馬文慧，鄺吉衛(wèi)，李保玲，高 翔，曹云剛，黃峻榕

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

肉及肉制品在滿足人體對營養(yǎng)素的需要中占有重要地位，是蛋白質、脂肪、B族維生素和多種礦物質的良好來源[1]。在加工和貯藏過程中蛋白質氧化是導致原料肉及肉制品品質下降的重要原因。肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）約占肌肉總蛋白的55%～65%，決定肉制品加熱過程中三維網(wǎng)絡結構的形成，對肉制品質地的形成起至關重要的作用[2]?，F(xiàn)有研究表明誘發(fā)蛋白氧化的物質包括活性氧物質、活性氮物質以及脂肪氧化應激的二級產(chǎn)物等[3]，這些物質主要來源于肌肉本身及加工貯藏過程中。其中羥自由基是活性氧自由基中氧化能力最強的自由基，羥自由基氧化體系也是肉制品加工中最普遍存在的一種氧化體系[1]。大量研究表明羥自由基會誘導蛋白結構發(fā)生變化，引起溶解度降低，交聯(lián)聚集情況加劇，進而影響其凝膠特性及消化率，并導致肉及肉制品的質地及口感劣變[2,4-5]。因此，調控肉蛋白氧化穩(wěn)定性、改善蛋白的凝膠性能已成為近年來的研究熱點。

現(xiàn)有研究聚焦于采用不同飼料喂養(yǎng)[6]、不同包裝技術[7]、添加抗氧化劑[8-10]等手段提高原料肉的氧化穩(wěn)定性、降低儲藏過程中原料肉的脂肪和蛋白氧化。其中添加抗氧化劑的策略簡便經(jīng)濟，主要包括添加人工合成抗氧化劑[8]、天然抗氧化劑（植物多酚、復合磷酸鹽）等[9-10]。然而現(xiàn)有添加劑對于抑制肉蛋白氧化效果有限，且人工合成抗氧化劑的攝入對人體健康具有潛在危害，比如誘發(fā)癌癥和畸形等[11-12]；復合磷酸鹽過量攝入會打破人體鈣磷比平衡，導致高血鈣癥、低血鈣癥及佝僂病等疾病[13]。

精氨酸（L-(+)-arginine，L-Arg）作為一種多用途、多功能的氨基酸，在許多領域均有重要應用。對人體而言，L-Arg是條件必需氨基酸，具有抗氧化[14]、治療腸道損傷、增強機體免疫力等[3,15]作用。對肉制品加工而言，L-Arg可以改善肉制品色澤和質構，提高出品率，增加肉制品嫩度，改善肉品品質[16-18]。然而，關于氧化條件下L-Arg對MP結構及凝膠性能調控方面的研究鮮見報道。因此，本研究采用FeCl3-VC-H2O2體系構建羥自由基模擬氧化體系[2]，探究L-Arg添加量對MP化學及結構變化、交聯(lián)和聚集情況、熱誘導凝膠性能及微觀結構的影響，明晰L-Arg對MP氧化穩(wěn)定性及凝膠性能的調控機制，為提高肉蛋白的氧化穩(wěn)定性、改善肉品品質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬外脊肉（Longissimus lumborum）購買自陜西西安潤家超市。

水溶性VE（Trolox） 美國Sigma-Aldrich公司；5,5’二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid，DTNB）、哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸)（piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES）、L-Arg 上海源葉生物科技有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺30%溶液（29∶1，V/V）、過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、甘氨酸、溴酚藍 生工生物工程（上海）股份有限公司；牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）、H2O2（30%）、FeCl3、抗壞血酸（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HR/T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；CP213電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；UV2900紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TA.Plus物性測試儀 英國Stable Micro System公司；Fluoro Max-4熒光分光光度計日本Horiba公司；Mastersizer 2000激光粒度分析儀英國Malvern Instruments有限公司；Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；CM-5分光測色計柯尼卡美能達（中國）投資有限公司；Haake-Mars 60流變儀、DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀 德國Thermo Fisher Scientific公司；Q45+EDAX Octane Prime環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

