呂中睿，劉宏，張國昀，于立洋，羅紅梅，何彩云＊

(1.國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實驗中心，內(nèi)蒙古 磴口 015200)

沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)屬胡頹子科多年生落葉灌木、小喬木或喬木[1]，原產(chǎn)于俄羅斯、中國和北歐[2]。沙棘營養(yǎng)極高，富含維生素、類胡蘿卜素、脂類、甾醇和類黃酮[3]。類黃酮是植物最主要的次生代謝物之一[4]，在沙棘葉和果實中大量存在，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗氧化等多種生理活性[5]，在食藥保健領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。類黃酮在沙棘中通常以糖基衍生物的形式出現(xiàn)[6]，Teleszko 等研究發(fā)現(xiàn)，黃酮醇糖苷是沙棘中最豐富的酚類化合物[7]。然而，類黃酮在沙棘中的糖基化作用機理仍不清楚。

糖基化修飾是類黃酮生物合成的關(guān)鍵修飾之一，這種修飾促進類黃酮的溶解性、穩(wěn)定性和生物活性，以防御和適應(yīng)環(huán)境變化[8]。植物次生代謝物的糖基化是由UDP 糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT,UDPglycosyltransferase)催化的[9]，可以催化糖基加到底物的特定位置或特定區(qū)域。植物中UGT 基因長度約為1 000～1 500 bp，UGT 基因在植物中保守性較強，尤其在終止密碼子附近有一段編碼44 個氨基酸的極強保守序列，稱為PSPG box[10]，可以作為挑選UGT 基因的依據(jù)。作為模式植物，擬南芥UGT 家族最早被研究，Li 等發(fā)現(xiàn)，擬南芥中共有107 個成員，根據(jù)序列同源性被劃分為 14 個系統(tǒng)發(fā)育組，命名為A-N[11]。隨后，在毛果楊、玉米、葡萄、蘋果和茶等植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了O、P、Q和 R組[12-13]。近期，Wilson 等分析了65 個全序列的植物基因組，應(yīng)用嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來選擇候選的UGTs，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，重建了被子植物原有的18 個系統(tǒng)發(fā)育組（A-R）和OG[14]。在高等植物的進化過程中，A、D、E、G 和L 這5 個組群擴展較快，E組擴展最快，不同物種中E組中的基因占UGT 家族的 20%～25%[15]。

迄今，多個物種中的數(shù)百個UGT 基因已經(jīng)被克隆出來，并對其功能進行了表征。如Lim 等以槲皮素為底物，對擬南芥中91 個糖基轉(zhuǎn)移酶進行了鑒定，其中，29 個能夠催化相關(guān)的糖基化反應(yīng)[16]。Trapero 等對番紅花中糖基轉(zhuǎn)移酶功能驗證發(fā)現(xiàn)，UGT707B1 可以催化山奈酚、槲皮素生成相應(yīng)的糖苷衍生物[17]。然而，與植物基因組中UGT 基因龐大的數(shù)量相比，功能被驗證的特征蛋白的數(shù)量仍然相對較低[15]。

本研究基于沙棘基因組信息，對UGT 基因家族進行了鑒定和分析，共鑒定到89 個沙棘UGT 基因成員，劃分為16 個系統(tǒng)發(fā)育分組。本研究對沙棘UGT 基因家族的蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)和基因復(fù)制進行了預(yù)測分析。在此基礎(chǔ)上，分析了UGT 基因在沙棘果實不同發(fā)育時期的表達(dá)模式，并通過實時熒光定量PCR 進行驗證，對日后解析沙棘類黃酮糖苷生物合成機制及其積累模式奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 沙棘UGT 基因家族的鑒定

113 條擬南芥UGT 氨基酸序列下載自擬南芥基因組網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org/），UGT基因家族保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾科夫模型HMM 文件（PF00201，UDPGT.HMM）下載自Pfam（http://pfam.xfam.org/）。首先以擬南芥UGT 氨基酸序列作為query 序列，使用BLASTP 程序搜索沙棘基因組蛋白數(shù)據(jù)庫（未發(fā)表），evalue=1 e?15，構(gòu)建沙棘候選UGT 數(shù)據(jù)集1。通過HMM 文件對沙棘基因組蛋白數(shù)據(jù)庫進行hmmsearch 搜索，evalue=1 e?20，提取結(jié)果文件中比對一致的序列通過hmmbuild程序構(gòu)建沙棘UGT 保守結(jié)構(gòu)域隱馬爾科夫模型，并再次進行hmmsearch，構(gòu)建沙棘候選UGT 數(shù)據(jù)集2。合并2 個數(shù)據(jù)集，提交至CDD、Pfam 和SMART 數(shù)據(jù)庫驗證保守結(jié)構(gòu)域，然后手動刪除氨基酸序列小于250 aa 和PSPG box 不完整的序列。

