喬 幸，安 然，陳娜娜，韋世豪，朱彥濤，陳 靜，張彥鋒*，穆建新*

（1.陜西省雜交油菜研究中心，陜西楊凌 712100；2.綿陽市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川綿陽 621010）

當(dāng)前，我國食用植物油供不應(yīng)求、嚴(yán)重依賴進(jìn)口。甘藍(lán)型油菜作為我國主要的油料作物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。開花是植物從營養(yǎng)生長進(jìn)入生殖生長的重要階段，油菜經(jīng)過春化處理才能開花成熟，開花的早晚與早熟性密切相關(guān)。開花性狀由復(fù)雜的多基因控制，擬南芥已經(jīng)報(bào)道的與開花相關(guān)的基因有120多個(gè)，并且控制開花的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也逐漸明[1]。FLC和FRI是開花途徑中2個(gè)關(guān)鍵基因，F(xiàn)LC基因編碼MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，是開花時(shí)間抑制因子[2]。FRI通過促進(jìn)FLC的表達(dá)可抑制油菜開花[3]。對甘藍(lán)型油菜的5個(gè)FLC同源基因（BnFLC1-BnFLC5）在擬南芥中分別進(jìn)行過量表達(dá)，結(jié)果顯示BnFLC1-BnFLC5都能延遲擬南芥開花，BnFLC1、BnFLC2和BnFLC3抑制開花的程度明顯高于BnFLC4和BnFLC5[4]。甘藍(lán)型油菜有4個(gè)FRI同源基因，分別是Bna A3.FRI、Bna A10.FRI、Bna C3.FRI和 Bna C9.FRI，其中Bna A3.FRI與N3連鎖群上效應(yīng)最大的QTL共定位，因此Bna A3.FRI是控制甘藍(lán)型油菜開花期的主要因子之一[5]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，能夠?qū)Π邢蚧蜻M(jìn)行精準(zhǔn)敲除、序列替換和定點(diǎn)突變，快速創(chuàng)制目標(biāo)突變體，已成為作物種質(zhì)資源創(chuàng)制的重要手段。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在擬南芥、煙草、水稻、高粱和小麥等農(nóng)作物中成功應(yīng)用[6-10]，在油菜中也已有報(bào)道[11-12]。

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯同時(shí)敲除甘藍(lán)型油菜BnaFLC和BnaFRI，成功創(chuàng)制了BnaFLC和BnaFRI多基因敲除的油菜早熟突變體，該突變體不需春化，從播種到開花只需59 d，表現(xiàn)出明顯極早熟特征。該研究結(jié)果為早熟材料的創(chuàng)制探索了一條新的途徑，為進(jìn)一步研究早熟性狀調(diào)控機(jī)理以及油菜早熟育種創(chuàng)制了寶貴的種質(zhì)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.，2n=38，AACC）半冬性品種浙油50（浙江省農(nóng)科院培育）。

1.2 方法

1.2.1 BnFLC及BnFRI基因敲除靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)

利用CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（CRISPR DESINGER），結(jié)合 Brassicadatabase（http://brassicadb.org/brad/）和NCBI提供的序列信息，對甘藍(lán)油菜基因BnFLC和BnFRI分別進(jìn)行比對分析，分別設(shè)計(jì)FLC和FRI的靶位點(diǎn)。

1.2.2 載體的構(gòu)建

CRISPR/Cas9基因編輯載體pHSE401由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍教授提供，構(gòu)建方法詳見參考文獻(xiàn)[13]，油菜FLC和FRI基因靶向位點(diǎn)引物序列見表1。

表1 油菜FLC和FRI基因靶向位點(diǎn)引物序列Table 1 Primer sequences for targeting sites of BnFRI and BnFLC genes in Brassica napus

1.2.3 甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化

浙油50種子用75%乙醇消毒1 min，加入15%次氯酸鈉（200 mL次氯酸鈉加入吐溫 200 μL），消毒15 min。ddH2O漂洗4～5次，點(diǎn)播于1/2 MS培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)5～7 d。切取8～10 mm左右的下胚軸作為外植體，用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液（OD=0.4～0.6）浸染外植體15 min，在M1培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d，轉(zhuǎn)入潮霉素（濃度50 mg/mL）M2培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，再轉(zhuǎn)入潮霉素（濃度50 mg/mL）M3培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，切取幼芽，轉(zhuǎn)入M4生根培養(yǎng)基，生根后移入基質(zhì)培養(yǎng)，煉苗后轉(zhuǎn)至氣候室繼續(xù)培養(yǎng)，收獲種子。

1.2.4 陽性植株靶位點(diǎn)檢測

選取具有明顯早花表型的基因編輯植株提取DNA（SDS法），用載體序列特異性擴(kuò)增引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all（表2）進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化真實(shí)性檢測。

1.2.5 CRISPR/Cas9敲除位點(diǎn)檢測

分別設(shè)計(jì)BnaFLC和BnaFRI靶位點(diǎn)側(cè)翼特異引物（表2），PCR擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)的目標(biāo)序列，構(gòu)建克隆載體，測序，解析早花材料BnaFLC和BnaFRI基因的突變位點(diǎn)。