豬外脊肉樣品排酸24 h，剔除可見脂肪、結締組織，垂直于肌纖維走向切成100～120 g的肉片，真空密封于－20 ℃冰箱中冷凍儲存，3 個月內用完。使用前，將單片冷凍肌肉樣品解凍并切成小條稱量，MP的提取參照Park等[19]方法。全部提取過程保持在0～4 ℃，提取的MP在48 h內用完。蛋白濃度采用雙縮脲法測定，以BSA作為標準蛋白。

1.3.2 MP的氧化處理

用含有15 mmol/L pH 6.25 PIPES緩沖液將MP稀釋至45 mg/mL，調節(jié)稀釋液NaCl濃度為0.6 mol/L，制備含有不同濃度L-Arg（1、3、5 mmol/L和10 mmol/L）的樣品，添加氧化體系（10 μmol/L FeCl3，100 μmol/L抗壞血酸，10 mmol/L H2O2），將最終體系蛋白質量濃度調至30 mg/mL。MP樣品在4 ℃氧化12 h，通過添加Trolox（1 mmol/L，終濃度）終止氧化。未經(jīng)L-Arg處理的未氧化（NonOx）MP樣品作為空白組，氧化（Ox）MP樣品作為對照組。

1.3.3 總巰基及內源性色氨酸熒光的測定

總巰基測定：按照Cao Yungang等[20]的DTNB法。

內源性色氨酸熒光測定：用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將MP樣品稀釋為0.4 mg/mL，利用Fluoro Max-4 熒光分光光度儀于283 nm激發(fā)，記錄290～400 nm的發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設置為1.5 nm。相同條件下記錄溶劑發(fā)射光譜，并從樣品發(fā)射光譜中扣除以排除干擾。

1.3.4 交聯(lián)聚集情況的測定

粒徑分布的測定：使用Mastersizer 2000型激光粒度分析儀在25 ℃采用靜態(tài)光散射分析MP樣品的粒徑分布。用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將樣品稀釋為2 mg/mL（避免多重散射），去除測量背景后，將MP稀釋液分散在800 mL蒸餾水中，直到光遮光度達到10%～13%時，測量得出粒徑分布范圍。

溶解度測定：用15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）將MP樣品稀釋為2 mg/mL，4 ℃、5 000×g離心15 min。上清液蛋白質量濃度（雙縮脲法測定）占2 mg/mL的百分比即為溶解度[1]。按式（1）計算：

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：參考Laemmli[21]的方法適當調整。采用SDS-PAGE分析法對還原和非還原條件下蛋白交聯(lián)和聚集情況進行分析。濃縮膠和分離膠濃度分別選用4%和12%，2 mg/mL MP樣品與樣品緩沖液（含20%甘油、4% SDS和0.5 mol/L pH 6.8 Tris）進行等比例混合，沸水浴3 min，每孔上樣量25 μL。染色脫色后拍照并對電泳條帶進行分析。

1.3.5 凝膠性能的測定

動態(tài)流變學特性分析：參考Cao Yungang等[22]的方法稍加修改。使用Haake-Mars 60型流變儀進行振蕩溫度連續(xù)掃描，分析MP樣品在凝膠化過程中的流變行為。流變儀使用前調零，MP樣品（30 mg/mL）離心脫氣（1 000×g，1 min）后，取約2.0 mL樣品均勻涂布于平板上，將轉子（型號P 35）降至1 mm時去除周圍多余樣品，并在邊緣涂上硅油層以防止水分散失。將MP樣品在20 ℃平衡3 min，以1 ℃/min的速率從20 ℃加熱至75 ℃。振蕩模式選擇CD-AutoStrain，以固定頻率（0.1 Hz）剪切MP樣品，控制應變?yōu)?.02，監(jiān)測樣品凝膠化過程。通過儲能模量（G’）和黏彈比（tanδ）評價MP樣品的動態(tài)流變特性。