1.2 UGT 基因家族理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析

利用Expasy server 的ProtParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）計算沙棘中各UGT 蛋白的分子量、氨基酸長度和等電點。使用DeepLoc（http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）預(yù)測沙棘UGT 蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過MUSCLE 對沙棘UGT 蛋白序列進行多重序列比對（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/），刪除gap 區(qū)域。利用MEGA 7.0 軟件，基于比對后的UGT 蛋白序列，采用neighbor-joining 法，設(shè)置bootstrap 值為1000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.4 保守序列和基因結(jié)構(gòu)分析

通過GSDS 在線工具(v2.0 http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)，輸入沙棘基因注釋GFF 文件，將沙棘UGT 的編碼序列與其對應(yīng)的基因組序列進行比較，展示沙棘UGT 的外顯子內(nèi)含子信息。為了比較沙棘UGT 的差異，本研究利用MEME 在線工具對沙棘UGT 蛋白的保守基序進行分析，參數(shù)設(shè)置為：site distribution:zero or one occurrence (of a contributing motif site) per sequence,maximum number of motifs:10,and optimum motif width ≥ 6 and ≤ 60。

1.5 染色體定位和基因復(fù)制分析

通過自建腳本，從沙棘基因組注釋文件中提取沙棘UGT 位置信息。使用MCScanX 軟件分析基因加倍事件。染色體定位和基因加倍信息通過Circos 軟件繪圖展示。

1.6 表達(dá)模式分析

2 個沙棘亞種（中國沙棘，“FN”；蒙古沙棘，“XY”）不同果實發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自沙棘基因組數(shù)據(jù)庫，使用每百萬映射reads 的千堿基片段（FPKM）來估計表達(dá)水平。利用TBtools軟件對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化和聚類，并繪制表達(dá)量熱圖[19]。

實時熒光定量PCR 分析所用樣品為中國林業(yè)科學(xué)研究院沙漠林業(yè)實驗中心種植的蒙古沙棘花后21、63、91 d 果實，每批樣品設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，采樣后迅速使用液氮速凍，并置于?80℃?zhèn)溆??？俁NA 的提取采用天根公司RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，參照使用說明書的方法進行提取。反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TAKARA 公司的PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit，并按照使用說明進行。用primer Premier 5.0 軟件對選定的9 個HrUGTs 進行特異性引物設(shè)計，引物信息見表1。實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系按照TAKARA公司TB Green?Premix Ex Taq ? II 試劑盒使用說明書配置，PCR 反應(yīng)程序為：95℃ 30 s 預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)擴增。使用2?ΔΔCT法計算HrUGT 基因的相對表達(dá)水平[20]，使用Origin 8.0 軟件作圖。

表1 實時熒光定量PCR 引物信息表Table 1 The primer sequence for quantitative real-time PCR (RT-qPCR)

2 結(jié)果分析

2.1 沙棘UGT 基因家族成員鑒定

對利用BLASTP 和hmmsearch 兩種方法搜索沙棘基因組蛋白數(shù)據(jù)庫獲得的110 個候選沙棘UGT 基因成員，經(jīng)過驗證保守結(jié)構(gòu)域和手動篩選，共鑒定出89 個沙棘UGT 基因。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）表明：沙棘UGT 家族各成員蛋白質(zhì)長度為266～533 aa，平均長度462 aa，蛋白理論分子量平均值為52.00 KDa，平均等電點5.89。82 個沙棘UGT 家族成員定位于細(xì)胞質(zhì)，6 個成員定位于線粒體，1 個成員定位于質(zhì)體。

