道抗原對維持法氏囊濾泡內(nèi)B細(xì)胞活力的必要性，因此法氏囊需要通過特定的結(jié)構(gòu)—法氏囊褶皺，對腸道抗原進(jìn)行識別、捕獲與轉(zhuǎn)運(yùn)。法氏囊褶皺表面由90%濾泡間上皮(Interfollicular epithelium,IFE)及10%的FAE構(gòu)成，F(xiàn)AE與IFE均由法氏囊褶皺上皮細(xì)胞分化形成，不同的FAE之間由IFE間隔。IFE由柱狀分泌細(xì)胞(Cylindrical-shaped secretory cell,SC)、立方基底細(xì)胞(Cuboidal basal cells,BCs)以及基底層薄膜(Basement membrane)構(gòu)成[39-41]，SC又分為SCI與SCII，SCII具有小窩蛋白(Caveolin-1)免疫活性，而SCI與BCs均能表達(dá)粘液蛋白對法氏囊腔及法氏囊管潤滑，提示BCs可能是SCI的前體[40]。與IFE不同的是，F(xiàn)AE不具有基底層薄膜結(jié)構(gòu)，它由3～5層上皮支持細(xì)胞(Epithelium supporting cell)支撐，而FAE與ESC細(xì)胞之間則通過橋粒(Desmosomes)相連。ESC與髓質(zhì)皮質(zhì)上皮細(xì)胞(Corticomedullary epithelium cell)共同構(gòu)成了法氏囊濾泡髓質(zhì)上皮(Medullary epithelial)。FAE的功能類似于哺乳動(dòng)物腸道上皮內(nèi)的M細(xì)胞(Microfold cell)。M細(xì)胞能夠從腸管中識別、捕獲并轉(zhuǎn)運(yùn)腸道抗原至淋巴細(xì)胞，因此在粘膜相關(guān)淋巴組織中扮演重要角色[42]。而在禽類中，F(xiàn)AE承擔(dān)了M細(xì)胞的功能，其表面分布一層由抗菌肽CATH-B1形成的保護(hù)性纖維網(wǎng)絡(luò)[43]，并表現(xiàn)出酶促反應(yīng)活性以及胞飲活性，它在識別抗原產(chǎn)生的IgA后對其進(jìn)行捕獲，并在法氏囊支持細(xì)胞的協(xié)助下，將抗原轉(zhuǎn)入髓質(zhì)，同時(shí)還能維持法氏囊內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。此外，在FAE內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了部分能夠表達(dá)定植刺激因子受體(Colony-stimulating factor 1 receptor，CSF1R)的細(xì)胞群[44]。與其余的FAE細(xì)胞不同，這群細(xì)胞僅能協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)一定大小的微顆粒(0.02～0.10 μm)，而無法轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)菌這類較大的物質(zhì)。有意思的是，在哺乳動(dòng)物中CSF1R僅表達(dá)于巨噬細(xì)胞內(nèi)[45]，然而法氏囊內(nèi)的巨噬細(xì)胞與FAE細(xì)胞具有不同的來源，這些具有CSF1R活性的FAE細(xì)胞，是否是為了刺激法氏囊褶皺上皮向FAE分化，亦或僅僅協(xié)助FAE完成抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)？隨著禽CSF1抗體的出現(xiàn)[46]，將有助于這些問題的解決。