熱誘導凝膠制備：準確稱取5 g MP樣品（30 mg/mL）置于小玻璃瓶中，用保鮮膜輕輕密封后，置于水浴鍋中，從20 ℃加熱至75 ℃，并在75 ℃保溫10 min。取出放入冰水浴中冷卻30 min后置于4 ℃冰箱過夜。測定凝膠性能前，需將凝膠樣品在室溫條件下平衡2 h。

蒸煮損失測定：用小鏟將凝膠輕輕地與小玻璃瓶壁分開（避免瓶壁的牽引力），倒置于濾紙上20 min，待蒸煮汁液流盡后稱量凝膠質量[1]。蒸煮損失按式（2）計算：

凝膠白度測定：參照Xia Xiufang等[23]方法略作修改。分光測色計經(jīng)自檢及零點、白板校正后，進行樣品測定。每個樣品3 組平行，取平均值。凝膠白度值按式（3）計算：

式中：L*為亮度值；a*為紅度值（正值表示偏紅，負值表示偏綠）；b*為黃度值（正值表示偏黃，負值表示偏藍）。

凝膠強度測定：MP樣品凝膠強度用TA-XT Plus物性分析儀進行測定。測定模式：測前速率為5 mm/s；測中速率為1 mm/s；測后速率為5 mm/s；下壓距離為8 mm；探頭型號為P/0.5。凝膠強度定義為刺破凝膠所需的初始壓力（N）[24]。

1.3.6 凝膠中蛋白的二級結構測定

參考Cao Yungang等[25]的方法稍加修改。利用DXR2顯微共聚焦拉曼光譜儀和DXR 785 nm激光光源對MP凝膠的二級結構進行分析，配件選擇785 nm激光器和10×/0.25 BD的顯微鏡。其他參數(shù)設置如下：激光功率30 mW；孔徑50 μm；光斑直徑3.1 μm；分辨率4.7～8.7 cm－1；收集曝光時間30 s；樣品曝光次數(shù)3 次，選擇智能背景去除背景干擾。光譜數(shù)據(jù)由OMNIC軟件收集，使用LabSpec軟件對所得光譜進行平滑、基線校正，使用pickfit軟件對1 600～1 700 cm－1處去卷積擬合得出MP凝膠的α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規(guī)卷曲相對含量。

1.3.7 凝膠微觀結構觀察

將制備的MP凝膠切塊（3 mm×3 mm×1 mm），用含2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）固定4 h后，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液清洗3 次，在一系列乙醇溶液（50%、70%、90%、95%和100%）中進行梯度脫水，每次30 min，－70 ℃冷凍干燥后濺射噴金，使用環(huán)境掃描電子顯微鏡對凝膠微觀結構進行觀察，加速電壓15 kV，放大倍數(shù)4 000 倍[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每組實驗均重復2～3 次，使用Statistix 9.0分析軟件的線性模式進行方差分析，采用LSD模式比較多組數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著，通過SigmaPlot 12.5軟件進行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結果與分析

2.1 氧化條件下不同濃度L-Arg對MP化學及結構變化的影響

2.1.1 總巰基含量

巰基含量的變化常用于衡量蛋白氧化程度，MP富含巰基，尤其是肌球蛋白，每個肌球蛋白中約有40 個巰基，這些巰基易受羥自由基攻擊而轉化成分子內或分子間二硫鍵，直接影響蛋白質的結構，進一步影響其功能特性[26]。氧化條件下不同濃度L-Arg對MP巰基含量的影響如圖1A所示，未氧化MP的總巰基含量為62.0 nmol/mg，氧化12 h后MP的總巰基含量下降至52.6 nmol/mg，下降幅度高達15.2%。氧化條件下，當L-Arg添加量為1、3 mmol/L和5 mmol/L時，總巰基含量損失分別減少了2.3、0.3 nmol/mg和3.5 nmol/mg；然而，當L-Arg添加量為10 mmol/L時會進一步促進總巰基的損失（P＜0.05）。氧化條件下不同濃度L-Arg添加對MP巰基的影響主要歸因于以下兩個方面：1）L-Arg自身的—NH2等基團先與羥自由基進行反應，從而阻止了MP巰基的損失；2）L-Arg的加入引起了MP分子解折疊，使埋藏在其中的巰基基團暴露到了蛋白分子表面，因而更容易受到羥自由基的攻擊。