表2 CRISPR/Cas9敲除位點(diǎn)檢測引物Table 2 Detection primers of CRISPR/Cas9 knockout sites

1.2.6 T1代植株靶位點(diǎn)檢測

將基因敲除后的早熟表型植株套袋自交，提取子代明顯早花植株的DNA，用載體序列特異性擴(kuò)增引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all篩選不含轉(zhuǎn)基因成分的植株，并用含有靶位點(diǎn)的目標(biāo)序列引物（表2），檢測靶位點(diǎn)突變序列，以確定具有非轉(zhuǎn)基因特性的早熟性狀的突變材料，用于后續(xù)早熟油菜品種的培育。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)及載體的構(gòu)建

2.1.1 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

對比已公布的甘藍(lán)油菜基因BnFLC和BnFRI基因序列，利用在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，選擇BnFLC基因上3個(gè)靶點(diǎn)，BnFRI基因上4個(gè)靶點(diǎn)。

BnFLC基因在甘藍(lán)型油菜中有9個(gè)拷貝，分別位于 A2（BnaA02g00370D）、A3（BnaA03g02820D、BnaA03g13630D）、A10（BnaA10g22080D）、C2（BnaC0-2g00490D）、C3（BnaC03g04170D、BnaC03g16530D）和 C9（BnaC09g46500D、BnaC09g46540D）染色體上。設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)T1位于BnFLC基因A2或C2染色體的第6個(gè)外顯子區(qū)域，可以同時(shí)編輯A2和C2染色體的2個(gè)同源拷貝。靶位點(diǎn)T2位于BnFLC基因A10或C9染色體的第1個(gè)外顯子區(qū)域，可以同時(shí)編輯A10和C9染色體的3個(gè)同源拷貝。靶位點(diǎn)T3位于BnFLC基因A10或C9染色體的第3個(gè)外顯子區(qū)域，可以同時(shí)編輯A10和C9染色體的3個(gè)同源拷貝（圖1）。

圖1 甘藍(lán)型油菜BnFLC和BnFRI基因敲除位置信息圖Figure 1 BnFLC and BnFRI knockout location

BnFRI基因在甘藍(lán)型油菜中有4個(gè)同源基因，分別位于 A3（BnaA03g13320D）、A10（BnaA10g058-50D）、C3（BnaC03g16130D）和 C9（BnaC09g27290D）染色體上。設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)T4和T5位于BnFRI基因A3或C3染色體的第1個(gè)外顯子區(qū)域，可以同時(shí)編輯A3和C3染色體的2個(gè)同源拷貝。靶位點(diǎn)T6位于BnFRI基因A3或C3染色體的第3個(gè)外顯子區(qū)域，可以同時(shí)編輯A3和C3染色體的2個(gè)同源拷貝。靶位點(diǎn)T7位于BnFRI基因A10或C9染色體的第1個(gè)外顯子區(qū)域，可以同時(shí)編輯A10和C9染色體的2個(gè)同源拷貝（圖1）。

靶位點(diǎn)T6、T7（表1）為BnFRI基因的單靶點(diǎn)，為提高靶點(diǎn)效率，設(shè)計(jì)5個(gè)雙靶位點(diǎn)，可以同時(shí)敲除BnFRI和 BnFLC 2 個(gè)基因，分別是 T2+T5、T1+T4、T1+T6、T3+T4和T1+T5（表1），具體靶位點(diǎn)序列見表 1。

2.2 油菜陽性植株靶位點(diǎn)檢測

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染甘藍(lán)型油菜下胚軸，獲得一株具有明顯早熟表型的植株GM13，該陽性植株比正常植株（浙油50）提早抽薹，提早開花40 d左右。利用靶點(diǎn)檢測引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all（表2）進(jìn)行PCR檢測，獲得500 bp的單靶點(diǎn)陽性片段以及1 000 bp的雙靶點(diǎn)陽性片段，驗(yàn)證早熟植株GM13被成功轉(zhuǎn)化。陽性片段克隆測序，對比靶位點(diǎn)序列。驗(yàn)證該植株靶位點(diǎn)T1-T7（表1）均被成功轉(zhuǎn)化。

2.3 陽性轉(zhuǎn)化苗靶位點(diǎn)編輯結(jié)果檢測

擴(kuò)增陽性植株靶位點(diǎn)所在區(qū)域片段，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序分析，發(fā)現(xiàn)所有靶位點(diǎn)T1-T7中，BnaFLC基因中存在2種編輯情況，即BnaFLCA2（BnaA02g00370D）染色體的靶位點(diǎn)T1存在一個(gè)堿基C的插入；C2染色體缺失7個(gè)堿基（AAGAGAA）；BnaFRI基因中存在1種編輯情況，即C9染色體的T7靶位點(diǎn)有一個(gè)堿基T的插入，其余靶位點(diǎn)均未被編輯（表3）。