2.2 囊素肽促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化

進(jìn)入法氏囊濾泡的B淋巴細(xì)胞前體，在class II MHC+(Major histocompatibility complex,主要相容性組織復(fù)合物)分泌樹突型細(xì)胞以及囊素肽的刺激下快速增殖。囊素肽是由法氏囊濾泡內(nèi)的網(wǎng)狀細(xì)胞分泌并局限于法氏囊濾泡內(nèi)的一系列多肽物質(zhì)[47]，是促進(jìn)B淋巴細(xì)胞成熟的重要因子。如表1所示，截至目前，已有大量的研究對法氏囊多肽物質(zhì)進(jìn)行鑒定。法氏囊囊素肽依據(jù)其氨基酸的序列進(jìn)行命名，可分為BP家族、BPP家族和BSP家族，但需注意由于氨基酸序列的差異會(huì)造成相同命名的囊素肽在生物學(xué)上的功能差異，如Bursin與BP3[48-49]，BSP與BP7[50-51]等。囊素三肽(Bursin)是從法氏囊中首先被分離到的活性肽物質(zhì)，它能有效刺激B淋巴細(xì)胞前體的分化[52]，并能作為法氏囊的信使促進(jìn)松果體生物合成活性[53]。BP家族包括BPI-IV，它們能夠促進(jìn)前體B細(xì)胞增殖，降低PU.1的表達(dá)水平[48]，BPIV還能促進(jìn)B細(xì)胞分化，提高特異性抗體的分泌水平[54]。BPP家族包括BPPI-VI，BPPI與BPPII能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，修飾T細(xì)胞免疫表型，并參與機(jī)體抗腫瘤信號通路[55-56]。而BPPIII-VI則是通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)從法氏囊提取物中得以分離，它們能夠促進(jìn)抗體與細(xì)胞因子分泌[57]。BSP家族包括BSPI與BSPII，BSPI能夠抑制MCF與Hela腫瘤細(xì)胞的增殖，并能增強(qiáng)抗腫瘤因子p53的轉(zhuǎn)錄活性與蛋白表達(dá)水平[51]。BSPII涉及多種免疫應(yīng)答，并與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)，且同樣能刺激p53的表達(dá)[58]。除此以外，后續(xù)的研究還鑒定出BP7、BP8、BP9、BP11以及Bursopentin。BP8可作為免疫調(diào)節(jié)劑參與B細(xì)胞的發(fā)育，并且由于它能夠激活A(yù)DH7與RDH10同維他命A結(jié)合蛋白的互作而調(diào)控維他命A在體內(nèi)與體外的汲取，因此BP8也是B細(xì)胞發(fā)育與維他命A代謝的重要樞紐[59]。BP9能夠提升抗體分泌水平，調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生與T細(xì)胞的激活，同時(shí)還與未成熟B細(xì)胞的自噬發(fā)生相關(guān)[54]。BP11能夠促進(jìn)前體B細(xì)胞的形成，并調(diào)控B細(xì)胞的分化，因此與禽免疫系統(tǒng)的發(fā)育高度相關(guān)[60]。Bursopentin也稱作BP5，它參與對法氏囊樹突細(xì)胞的修飾，包括抑制受脂多糖刺激的樹突細(xì)胞前體炎性因子與抗炎因子的分泌，并能逆轉(zhuǎn)樹突細(xì)胞的形態(tài)改變與表面分子標(biāo)記物的表達(dá)水平[61]，但同時(shí)BP5能夠保護(hù)受脂多糖刺激的樹突細(xì)胞免于氧化應(yīng)激的壓力[62]。而最新的研究表面，BP5能夠抑制癌細(xì)胞HCT116的增殖，它能通過上調(diào)p53與p21，并完全抑制E1-CDK2的表達(dá)而使細(xì)胞延滯在G1期，同時(shí)也能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[63]。BP7則是最新被分離到的法氏囊活性肽，它能夠刺激鼠源B細(xì)胞WEHI-231的自噬，并能調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，與其他法氏囊活性肽類似，BP7也能促進(jìn)抗體分泌以及由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[50]。

表1 法氏囊肽種類與功能Table 1 Types and function of peptide of bursa of fabric

在法氏囊內(nèi)成熟的B細(xì)胞在禽出生前不具備明確的方向性與功能性，只有當(dāng)它們從法氏囊遷移至其他外周免疫器官后，通過活化誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(Activation-induced cytidine deaminase,AID)介導(dǎo)的體細(xì)胞超突變(Somatic hypermutation)、類開關(guān)重組(Class switch recombination)以及基因轉(zhuǎn)換的形式才能實(shí)現(xiàn)B細(xì)胞功能的多樣化。而一些輔助因子也參與了這個(gè)過程，比如Bcl-6能介導(dǎo)B細(xì)胞的體細(xì)胞超突變與基因轉(zhuǎn)換[64]；絲氨酸/精氨酸富集蛋白1(Serine/arginine-rich protein，SRSF1)對于體細(xì)胞超突變的維持[65]。而一些由法氏囊濾泡分泌的因子，比如B細(xì)胞活化因子(B Cell-activating factor，BAFF)，也能以自分泌的形式刺激濾泡內(nèi)B細(xì)胞的增殖成熟，并能短暫抑制其在體外的凋亡發(fā)生[66]。