圖1 氧化條件下L-Arg濃度對MP化學及結構變化的影響Fig.1 Effects of different concentrations of L-Arg on the chemical and structural changes of myofibrillar protein under oxidative conditions

2.1.2 內源色氨酸熒光

蛋白質內源色氨酸熒光對色氨酸殘基周邊的微環(huán)境特別敏感，是表征蛋白質構象的一種有效方法。當?shù)鞍踪|在折疊狀態(tài)時，其色氨酸熒光強度較強；當處于部分或完全展開的狀態(tài)時，其熒光強度會明顯降低[27]。如圖1B所示，未氧化的MP顯示出較強的熒光強度，在最大發(fā)射波長處的熒光強度約為46.4×104cps，氧化誘導蛋白質結構展開，使色氨酸暴露在極性環(huán)境中，導致MP熒光強度顯著降低。L-Arg的加入并沒有阻止氧化引起的MP色氨酸熒光強度降低，相反，隨著L-Arg添加量的增加，內源色氨酸熒光強度逐步降低。一方面可能是由于L-Arg處理使MP分子進一步展開[28]，使得更多的色氨酸殘基暴露于溶劑中導致其熒光猝滅；另一方面可能是由于L-Arg中多個親水基團（—COOH和—NH2）的存在使得色氨酸殘基的微環(huán)境極性增強，導致熒光強度進一步降低。

2.2 氧化條件下不同濃度L-Arg對MP中交聯(lián)聚集程度的影響

2.2.1 粒徑分布

蛋白質的粒徑通常反映蛋白質的聚集程度，氧化條件下不同濃度L-Arg對MP粒徑分布的影響如圖2所示，與未氧化MP相比，氧化MP的峰形未發(fā)生明顯變化，但其粒徑分布明顯向更大粒徑轉變。這與Bao Yulong等[29]報道的在次氯酸鈉氧化應激下，MP顆粒尺寸增大結果類似。經(jīng)L-Arg處理后，MP樣品的粒徑分布圖變?yōu)榱穗p峰，說明L-Arg的添加導致了MP大分子聚合物的生成。當L-Arg濃度為1～5 mmol/L時，大分子聚合物形成隨L-Arg濃度的增加呈下降趨勢，但當L-Arg濃度為10 mmol/L時，大分子聚合物的形成急劇增強。這可能是由于L-Arg的添加進一步促進了氧化誘導的MP結構的展開，使得巰基和疏水性基團暴露，蛋白分子間二硫鍵及疏水相互作用增強[28]，導致蛋白-蛋白交聯(lián)形成聚集體，向更大粒徑轉變。

圖2 氧化條件下L-Arg濃度對MP粒徑分布的影響Fig.2 Effects of different concentrations of L-Arg on particle size distribution of myofibrillar protein under oxidative conditions

