武小霞，郭雪田，王港慶，吳姍姍，常 丹，吳 博，石紅霞，歐陽慧，孫銘江，趙 瑩

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

土壤鹽漬化是全球性生態(tài)問題之一，產(chǎn)生的高鹽環(huán)境使植物受到傷害，如植物水分大量流失，植株葉片枯黃掉落，氣孔關(guān)閉，胞間CO2濃度下降致使光合作用降低等，影響植株正常生長[1]。我國鹽堿地分布廣泛，面積較大[2-3]。由于我國土地資源有限，各種非生產(chǎn)用地不斷增加，工業(yè)污染及環(huán)境惡化等因素導(dǎo)致可用耕地面積不斷下降。因此，篩選耐鹽植物品種資源是將鹽漬土地可用化的必要手段[4]。

近年來，我國科學(xué)家對農(nóng)作物耐鹽性開展大量研究，研究結(jié)果在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。張新草等比較大豆材料發(fā)芽期對鹽脅迫的響應(yīng)，將18份大豆材料劃分為耐逆性不同的5類[5]。李依等采用相關(guān)性分析、聚類分析法，綜合分析60 份豇豆品種資源，根據(jù)耐鹽綜合評價值（D 值）將60 份缸豆品種資源分成耐鹽敏感程度不同的3 類[6]。水培法是鹽處理研究常用方法，田小霞等使用此方法，從48 份紫花苜蓿材料中篩選11 份強(qiáng)耐鹽材料[7]。相對根長和相對莖葉干重可直觀表現(xiàn)植物生長狀態(tài)，陳楊等以此為根據(jù)，計算4個耐鹽性不同花生品種耐鹽系數(shù)，并鑒定花生苗期耐鹽性[8]。開展農(nóng)作物種質(zhì)資源耐鹽性鑒定，可有效篩選極端材料，對耐鹽品種選育具有指導(dǎo)意義。

本研究對大豆染色體片段代換系群體材料植株苗期作鹽脅迫處理，篩選優(yōu)異耐鹽材料，利用主成分分析、權(quán)重和隸屬函數(shù)等多種統(tǒng)計方法分析各株系不同指標(biāo)，最終計算得到耐鹽指數(shù)D 值，并綜合評價大豆耐鹽性，從而實(shí)現(xiàn)染色體片段代換系群體材料在非生物脅迫領(lǐng)域應(yīng)用的探索，為大豆耐鹽育種提供理論依據(jù)和材料支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所使用染色體片段代換系群體材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳改良團(tuán)隊構(gòu)建，于2006 年以野生大豆ZYD00006為供體親本，以黑龍江省大豆主栽品種綏農(nóng)14（SN14）為輪回親本，通過雜交、回交及自交構(gòu)建一套全基因組染色體片段代換系（Chromosome segment substitution lines，CSSLs）群體，下稱代換系[9]。本試驗(yàn)使用材料為183 份2019 年收獲代換系群體種子和165 份2020 年收獲代換系群體種子（2020年代換系群體由2019年收獲代換系種子播種所得，所選材料同屬一個代換系）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)于2020～2021年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳改良實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)前期使用不同濃度梯度Na?Cl 溶液對代換系群體作脅迫處理，篩選出適宜耐鹽性鑒定試驗(yàn)的NaCl 溶液濃度：使用0～240 mmol·L-1（梯度為60 mmol·L-1）NaCl 溶液對大豆代換系群體作鹽脅迫處理，調(diào)查株高、根長、地上鮮重和地下鮮重4 個指標(biāo)，NaCl 濃度為120 mmol·L-1時，大豆代換系群體材料間指標(biāo)差異明顯。因此，選擇120 mmol·L-1為適宜處理濃度開展后續(xù)研究。

試驗(yàn)采用水培法，以SN14 為對照，每份大豆代換系群體材料取40 粒種子放置于裝有蛭石的塑料盆（直徑25 cm，高6 cm）中發(fā)芽，發(fā)芽后移植40株到帶有打孔泡沫板（厚度1.5 cm）塑料盆中水培，海綿塊固定子葉下部莖稈插入打孔的泡沫板，每盆盛滿2 kg 蒸餾水，每盆種植一份材料共40 株，重復(fù)3 次。定植后，在晝夜溫度為（26±2）℃/（24±2）℃，光周期為12 h，相對濕度為75%溫室內(nèi)培養(yǎng)。蒸餾水培養(yǎng)至真葉展開時作鹽脅迫處理。

1.3 耐鹽指標(biāo)測定

大豆幼苗鹽脅迫處理時期為真葉期，每次重復(fù)挑選脅迫5 d后長勢均勻大豆植株20株，直尺測量其根長、株高（植株根莖部至頂部之間距離），稱量地上及地下鮮重，測量均在采集鮮活植株后完成。測量和稱重前需用水徹底清洗根部，并用濾紙吸去附著在幼苗表面水分，計算各項(xiàng)指標(biāo)相對值和耐鹽指數(shù)D值。