2.3 影響法氏囊免疫功能的因素

法氏囊結(jié)構(gòu)的改變會(huì)對法氏囊的免疫功能造成嚴(yán)重影響，包含2個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，首先是FAE結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致其無法限制淋巴細(xì)胞的溢出。其次是法氏囊濾泡的萎縮，致使其無法再為B淋巴細(xì)胞的增殖分化提供必要的微環(huán)境，而淋巴細(xì)胞的損耗則意味著法氏囊喪失了它作為免疫器官的功能。研究表明，目前廣泛流行并以法氏囊作為靶器官的病毒有傳染性法氏囊病病毒、新城疫病病毒(Newcastle disease virus,NDV)、馬立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)以及雞傳染性貧血病病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)。如表2所示，不同病毒對法氏囊的侵入與損傷存在差異，但這些病毒幾乎都能造成法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞的快速損耗以及法式氏囊濾泡結(jié)構(gòu)的損傷，導(dǎo)致法氏囊功能紊亂從而引起機(jī)體不同程度的免疫抑制。

表2 病毒對法氏囊免疫功能與結(jié)構(gòu)的影響Table 2 The effects of virus to immune function and structure of bursa of fabric

除了直接作用于法氏囊本身，一些病原微生物也可通過機(jī)體自身的免疫應(yīng)答，間接造成法氏囊免疫功能的紊亂。由NDV介導(dǎo)的HMGB1(High mobility group box 1)的釋放，會(huì)導(dǎo)致HMGB1與TLR2(Toll-like receptors2,TLR2)，TLR4((Toll-like receptors4,TLR4)以及RAGE(Receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)的互作而刺激NF-κB的激活從而促進(jìn)炎性因子的釋放，最終造成嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡與組織損傷[76]。禽類致病性大腸桿菌(Avian pathogenic escherichia coli,APEC)其外膜上的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)能夠刺激TLR4-MAPK-NF-κB信號通路的激活而引發(fā)炎癥，導(dǎo)致法氏囊B細(xì)胞表面受體的表達(dá)抑制，并造成法氏囊上皮結(jié)構(gòu)的完全毀滅以及淋巴細(xì)胞的凋亡從而導(dǎo)致法氏囊萎縮的發(fā)生[77]。

越來越多的研究表明，除病原微生物外，飼養(yǎng)過程中的一些應(yīng)激源也是法氏囊免疫功能紊亂的原因。氨是常見的毒性刺激氣體，雞吸入氨氣后會(huì)引發(fā)由NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并造成法氏囊器官指數(shù)的降低以及法氏囊濾泡結(jié)構(gòu)的損傷[78]。飼料中的一些添加物也會(huì)對法氏囊的免疫功能造成威脅，銅是一種必需的微量營養(yǎng)素，它是許多催化反應(yīng)中關(guān)鍵的輔助因子，而當(dāng)雞暴露于過量的銅與砷時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)法氏囊內(nèi)B細(xì)胞線粒體功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與自噬的發(fā)生[79]。由于肉雞對環(huán)境溫度高度敏感，因此熱應(yīng)激是家禽養(yǎng)殖業(yè)所面對的風(fēng)險(xiǎn)之一，熱應(yīng)激會(huì)造成肉雞法氏囊濾泡結(jié)構(gòu)的破壞，引起淋巴細(xì)胞的快速消耗造成機(jī)體的免疫抑制，增加傳染病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[80]。除此以外，對于禽類生長性狀的選育，也在一定程度上對法氏囊的發(fā)育與免疫功能造成影響[81]。

