盧慧林,陳大嵩,陳逢浩,葉靜文,歐陽革成*

(1. 廣東省科學院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260；2. 華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，廣州 510642)

柑橘黃龍病(Huanglongbing)是最具毀滅性的柑橘病害(Hall and McCollum, 2011; Wang, 2019)，在全球的分布超過50多個國家和地區(qū)(Bové, 2006; 黃愛軍, 2014; European Food Safety Authority (EFSA),etal., 2019)，是全球柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。由于目前無法選育出抗病樹種，除了防治其媒介昆蟲-柑橘木虱以外，及時移除病樹，避免感染擴散，是防控黃龍病的關(guān)鍵措施之一，其中最重要的就是要及時快速地對柑橘黃龍病進行早期檢測和診斷(鄭正, 2017)。近年來，分子生物學檢測、高光譜檢測等技術(shù)，越來越普遍地用于柑橘黃龍病的識別與監(jiān)測(許美容等, 2015)，但仍然達不到生產(chǎn)要求。多聚酶鏈反應(Polymerase chain reaction, PCR)是目前應用于柑橘黃龍病識別的一種較為可靠且普遍的技術(shù)，但該方法存在的問題是難以實現(xiàn)實時在線檢測(陸健強等, 2021)。高光譜檢測可實現(xiàn)實時實地快速識別，但只對有明顯癥狀的染病樹有用，難以做到早期診斷。

隨著高通量測序方法的快速發(fā)展，測序成本的不斷降低，高通量測序被廣泛應用于各種病原的測序或檢測中(陳大嵩等, 2021)。牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore Technologies, ONT)的掌上納米孔測序儀MinION是一款新研發(fā)的便攜式測序儀，它能夠直接進行DNA和RNA測序，擁有超長的讀長、實時測序、隨時終止等特性，被廣泛應用于多種病原體的檢測(Wongsurawatetal., 2019; Warwicketal., 2019; 陳大嵩等, 2021)。本文嘗試利用MinION測序儀對感染黃龍病的柑橘DNA樣品進行測序，對比不同軟件的比對結(jié)果，優(yōu)化分析手段，從而實現(xiàn)利用高通量測序技術(shù)對黃龍病菌進行有效監(jiān)控和高效測定。

1 材料與方法

1.1 DNA提取

4個柑橘葉片(砂糖桔Citrustrticulata，典型黃龍病斑駁葉片)標本均取自廣東省科學院動物研究所環(huán)境昆蟲研究中心養(yǎng)蟲室，葉片總DNA提取方法：采用Biospin植物基因組試劑盒，實驗步驟參照說明書進行調(diào)整：稱取0.1 g植物葉片葉脈，用滅菌剪刀剪碎，置于2.0 mL離心管中，加入100 μL LP Buffer，并放入研磨珠，將離心管放入研磨機內(nèi)研磨，研磨后在加入350 μL LP Buffer，并混合均勻；于65℃下溫浴15 min，每5 min顛倒混勻；加入150 μL DA緩沖液，混合均勻，放置冰浴中5 min；將管中混合物全部轉(zhuǎn)移至Shredder spin colum，于14 000 xg離心3 min；將上述濾液轉(zhuǎn)移到一個滅菌后的1.5 mL離心管；加750 μL或上述濾液體積1.5倍的P Binding緩沖液，并混合均勻；將上述混合液體轉(zhuǎn)移至Spin colum，然后6 000 xg離心60 s，并棄去接液管中液體；加入500 μL G Binding緩沖液至Spin colum，于10 000 xg離心30 s，并棄去接液管中液體；加入600 μL Wash緩沖液，于10 000 xg離心30 s，并棄去接液管中液體；空管離心Spin colum，10 000 xg離心1 min，并將Spin colum轉(zhuǎn)移至一個新滅菌的1.5 mL離心管；加入100～200 μL Elution緩沖液，室溫溫育1 min；12 000 xg離心1 min，并棄去Spin colum，1.5 mL離心管中液體含有DNA。

1.2 黃龍病病原菌檢測

參照許美容等(2016)檢測方法，用基于柑橘黃龍病菌16S rDNA基因的OI1/OI2c (5′-GCGCGTATCCAA-TACGAGCGGCA-3′/5′-GCCTCGC GACTTCGCAAC-CCAT-3′)引物擴增目的DNA樣品，以健康柑橘材料提取的DNA分別作為陰性對照，以感染黃龍病的柑橘DNA為陽性對照。PCR擴增反應完成后，取6 μL PCR產(chǎn)物和6×Loading Buffer相混合，于室溫下進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為120 V，時間為30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，如在1 167 bp處出現(xiàn)條帶，則為陽性樣品。