表2 沙棘UGT 基因家族成員信息 Table 2 The information of HrUGTs

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于蛋白同源序列的相似性進行功能預(yù)測是基因功能研究的重要手段，本研究以沙棘和擬南芥、玉米、山柳蘭等植物UGT 蛋白序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。圖1 表明：89 個沙棘UGT 可被聚類為16 個先前鑒定的類群[13]，沙棘UGT 在O組和Q組均沒有分布，大部分沙棘UGT 聚集在E（8）、G（8）、D（11）、L（16）和A（17）組。多序列比對分析表明：89 個沙棘UGT 的C 端序列均存在PSPG box，并在 1（W）、4（Q）、8（L）、10（H）、12（S/A）、14（G）、16（F）、19-24（HCGWNS）、27（E）、32-34（GVP）、39（P）、43（D/E）、44（Q）位點高度保守。

圖1 沙棘、擬南芥、玉米和山柳蘭UGT 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of UGT proteins of sea buckthorn,Arabidopsis,maize and mouse-ear hawkweed

2.3 蛋白基序和基因結(jié)構(gòu)分析

為了進一步確定沙棘UGT 家族的保守結(jié)構(gòu)域特征，利用在線工具MEME 創(chuàng)建了10 個基序，并從1 到10 列出（圖2）?；? 和基序3為UGT 家族保守結(jié)構(gòu)域PSPG box。La4g1035、La5g0208、La11g1107、La5g1327、La4g1118、La10g1561 和La10g1574 由于1 或2 個氨基酸的插入并沒有匹配到基序3，在后續(xù)的分析中發(fā)現(xiàn)，這些基因除La5g0208 外均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)或表達(dá)量極低。A組和R組成員均未發(fā)現(xiàn)基序9 的存在，這一基序中3 個氨基酸（GSS）之前被認(rèn)為在單糖基轉(zhuǎn)移酶中高度保守[21]。

圖2 沙棘UGT 家族基因蛋白基序及基因結(jié)構(gòu)的構(gòu)建Fig.2 Gene structure and architecture of conserved protein motifs in UGT family genes of sea buckthorn

內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)的多樣性通常在基因家族的進化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并為支持系統(tǒng)發(fā)育類群提供了額外的證據(jù)[22]。為了進一步了解基因結(jié)構(gòu)，對沙棘UGT 的內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)進行了分析。在本研究鑒定的89 個UGT 基因中，45 個UGT 基因含有內(nèi)含子(50.6%)，其中，40 個UGT 基因有1 個內(nèi)含子，5 個UGT 有2 個內(nèi)含子。G組、P組和F組成員大多具有較長的內(nèi)含子插入。M組、B組和R組成員均不含內(nèi)含子。

2.4 染色體定位和基因復(fù)制分析

在鑒定出的89 個沙棘UGT 中，84 個UGT 被定位于沙棘染色體上。圖3 表明：在12 條沙棘染色體中，只有11 條沙棘染色體包含UGT 基因。11 號染色體包含最多的共13 個UGT 家族成員，而7 號染色體中沒有UGT 基因存在。12 號染色體含有12 個UGT 基因，10 號染色體包含11 個UGT基因，4 號、8 號和9 號染色體均只含3 個UGT 基因。沙棘UGT 基因在染色體上的這種不平衡分布，說明沙棘在進化過程中存在遺傳變異。

為了揭示沙棘UGT 基因家族的擴展和進化機制，對沙棘基因組中潛在的基因復(fù)制事件進行了分析。本研究利用MCScanX 軟件基于氨基酸序列同源性在沙棘全基因組內(nèi)進行了比對，發(fā)現(xiàn)UGT 基因家族成員中存在12 個串聯(lián)重復(fù)基因簇和11 個共線基因?qū)Γ▓D3），這一結(jié)果表明，串聯(lián)重復(fù)是導(dǎo)致沙棘UGT 基因家族擴張的主要復(fù)制事件。本研究計算了復(fù)制基因間的Ka 和Ks 值，其比值均小于1，說明UGT 基因在進化過程中受到純化選擇。

圖3 沙棘UGT 基因的染色體分布和基因重復(fù)Fig.3 Chromosomal distribution and gene duplications of the HrUGTs