1.4 計算公式

①相對株高（Relative plant height，RPH）=處理株高/對照株高×100%；

②相對根長（Relative root length，RRL）=處理根長/對照根長×100%；

③相對地上鮮重（Relative ground fresh weight，RGFW）=處理地上鮮重/對照地上鮮重×100%；

④相對地下鮮重（Relative underground fresh weight，RUFW）=處理地下鮮重/對照地下鮮重×100%；

⑤隸屬函數(shù)分析R(Xj, i)=(Xj, i-Xj,min)/(Xj,max-Xj,min)，j=1，2，…，n；可將試驗(yàn)材料綜合指標(biāo)若干主成分值轉(zhuǎn)化為隸屬函數(shù)值。Xj，i表示第i個品種第j個主成分值，Xj,min表示第j個主成分最小值，Xj,max表示第j個主成分最大值。

⑥權(quán)重Wj=，j=1，2，…，n；wj表示第j個主成分在所有主成分中重要程度，即權(quán)重，Pj代表經(jīng)主成分分析所得第j個主成分貢獻(xiàn)率。

⑦耐鹽綜合評價D=，j=1，2，…，n；D 值為第i個大豆代換系株系在鹽脅迫條件下由綜合指標(biāo)評價所得耐鹽性綜合評價值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究采用Excel 2016軟件計算大豆代換系群體材料各指標(biāo)值平均數(shù)及相對值，使用SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)材料各項(xiàng)指標(biāo)分析主成分。利用主成分分析提取主成分，計算權(quán)重和隸屬函數(shù)值，最后利用各值計算耐鹽性綜合評價值。

2 結(jié)果與分析

2.1 代換系群體兩年表型數(shù)據(jù)分析

對代換系群體株高、根長、地上鮮重和地下鮮重4個形態(tài)指標(biāo)作數(shù)據(jù)統(tǒng)計，代換系群體株高和地下鮮重呈近似正態(tài)分布（見圖1）。2019年群體株高指標(biāo)平均值為13.52 cm，標(biāo)準(zhǔn)差為1.95，峰度為0.35，偏度為-0.28；2020 年群體株高指標(biāo)平均值為12.60 cm，標(biāo)準(zhǔn)差為2.36，峰度為-0.51，偏度為-0.34。2019 年群體根長指標(biāo)平均值為13.73 cm，標(biāo)準(zhǔn)差為2.07，峰度為-0.97，偏度為0.28；2020年群體根長指標(biāo)平均值為12.80 cm，標(biāo)準(zhǔn)差為1.84，峰度為-0.20，偏度為0.23。2019 年群體地上鮮重指標(biāo)平均值為0.47 g，標(biāo)準(zhǔn)差為0.18，峰度為0.63，偏度為0.79；2020年群體地上鮮重指標(biāo)平均值為0.69 g，標(biāo)準(zhǔn)差為0.21，峰度為0.66，偏度為0.79。2019 年群體地下鮮重指標(biāo)平均值為0.52 g，標(biāo)準(zhǔn)差為0.18，峰度為2.25，偏度為1.08；2020年群體地下鮮重指標(biāo)平均值為0.49 g，標(biāo)準(zhǔn)差為0.10，峰度為0.06，偏度為-0.06（見表1）。

表1 兩年代換系群體耐鹽形態(tài)指標(biāo)參數(shù)Table 1 Morphological parameters of salt tolerance of CSSLs population in two years

圖1 2019年和2020年代換系群體耐鹽指標(biāo)頻率分布Fig.1 Frequency distribution of salt tolerance index in CSSL population in 2019 and 2020

2.2 鹽脅迫條件下大豆代換系群體苗期性狀相關(guān)性分析

分析4 個形態(tài)指標(biāo)之間相關(guān)性，獲得相關(guān)矩陣。2019 年相對株高分別與相對根長、相對地下鮮重和相對地上鮮重呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.952、0.961和0.949），相對根長分別與相對地上鮮重和相對地下鮮重呈極顯著正相關(guān)（0.981和0.971），相對地下鮮重與相對地上鮮重呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.991）。2020 年相對株高分別與相對根長、相對地下鮮重和相對地上鮮重呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.970、0.980 和0.946），相對根長分別與相對地上鮮重和相對地下鮮重呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.983和0.985），相對地下鮮重與相對地上鮮重呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.974）。根據(jù)鹽脅迫下大豆苗期耐鹽性狀之間相關(guān)性可看出，性狀間均存在顯著相關(guān)性，僅通過觀察形態(tài)指標(biāo)無法篩選得到耐鹽材料，需綜合分析相關(guān)數(shù)據(jù)。

2.3 主成分分析和貢獻(xiàn)率

本研究在4個特征值中提取出特征值和貢獻(xiàn)率較大的兩個主成分（見表3）。2019年183份材料兩個主成分貢獻(xiàn)率分別為42.75%和29.87%，累積貢獻(xiàn)率為72.61%；2020 年165 份材料兩個主成分貢獻(xiàn)率分別為34.57%和32.50%，累積貢獻(xiàn)率為67.08%。主成分分析結(jié)果可有效反映數(shù)據(jù)情況，符合分析要求。