1.3 納米孔測序文庫構(gòu)建

參考納米孔測序連接測序試劑盒說明書進行納米孔測序文庫構(gòu)建。首先，利用微量分光光度計測量溶液中DNA含量，并保證1 μg以上的DNA用于下一步實驗；其次利用試劑盒NEBNext End repair / dA-tailing Module (NEB：E7546)對打斷的DNA進行末端修復；第三步，利用磁珠AMPure XP beads(Agencourt)對DNA文庫進行回收；第四步，利用末端連接試劑盒NEB Blunt / TA Ligase Master Mix (NEBZ: M0367)與連接測序試劑盒1 D Genomic DNA by ligation (Oxford Nanopore Technologies: SQK-LSK108)進行DNA末端測序接頭的連接，完成DNA測序文庫的構(gòu)建；最后，參照試劑盒說明書的方法進行對測序芯片進行質(zhì)檢(陳大嵩等, 2021)。

1.3 納米孔測序與分析

測序獲得的fastq文件利用長序列比對軟件GraphMap、minimap2、bwa在mem模式下參數(shù)-x選擇ont2d以及bwa在mem模式下參數(shù)-A選擇2、參數(shù)-B選擇3比對到柑橘黃龍病亞洲種基因組序列(GenBank: NZ_CP010804.1)。測序獲得的fastq文件轉(zhuǎn)換成fasta文件后，利用blastn比對到柑橘黃龍病亞洲種基因組序列(GenBank: NZ_CP010804.1)。比較不同比對軟件與比對方案之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌檢測結(jié)果

采集的4個樣品中，經(jīng)常規(guī)PCR檢測顯示，樣品編號4的柑橘DNA擴增到1條大小約1 167bp的條帶，確定為黃龍病菌(圖1)，以此DNA樣品進行下一步的測序和分析。

圖1 柑橘樣品中黃龍病菌的PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoretogram of Candidatus Liberibacter asiaticus in citrus samples注：M，DL2000 DNA marker；+，陽性對照(感染黃龍病的柑橘DNA樣品)；-，陰性對照(健康柑橘DNA樣品)；1～4，采自廣東省科學院動物研究所實驗室的柑橘樣品。Note: M, DL2000 DNA marker; +, Positive control (DNA sample of citrus infected CLas); -, Negative control (DNA sample of citrus un-infected CLas); 1～4, Citrus samples taken from the laboratory of Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization.

2.2 納米孔測序與分析

利用MinION測序儀對確診黃龍病菌感染的柑橘葉片總DNA進行測序，獲得約25 M條序列共3.75 G個堿基(圖2)。序列最長27 147 bp，序列長度的中位數(shù)為1 239 bp，平均長1 492 bp。利用Blast、GraphMap、minimap2以及兩種bwa的比對方法將測序結(jié)果比對到黃龍病基因組上，其中Blast、GraphMap、minimap2、bwa AB與bwa x分別比對上5 702、42 557、6 200、7 269與56 712條序列(圖3)，其中Blast、minimap2與bwa AB分析方法獲得的結(jié)果比較接近。將比對算法的軟件GraphMap、minimap2以及bwa得到的結(jié)果利用比對到黃龍病菌基因組的位置展示成圈圖(圖4)，可見比對結(jié)果均勻地比對到黃龍病菌基因組上，并未發(fā)現(xiàn)嚴重的偏倚現(xiàn)象。

圖2 MinION測序原始序列長度堆積圖Fig.2 Histogram of the raw sequences by MinION sequencer注：橫坐標，序列長度；縱坐標，序列長度的頻數(shù)，即每個序列長度區(qū)間內(nèi)有多少個序列。Note: X-axis, Sequence length; Y-axis, Sequence frequency, namely the sum of the sequences within each sequence length interval.

圖3 比對結(jié)果的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of comparison results注：bwa_x，bwa在mem模式下參數(shù)-x選擇ont2d；bwa_AB，bwa在mem模式下參數(shù)-A選擇2、參數(shù)-B選擇3。Note: bwa_x, bwa mem mapping mode with -x ont2d; bwa_AB, bwa mem mapping mode with -A 2 -B 3.