2.5 沙棘UGT 基因在果實不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

本研究利用兩個沙棘亞種果實3 個發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，來進一步了解沙棘UGT 基因的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：沙棘各UGT 在種間和時間上的表達(dá)表現(xiàn)出顯著差異（圖4）。La10g1046，La10g2527和La3g0035 只在中國沙棘果實中微量表達(dá)，在蒙古沙棘果實中不表達(dá)。La2g0165，La3g0199 和La1g2297 則表現(xiàn)相反；而La9g0469 在蒙古沙棘果實中高表達(dá)，在中國沙棘中不表達(dá)。La5g0668在兩個亞種不同發(fā)育時期均高表達(dá)。La11g2592、HrUGT0002、La12g1442 等基因在兩個亞種果實中表達(dá)較高且隨著果實發(fā)育表達(dá)量逐漸升高。大多數(shù)UGT 基因主要在果實發(fā)育的前期或中期表達(dá)量較高，而在果實發(fā)育后期表達(dá)量降低。

圖4 沙棘UGT 基因在兩個亞種不同發(fā)育時期的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiles of HrUGTs in various developmental stages of two sea buckthorn subspecies

從沙棘UGT 基因所處的系統(tǒng)發(fā)育分組看，A組中，La5g0208 和La12g2361 兩個基因表達(dá)水平相對較高，且均隨果實發(fā)育表達(dá)量逐漸降低。相似的，La5g0951 只在果實發(fā)育初期表達(dá)，而在果實發(fā)育的中到后期均不表達(dá)。C組中，La11g1107在兩個沙棘亞種果實中均不表達(dá)，而La12g1442 在兩個沙棘中表達(dá)量相對較高且主要在果實發(fā)育的中后期表達(dá)。D組和E組均包含較多的沙棘UGT 基因家族成員，但兩組基因的表達(dá)模式卻有著巨大差異。在D組中，除La2g1189 外，其他10 個基因在中國沙棘中均不表達(dá)，這些基因在蒙古沙棘果實中的表達(dá)水平也相對較低甚至不表達(dá)。而在E組中，除La9g0469 在中國沙棘果實中不表達(dá)，其余基因在兩個沙棘亞種果實中均有一定程度的表達(dá)。La11g0447 和La11g0570 在兩個沙棘亞種果實中表達(dá)量相對較高，La11g0447 在蒙古沙棘中表達(dá)量隨著果實發(fā)育先升高后降低，而在中國沙棘中表現(xiàn)出相反的趨勢；La11g0570 在中國沙棘中隨著果實發(fā)育表達(dá)量逐漸降低，而在蒙古沙棘果實中的表達(dá)水平先小幅升高，在果實成熟時下降到較低水平。F組成員在沙棘果實中除前期有少量表達(dá)外，其余時期表達(dá)水平較低或不表達(dá)。G組中，La12g0737表達(dá)量整體較高，在兩個沙棘亞種果實中均表現(xiàn)為隨著果實發(fā)育表達(dá)量先升高后降低；La2g2279 在中國沙棘果實中有著較高的表達(dá)水平，且隨著果實發(fā)育表達(dá)量逐漸升高，而在蒙古沙棘果實發(fā)育末期表達(dá)量下降到較低水平。L組中，La10g1081 和La10g1082 均在果實發(fā)育中期表達(dá)量較高，且蒙古沙棘高于中國沙棘；HrUGT0002 隨著果實發(fā)育表達(dá)量逐漸增加，且與發(fā)育初期相比HrUGT0002 在蒙古沙棘果實成熟期的表達(dá)水平提高了16.7 倍，而在中國沙棘中達(dá)到了25 倍。J組和R組中的沙棘UGT 基因在果實發(fā)育的各個時期均有相對較高的表達(dá)水平，H組、I組、K組、M組和N組中各成員在沙棘果實中表達(dá)量均相對較低。

本研究對部分表達(dá)差異較大的沙棘UGT 利用實時熒光定量PCR 進行驗證，結(jié)果（圖5）表明：在蒙古沙棘中HrUGT0002、La2g0900、La9g0469和La11g2592 均隨果實成熟表達(dá)量逐漸上升，而La2g3104、La10g1923、La12g2361 總體呈下降趨勢，La11g0447 和La11g0570 基因則在果實發(fā)育的中期表達(dá)較高。總體來看，實時熒光定量PCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致。

圖5 沙棘UGT 基因在果實不同發(fā)育時期的實時熒光定量PCR 分析Fig.5 Expression analysis of selected HrUGTsin various developmental stages using RT-qPCR.