2.2.2 交聯(lián)聚集程度

氧化條件下添加不同濃度L-Arg對MP交聯(lián)聚集的影響如圖3A、B所示。在非還原條件下（圖3A），與未氧化處理MP樣品相比，分離膠中氧化處理MP樣品的肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶變淺，說明氧化導致肌球蛋白重鏈和肌動蛋白發(fā)生交聯(lián)聚集。與氧化處理MP樣品相比，當L-Arg濃度在1～5 mmol/L時，L-Arg添加對MP的交聯(lián)聚集無顯著影響，當L-Arg濃度為10 mmol/L時，肌球蛋白重鏈條帶明顯變淺，說明高濃度L-Arg添加促進了MP的交聯(lián)聚集。在還原條件下（加入還原劑DTT后，圖3B），所有處理MP樣品濃縮膠頂端的聚合物條帶幾乎完全消失，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶明顯加粗，說明這些聚合物主要是通過巰基氧化產(chǎn)生的二硫鍵交聯(lián)形成的。綜合上述分析可知，在氧化條件下，低濃度L-Arg（1～5 mmol/L）對MP的交聯(lián)聚集影響不明顯，但高濃度L-Arg（10 mmol/L）會明顯促進MP的交聯(lián)聚集。

圖3 氧化條件下L-Arg濃度對MP SDS-PAGE圖譜及溶解度的影響Fig.3 Effects of different concentrations of L-Arg on SDS-PAGE pattern and solubility of myofibrillar protein under oxidative conditions

2.2.3 溶解度

如圖3C所示，未氧化MP的溶解度為63.4%，氧化12 h后，MP樣品的溶解度下降了約43.7%（P＜0.05），這主要是由于氧化導致MP結構的展開從而引起蛋白質聚集體的形成（圖2、圖3A）。當L-Arg添加量為1～5 mmol/L時，氧化MP的粒度增大（圖2），溶解度略有下降但無顯著差異（P＞0.05）。與本研究類似，郭秀云[30]研究發(fā)現(xiàn)在不同NaCl濃度（0.1、0.15、0.6 mol/L）下，添加5 mmol/L的L-Arg對肌球蛋白溶解度無顯著影響（P＞0.05）。當L-Arg濃度為10 mmol/L時，溶解度顯著降低（P＜0.05），這可能是由于高濃度L-Arg的加入使得MP分子鏈過度展開，導致羥自由基更容易攻擊其中的反應基團，促進二硫鍵的形成，交聯(lián)聚集情況加劇，平均粒徑增大（圖2），從而導致溶解度急劇降低。

2.3 氧化條件下不同濃度L-Arg對MP凝膠性能的影響

2.3.1 動態(tài)流變行為

MP凝膠的特征在于它的動力學黏彈流變特性[31]。在熱誘導凝膠過程中動態(tài)流變行為的變化主要通過G’和tanδ體現(xiàn)。G’描述的凝膠體系的彈性特征如圖4A所示，未氧化MP樣品的G’在約41 ℃開始顯著增加，在約49 ℃達到轉變峰，在約53 ℃到達波谷，隨后彈性模量持續(xù)升高至最終加熱溫度。這種流變學轉變在MP加熱誘導凝膠過程中廣泛存在，49 ℃的轉變峰主要是由肌球蛋白頭部（S1）的變性和聚集引起；49～53 ℃時，G’顯著降低，這歸因于肌球蛋白尾部（S2）的展開導致蛋白質網(wǎng)絡暫時性崩潰；53 ℃后，G’持續(xù)上升，這是由于隨溫度升高蛋白質進一步交聯(lián)聚集，形成了永久性、不可逆、更強的網(wǎng)絡結構[32]。與未氧化的MP相比，氧化后的MP在49 ℃處的轉變峰峰值明顯降低，說明肌球蛋白頭-頭相互作用被抑制，但其最終G′值高于未氧化MP，說明尾-尾相互作用被促進[33]。L-Arg濃度在1～5 mmol/L時沒有改變G′曲線的類型，但在10 mmol/L時MP樣品在49 ℃時的轉變峰幾乎消失。L-Arg濃度為1 mmol/L時，最終G′值增加了8.9%，當L-Arg添加量為3、5 mmol/L和10 mmol/L時，最終G′值分別下降了15.9%、19.6%和54.2%，說明隨著L-Arg添加量的增加，并不能改善凝膠網(wǎng)絡的形成甚至對凝膠網(wǎng)絡的形成產(chǎn)生負面影響。這可能是由于未加熱時L-Arg的添加促進了蛋白質分子內和分子間的相互作用，形成大的蛋白質聚集體（圖2），導致溫度上升時蛋白結構的展開速率低于交聯(lián)速率，阻礙了蛋白凝膠網(wǎng)絡的順利形成。