圖4 分析軟件比對到基因組的位置Fig.4 The location of the genome mapped by each software注：外環(huán)，黃龍病菌基因組長度的示意圖；中環(huán)，各軟件比對到黃龍病菌基因組位堆積圖，高度表示比對到該基因組位置的堿基數(shù)量；內(nèi)環(huán)，黃龍病菌基因組的GC含量。Note: Outer, Diagram of genome length of Huanglongbing; Central, Histogram of each software mapping to Huanglongbing genomic, and the height indicates the sum of bases mapped to the genomie; Inner, GC content of Huanglongbing genome.

3 結(jié)論與討論

納米孔測序技術(shù)Nanopore sequencing為近幾年興起的第三代測序技術(shù)，由牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore Technologies, ONT)開發(fā)，與以往的測序方法不同，該技術(shù)基于電信號的測序技術(shù)，通過電流信號的特征性改變，來確定正在通過該孔的DNA或RNA的堿基序列，進行實時單分子測序(Senol Calietal., 2019; 陳大嵩等, 2021; 張皓博等, 2021)。該技術(shù)能夠邊解鏈邊測序，無需PCR擴增和化學樣品標記，極大簡化了測序試驗流程，有效降低了假陽性，而且不需要模板設計引物，甚至可以鑒定新病原等的特性，可以與PCR鑒定方法形成互補(Fengetal., 2015; 陳大嵩等, 2021)，該技術(shù)具有高通量、實時、長片段讀長、易集成、時效性強、體積較小便于攜帶等優(yōu)勢，可應用于動植物和微生物基因組測序、宏基因組測序、RNA直接測序、微生物檢測、DNA與RNA甲基化檢測、mRNA的polyA長度定量等研究(Senol Calietal., 2019; 曹影等, 2020; 陳大嵩等, 2021)。杜宇等(2021)利用納米孔技術(shù)構(gòu)建和注釋了蜜蜂球囊菌的首個高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄組，為探究球囊菌轉(zhuǎn)錄組的復雜性、完善參考基因組的序列和功能注釋信息以及深入開展球囊菌可變剪接體的功能研究提供了關(guān)鍵依據(jù)。在人類疾病檢測中，納米孔測序也顯示出明顯的優(yōu)勢，該技術(shù)有著先前基因測序技術(shù)沒有的優(yōu)勢，其能夠提供動態(tài)、實時的測序，可在數(shù)小時或更短的時間內(nèi)獲取和分析DNA或RNA序列，且文庫制備簡單，不受環(huán)境限制，便于攜帶，使現(xiàn)場基因測序成為可能，從而進一步加快了檢測時間，有助于迅速診斷疾病并及時進行針對性治療(Euskirchenetal., 2017; 張皓博等, 2021)。

柑橘黃龍病的實時實地早期檢測和快速診斷技術(shù)是防控黃龍病的關(guān)鍵措施之一，目前尚無滿足生產(chǎn)實際要求的技術(shù)和產(chǎn)品。本文利用納米孔測序技術(shù)對攜帶黃龍病菌葉片樣品的DNA進行測序，并利用Blast、GraphMap、minimap2以及兩種bwa的比對方法將測序結(jié)果比對到黃龍病基因組上，比對結(jié)果均勻的比對到黃龍病菌基因組上，并未發(fā)現(xiàn)嚴重的偏倚現(xiàn)象，驗證了其測序結(jié)果的可靠性。隨著技術(shù)發(fā)展和產(chǎn)品成本的降低，可以為柑橘黃龍病的檢測診斷提供一種新的技術(shù)方案。由于本技術(shù)能夠一次性地對同一樣品中混和存在的不同物種基因信息進行靈敏準確的檢測識別，在未來的病蟲智能監(jiān)控系統(tǒng)中整合這一技術(shù)，對收集(如燈光誘集、機械吸取或掃網(wǎng)采集等)到的害蟲樣本進行自動化檢測，以彌補因柑橘木虱蟲體過小或損壞難以進行光學識別的不足，并可同時檢測蟲體是否攜帶有黃龍病菌，對有黃龍病發(fā)生風險但尚未有黃龍病實際發(fā)生的柑橘種植區(qū)提供實時實地的監(jiān)控與預警,同樣也可用于對其它危險性入侵害蟲的監(jiān)控。