3 討論

為了從功能上對沙棘UGT 進行鑒定，通過系統(tǒng)發(fā)育分析將鑒定到的89 個沙棘UGT 基因聚類為16 個組。沙棘中的UGT 基因約占沙棘全基因組基因總數(shù)的0.29%，低于桃（0.6%）[23]和擬南芥（0.44%）[11]，高于石斛（0.28%）[24]和玉米（0.23%）[12]的UGT 基因占比。A組、L組、D組、G組和E組被認(rèn)為是高等植物進化過程中進化最快的分組[15]，在沙棘中這些分組包含了最多的UGT 基因家族成員，這一結(jié)果與Ren 等[24]和Cui 等[13]的研究高度一致。A組中的多數(shù)UGT 被鑒定為能夠催化類黃酮糖苷再次糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶[25-27]，本研究發(fā)現(xiàn)，沙棘UGT 家族A組成員均不含單糖基轉(zhuǎn)移酶中高度保守的C 端GSS 基序，這一結(jié)構(gòu)特征也暗示著沙棘UGT 家族A組成員可能和多糖基類黃酮糖苷的生物合成存在重要聯(lián)系。O組和Q組在沙棘中未發(fā)現(xiàn)有成員存在，這兩個分組最早在玉米中鑒定出來[12]并被認(rèn)為可能與細(xì)胞分裂素的糖基化有關(guān)。La12g1195、La11g1196 和La5g0668 被劃分為UGT95 亞家族，這一亞家族在山柳蘭中首先被鑒定出來，能夠催化木犀草素和槲皮素的3′-OH 基團和山萘酚的7-OH 基團糖基化[28]。在石榴[29]和茶樹[13]中均發(fā)現(xiàn)了UGT95 亞家族成員的存在，Cui 等將其劃為R組[13]，在本研究中延續(xù)了這一分組的劃分。

在鑒定到的89 沙棘UGT 基因中，有84 個基因被定位到染色體上。這些基因在染色體上通常成簇存在且表現(xiàn)出較高的序列相似性，這一特征與石斛和棉花表現(xiàn)一致[24,30]。本研究基于序列相似性和基因間距鑒定出12 個串聯(lián)重復(fù)基因簇和11 個共線基因?qū)?，證明串聯(lián)重復(fù)是導(dǎo)致沙棘UGT 基因家族擴張的主要復(fù)制事件。內(nèi)含子的位置、丟失和獲得可以作為了解基因家族在系統(tǒng)發(fā)育類群內(nèi)進化的重要指標(biāo)。超過一半(50.6%)的沙棘UGT 有內(nèi)含子插入，低于玉米(60%)[12]和擬南芥(58%)[11]的內(nèi)含子數(shù)量。利用MEME 在線工具來搜索UGT 蛋白之間共享的保守基序，共發(fā)現(xiàn)了10 個不同的保守基序，其中，在所有鑒定的UGT 中都發(fā)現(xiàn)了編碼UGT 結(jié)構(gòu)域的基序1。這些基序在組間有著顯著差異，特別是R組和A組均不含在其他分組中普遍存在的基序9。這些特定的基序可能會導(dǎo)致沙棘UGTs 功能的分化。

了解基因的時空表達(dá)模式有助于推測基因的功能。在蒙古沙棘中，48 個UGT 基因在果實發(fā)育過程中表達(dá)（FPKM >1），在中國沙棘中這一數(shù)字為51。R組3 個成員表達(dá)量在兩個亞種果實發(fā)育時期均較高。除La9g0469 外，E組成員在兩個亞種果實中均有不同程度的表達(dá)。La9g0469 在中國沙棘中不表達(dá)，而在蒙古沙棘中高表達(dá)，且隨著果實發(fā)育表達(dá)量逐漸上升，這種特異性的表達(dá)可能對兩個亞種果實中代謝物組成造成一定影響。

4 結(jié)論

本研究在沙棘全基因組范圍內(nèi)鑒定獲得89 條含有UGT 保守結(jié)構(gòu)域的HrUGTs 蛋白序列，并劃分為16 個系統(tǒng)發(fā)育分組。同一分組內(nèi)沙棘UGT 具有相似的蛋白基序和基因結(jié)構(gòu)，但在組間存在著巨大差異。沙棘UGT 家族在進化過程中受到純化選擇。沙棘UGT 基因家族成員在兩個沙棘亞種和果實不同發(fā)育階段的表達(dá)模式具有顯著差異。沙棘UGT 基因家族的表達(dá)模式和生物信息學(xué)分析將為進一步鑒定沙棘類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶功能和催化機理奠定基礎(chǔ)。