圖4 氧化條件下不同濃度L-Arg對MP流變性能的影響Fig.4 Effects of different concentrations of L-Arg on rheological properties of myofibrillar protein under oxidative conditions

tanδ是凝膠網(wǎng)絡形成過程中“黏度”與“彈性”的比值，其比值越高說明體系黏性越強或彈性越低[31]。氧化條件下不同濃度L-Arg的添加對MP凝膠過程中tanδ值的影響如圖4B所示。未氧化MP的tanδ值從20～42 ℃持續(xù)上升，在約42 ℃達到高峰后，隨后隨溫度的上升急劇下降，說明在20～42 ℃時黏性在凝膠體系占主導地位，42 ℃后彈性在凝膠體系占主導地位。氧化并不影響tanδ值的發(fā)展趨勢，但氧化MP的初始tanδ值增高，且tanδ值在20～32 ℃高于未氧化的MP，說明氧化導致MP在低溫時的黏性增大；32 ℃后tanδ明顯低于未氧化MP，說明氧化導致MP在高溫階段的黏度降低。添加低濃度L-Arg（1 mmol/L）在整個凝膠過程中對氧化MP的tanδ值影響并不顯著。添加較高濃度L-Arg（3 mmol/L和5 mmol/L）MP的tanδ值與氧化MP相比，其峰形發(fā)生了明顯變化。tanδ值在20～43 ℃持續(xù)上升，在43～47 ℃有一個臨時的下降，在51 ℃達到高峰后，隨后隨溫度的上升急劇下降。在高濃度L-Arg（10 mmol/L）下，tanδ值從20～51 ℃持續(xù)上升，在約51 ℃達到高峰后，隨后隨溫度的上升急劇下降。這說明較高濃度及高濃度L-Arg的添加顯著改變了凝膠過程中MP體系的黏彈性。

2.3.2 蒸煮損失

如圖5所示，未氧化MP凝膠的蒸煮損失約為12.2%，氧化使MP凝膠的蒸煮損失增加了77.9%。添加L-Arg后，MP凝膠的蒸煮損失隨L-Arg濃度的增加明顯降低，當L-Arg濃度達到10 mmol/L時，與氧化MP相比其蒸煮損失降低了約41.5%（P＜0.05），這與Guo Xiuyun等[34]報道的在高鹽濃度下，L-組氨酸、L-賴氨酸及HL-低鈉鹽提高了肌球蛋白凝膠保水性一致。

圖5 氧化條件下L-Arg濃度對MP凝膠性能的影響Fig.5 Effects of different concentrations of L-Arg on gel properties of myofibrillar protein under oxidative conditions

2.3.3 凝膠白度

未氧化MP凝膠白度約為63.7，氧化使凝膠白度略有降低（圖5）。與本研究結果類似，李銀等[35]發(fā)現(xiàn)隨著氧化強度增強，豬肉MP熱誘導凝膠白度呈下降趨勢。在氧化條件下，當L-Arg濃度為1 mmol/L時，凝膠白度并無顯著差異（P＞0.05），而后凝膠白度隨L-Arg濃度的增加顯著降低，當濃度為10 mmol/L時，凝膠白度為52.9，與氧化后MP凝膠相比降低了約13.3%（P＜0.05），這是由于L-Arg自身的顏色，導致MP凝膠白度隨L-Arg添加量增大而下降。