表3 CRISPR/Cas9敲除結(jié)果Table 3 Result of CRISPR/Cas9 knockout

2.4 T1代植株的突變是否可穩(wěn)定遺傳

早熟表型植株GM13的T1代植株與對照浙油50相比（圖2），有明顯早熟性狀，表現(xiàn)為提早抽薹開花。選取3株T1代植株提取植物DNA為擴(kuò)增模板，首先用載體序列特異性擴(kuò)增引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all篩選不含轉(zhuǎn)基因成分的植株，再對每個(gè)T1代株系PCR擴(kuò)增后送2個(gè)克隆測序，結(jié)果表明T1代植株的編輯位點(diǎn)序列與T0代植株的靶位點(diǎn)編輯情況完全一致（表4）。表明突變位點(diǎn)可穩(wěn)定遺傳到下一代。

圖2 基因編輯早熟材料T1代植株與ZY50開花時(shí)間比較Figure 2 Flowering time of T1 generation plants compared to ZY50

表4 T1代植株突變位點(diǎn)情況Table 4 Result of CRISPR/Cas9 knockout in T1 generation plants

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)基因編輯可以對基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾和定點(diǎn)突變，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻、玉米和煙草中，目前在油菜中已有報(bào)道利用該技術(shù)創(chuàng)制高油酸甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)[14]、創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜多室突變體[15]。甘藍(lán)型油菜為異源多倍體植物，基因組高度重復(fù)，基因存在多個(gè)拷貝，但拷貝之間又不完全相同，基因定向編輯難度較二倍體植物高，雖然轉(zhuǎn)基因陽性率可以高達(dá)92.5%，但多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9的T0代突變效率為12.9%～59.5%，單靶點(diǎn)平均編輯效率為6.5%～14.9%[15]。高謝旺等[14]對兩個(gè)高油酸基因BnaFAD2和BnaFAE1進(jìn)行基因編輯，T0代均未發(fā)生基因編輯，在T1代檢測到了編輯的發(fā)生。本研究設(shè)計(jì)的7個(gè)靶位點(diǎn)均被成功轉(zhuǎn)化，但T0代被成功編輯的靶位點(diǎn)僅有2個(gè)。說明基因編輯在多倍體植物中效率不高，如果采取單個(gè)靶點(diǎn)遺傳轉(zhuǎn)化，鑒定工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為提高基因轉(zhuǎn)化效率和編輯效率，獲得基因編輯的早花甘藍(lán)型油菜材料，我們在遺傳轉(zhuǎn)化中將含有多個(gè)靶位點(diǎn)的載體混合遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后獲得表型植株再檢測驗(yàn)證植株靶位點(diǎn)的編輯情況，通過表型篩選植株減少了直接鑒定陽性植株的盲目性并且更加可靠。

FLC和FRI是油菜春化途徑的兩個(gè)關(guān)鍵基因，甘藍(lán)型油菜中的9個(gè)FLC同源基因中，BnaFLC.-A02、BnaFLC.C02、BnaFLC.A10 與油菜早晚熟開花有密切關(guān)系。代書桃[16]將BnFLC.A10基因轉(zhuǎn)入春油菜品種Westar，發(fā)現(xiàn)在春油菜環(huán)境或者無春化處理?xiàng)l件下陽性株系花期延遲。魏大勇[17]對甘藍(lán)型油菜開花期進(jìn)行了GWAS分析，檢測到位于A02染色體上的已知開花基因BnaA02g00370D在冬性油菜和春性油菜中表達(dá)量差異達(dá)到極顯著水平。陳磊[18]通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)BnFLC.A2導(dǎo)致雙親材料開花期差異，BnFLC.C2導(dǎo)致晚花親本R15和早花親本R11開花期差異，因此BnFLC.A2和BnFLC.C2基因在花期調(diào)控中起著重要的作用。本研究中FLC基因位于染色體A10和C9的同源基因并未編輯成功，而A2、C2染色體上的同源基因均被成功編輯，推測相較BnaFLC.A10和BnaFLC.C9，BnaFLC.-A02、BnaFLC.C02是影響開花時(shí)間的主要因子。

FRI是FLC上游調(diào)控因子，促進(jìn)FLC基因的表達(dá)以此來抑制開花，甘藍(lán)型油菜中分離的4個(gè)FRI同源基因中[5]，BnaA3.FRI可能是決定油菜春化的主要因子，其余3個(gè)基因與甘藍(lán)型油菜春化以及開花的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究[19]。本研究中，F(xiàn)RI基因C9的堿基T插入，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化及基因功能突變，但該反應(yīng)對開花的影響有待于進(jìn)一步剖析。T1代植株1中，雖未檢測到BnFRI基因靶位點(diǎn)被編輯，但植株具有明顯的早熟性狀，相比對照浙油50早抽薹，早開花。這可能是由于T1代的克隆測序程度不夠，或BnFLC基因靶位點(diǎn)被編輯后對早熟性狀的貢獻(xiàn)更大導(dǎo)致的。