表3 兩年主成分特征值及貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of principal components in two years

2.4 隸屬函數(shù)分析、權(quán)重確定及綜合評價

鹽脅迫下，利用材料和方法中公式計算得到兩個主成分在2019 年和2020 年權(quán)重值分別為58.86%、41.14%和51.55%、48.45%，并分別計算兩年各綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值和綜合評價值D。計算2019年材料為183份和2020年材料為165份代換系材料綜合評價D值平均數(shù)，開展耐鹽強(qiáng)弱綜合排名（D值越大，則表示耐鹽能力強(qiáng)）。按照兩年綜合評價D 值平均數(shù)依次排名，選擇排名前7%和排名后8%材料，耐鹽能力排前12 試驗(yàn)材料為R26、R173、R115、R54、R21、R172、R35、R142、R150、R28、R193、R19；耐鹽能力排后13 供試材料 為R165、R97、R136、R185、R184、R154、R102、R8、R135、R101、R137、R208、R147。根據(jù)大豆苗期耐鹽性試驗(yàn)觀察結(jié)果，該結(jié)果與大豆代換系群體材料表現(xiàn)的實(shí)際耐鹽情況一致（見表4）。

表4 大豆苗期貢獻(xiàn)率，隸屬函數(shù)值及綜合評價值（D）Table 4 Contribution rate,membership function value and comprehensive evaluation value(D)of soybean at seedling stage

表2 兩年鹽脅迫下大豆各性狀相關(guān)性Table 2 Correlation of soybean characters under salt stress in two years

3 討論與結(jié)論

大部分作物在鹽漬土地上無法正常生長，造成土地資源浪費(fèi)[10]。大豆是一種中度耐鹽作物，但鹽濃度超過55 mmol·L-1時，產(chǎn)量和品質(zhì)降低，土地鹽漬化影響大豆生產(chǎn)[11-12]。

牛遠(yuǎn)等研究表明，無論是大豆幼苗期還是其他生長階段，其對鹽脅迫表現(xiàn)高度一致，大豆幼苗植株受鹽脅迫后，鹽分通過滲透脅迫、離子毒害和同化物積累抑制等途徑降低光合效率，抑制植株莖葉部分和根系生長，導(dǎo)致葉片脫水收縮[13]。本研究采用120 mmol·L-1NaCl 濃度處理大豆染色體片段代換系材料，發(fā)現(xiàn)大豆幼苗株高、根長、地上鮮重和地下鮮重積累均減少，綜合分析所篩選代換系群體中12 份材料為耐鹽材料。水培法是鹽處理試驗(yàn)常用方法，該方法操作簡便，易實(shí)現(xiàn)對實(shí)驗(yàn)條件的局部控制，且易重復(fù)、實(shí)驗(yàn)試劑毒性危害小[14]，王春語等使用水培法對636份高粱資源材料作鹽脅迫處理，根據(jù)高粱抽穗期株高表現(xiàn)，篩選出耐鹽和鹽敏感材料共計16 份[15]。除水培法外，沙土水溶液培養(yǎng)法也可有效開展鹽處理試驗(yàn)。柏錫等采用沙土水溶液培養(yǎng)方法，成功建立轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性鑒定體系[16]。

觀察大豆染色體片段代換系群體株高和根長，同時比較其地上和地下鮮重發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)間相互交叉的相關(guān)性對數(shù)據(jù)產(chǎn)生屏蔽效應(yīng)。大豆耐鹽性是無法直接通過形態(tài)指標(biāo)觀察作評價的復(fù)雜性狀。因此本研究使用多元分析方法，包括方差分析、相關(guān)性分析、主成分分析、權(quán)重分析和隸屬函數(shù)分析作綜合評價大豆耐鹽性。成分分析表明，從大豆鹽脅迫處理幼苗期4個形態(tài)指標(biāo)中提取兩個代表性主成分，并結(jié)合隸屬函數(shù)和權(quán)重，確定耐鹽性綜合評價D值，完成對染色體片段代換系材料耐鹽性篩選。

本研究選用試驗(yàn)材料為大豆染色體片段代換系群體是對野生大豆資源的利用。野生大豆抗逆性較強(qiáng)，適應(yīng)能力也較強(qiáng)，耐鹽性較好，為培育耐鹽材料提供基礎(chǔ)[17]。Qi等采用野生大豆和栽培大豆重組自交系（RIL），利用全基因組測序作種子抗逆性等性狀主效QTL 定位分析，發(fā)現(xiàn)耐鹽關(guān)鍵基因GmCHX1[18]。王臻昱等從野大豆鹽堿脅迫基因表達(dá)譜中篩選并克隆得到GsGST19基因[19]。以上研究揭示野生大豆在馴化過程中的變異和進(jìn)化規(guī)律，為今后進(jìn)一步精細(xì)解析野生大豆耐逆機(jī)理提供理論依據(jù)。