2.3.4 凝膠強度

如圖5所示，未氧化MP樣品的凝膠強度約為1.08 N，氧化使得凝膠強度降低了約26.9%（P＜0.05），L-Arg的加入促進了氧化引起的凝膠弱化，隨著L-Arg濃度的增加，凝膠強度逐漸降低；在10 mmol/L時，MP樣品的凝膠強度降至0.20 N，與氧化MP樣品的凝膠強度相比，降低約74.7%（P＜0.05）。Zhang Yinyin等[18]報道加入0.4%的L-Arg，可有效提高肌原纖維斷裂指數(shù)，從而增加肉的嫩度。肉嫩度提高的原因主要是肌原纖維和肌膜的連接被破壞，從而使得肌原纖維易于斷裂，凝膠強度降低但肌肉變嫩[36]。

2.4 氧化條件下不同濃度L-Arg對MP凝膠二級結構的影響

圖6顯示：未氧化MP凝膠的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲結構相對含量分別為43.9%、27.6%、6.6%和21.9%。氧化MP凝膠中蛋白的α-螺旋和β-折疊相對含量減少，而β-轉角和無規(guī)卷曲相對含量增多。Xia Minquan等[37]也報道了類似的結果。當L-Arg添加量為1 mmol/L和3 mmol/L時，α-螺旋相對含量顯著降低（P＜0.05），而后隨著L-Arg添加量的增加α-螺旋相對含量無明顯變化。當L-Arg添加量為1～5 mmol/L范圍時，β-折疊相對含量顯著增加，當L-Arg添加量為10 mmol/L時，β-折疊相對含量略有下降但無明顯差異。L-Arg的添加對β-轉角相對含量的影響并不明顯，但隨著L-Arg添加量的增加，無規(guī)卷曲相對含量明顯降低。研究表明，蛋白質凝膠持水性能與β-折疊的相對含量呈正相關[38]。因此，L-Arg的添加導致MP凝膠中蛋白的α-螺旋向β-折疊轉變，大量的β-折疊可能通過分子內和分子間的相互作用提高了MP的保水能力，降低了蒸煮損失（圖5）。

圖6 氧化條件下L-Arg濃度對MP凝膠二級結構的影響Fig.6 Effects of different concentrations of L-Arg on secondary structures of myofibrillar protein gels under oxidative conditions

2.5 氧化條件下不同濃度L-Arg對MP凝膠微觀結構的影響

蛋白凝膠的微觀結構是表征凝膠結構的直觀手段。如圖7所示，未氧化MP凝膠的微觀網(wǎng)絡結構連續(xù)、均勻、致密。相比之下，氧化MP凝膠的微觀網(wǎng)絡結構粗糙、不規(guī)則，且具有大團聚體和較大的不規(guī)則孔隙[39]，這也是其凝膠強度降低、蒸煮損失增加（圖5）的原因。氧化條件下，當L-Arg添加量≤3 mmol/L時，MP凝膠的微觀結構變化不明顯，而后隨著L-Arg濃度的增加，凝膠網(wǎng)絡更加均勻規(guī)則、蛋白聚集體顆粒逐漸變小。這也解釋了L-Arg的添加有效改善了氧化誘導的蒸煮損失降低（圖5）。

圖7 氧化條件下L-Arg濃度的MP凝膠微觀結構圖Fig.7 Microstructure of myofibrillar protein gels with different concentrations of L-Arg under oxidative conditions

3 結 論

氧化條件下低濃度L-Arg（1～5 mmol/L）對MP中巰基有一定的保護作用，但無法阻止氧化誘導的蛋白結構展開、交聯(lián)聚集和溶解度降低；高濃度L-Arg（10 mmol/L）則會顯著促進巰基損失和蛋白結構展開，導致蛋白交聯(lián)聚集加劇、粒度增大、溶解度降低。隨L-Arg添加量增加，MP凝膠的微觀結構更加細膩、凝膠強度和白度逐漸降低、凝膠得率逐漸升高。因此，添加低濃度L-Arg有望在一定程度上提高肉蛋白的氧化穩(wěn)定性，改善肉制品的嫩度和持水性。此外，本研究是在高鹽（0.6 mol/L NaCl）凝膠體系中進行的，低鹽條件下以及實際肉體系中L-Arg的影響需要進一步深入研究。