3 展 望

法氏囊退化的過程中存在一個(gè)有趣的現(xiàn)象，在性成熟的母雞群中只有開始產(chǎn)蛋的母雞，其法氏囊才會(huì)發(fā)生退化，表明法氏囊的退化與產(chǎn)蛋母雞開產(chǎn)日齡存在較強(qiáng)的相關(guān)性[82]，也提示禽生殖器官與免疫器官之間存在某種交流。器官與器官之間的交流已經(jīng)在骨骼肌中得以充分證明，當(dāng)骨骼肌受到刺激時(shí)(通常以運(yùn)動(dòng)為主)會(huì)釋放肌源性因子(Myokines)，肌源性因子作為肌肉與其他器官組織交流的中介，能夠影響機(jī)體脂肪沉積、骨骼發(fā)育以及大腦認(rèn)知等多個(gè)重要生物過程[83]。那么是哪些分子調(diào)控了其他器官組織與法氏囊的互作？得益于轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的普及與運(yùn)用，使得篩選這些分子的效率極大提高。Han等[84]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了烏骨雞與肉雞法氏囊由色素沉積差異導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞發(fā)育差異，共發(fā)現(xiàn)4 848個(gè)差異基因，其中326個(gè)非編碼基因與色素沉積、生長發(fā)育相關(guān)；Liu等[85]取SPF雞20胚齡與出生后2日齡的法氏囊，進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序而建立cicRNA文庫，從文庫中共發(fā)現(xiàn)由4 565個(gè)基因產(chǎn)生的13 689個(gè)circularRNA，其中有27個(gè)circularRNA在不同的發(fā)育時(shí)期表達(dá)存在差異，對這些差異circularRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要涉及代謝與發(fā)育功能。McCarthy等[86]利用蛋白組學(xué)技術(shù)對法氏囊B細(xì)胞的功能進(jìn)行注釋，揭示了42種此前未曾報(bào)道的對B細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控相關(guān)的因子，包括白細(xì)胞介素2(Interleukin 2)，Notch 1蛋白等。

雖然目前已挖掘出大量與法氏囊發(fā)育及免疫功能相關(guān)的候選基因，但后續(xù)的驗(yàn)證工作似乎成了新的難題。一方面，目前對禽候選基因的驗(yàn)證方式普遍以體外實(shí)驗(yàn)為主，但這種方式很難完全還原機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，這會(huì)造成驗(yàn)證結(jié)果出現(xiàn)偏差甚至完全相反，比如基因mRNA表達(dá)水平與其蛋白豐度之間不對稱性所反映出的機(jī)體對轉(zhuǎn)錄翻譯過程的精密調(diào)控[87]，卻很難在體外實(shí)驗(yàn)中得于復(fù)現(xiàn)。另一方面，現(xiàn)有技術(shù)水平一定程度上也制約了候選基因在禽體內(nèi)的驗(yàn)證，CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR associated protein 9 system)作為第三代基因編輯工具，因其高效、精確以及成本低廉的特性而應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)功能基因與表型的驗(yàn)證。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對雞體細(xì)胞(Somatic cell)與原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell,PGC)進(jìn)行編輯從而構(gòu)建轉(zhuǎn)基因雞是一種對候選基因驗(yàn)證的理想方式，但是有限的編輯策略、較低的編輯效率以及難以保證的后期存活率都制約了該技術(shù)在禽類中的應(yīng)用[88]。為解決這些問題，可行的方法包括編輯方式的優(yōu)化[90]、編輯組件的開發(fā)[90]或者從一個(gè)更精確的角度即從單個(gè)細(xì)胞的視角解析完整的生物過程。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)反映的是大量混合細(xì)胞的RNA平均變化情況，而單細(xì)胞RNA測序技術(shù)(Single-cell RNA-sequencing)作為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的革新，具有揭示單個(gè)細(xì)胞在生物過程中的屬性，能直接反映單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[91]，這將有助于對法氏囊發(fā)育與執(zhí)行免疫功能過程中關(guān)鍵細(xì)胞群體的定位，勢必會(huì)把法氏囊的研究帶入更深的層次。隨著對法氏囊免疫功能認(rèn)識的深入，可將法氏囊的某些參數(shù)作為抗病育種的選育指標(biāo)，以此加快選育進(jìn)程，也將成為今后相關(guān)新型疫苗開發(fā)的助力。