張 銳，石鳳翎，楊 蕾，彭 新，錢亞斯，崔思宇

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018)

野火球(TrifoliumlupinasterL.)為豆科(Leguminosae)車軸草屬(Trifolium)草本植物 ，又稱野車軸草、豆參。在我國東北分布有3種，內(nèi)蒙古地區(qū)有2種，包括1變種；在蒙古國、俄羅斯、朝鮮等地也有分布[1]。野生火球常生長(zhǎng)于干旱的草原、荒野田地、疏林草原和灌木叢，是適應(yīng)性較強(qiáng)的草種[2]，可用于人工草地建設(shè)和水土保持[3～4]；由于其花色鮮艷和花期長(zhǎng)，還可作為觀賞植物。另外，從該植物中還發(fā)現(xiàn)了黃酮類成分、香豆素、皂苷、芳香揮發(fā)性成分、脂肪酸、多糖及其他化合物[5～6]。黃酮類物質(zhì)是車軸草屬植物的主要成分，具有抗氧化活性和調(diào)節(jié)免疫力、抗過敏等諸多功效[7～8]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，來自不同地區(qū)的野火球種質(zhì)材料在內(nèi)蒙古呼和浩特種植，從生育期上表現(xiàn)出早熟和晚熟兩種類型，且晚熟材料地上生物量、平均生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)強(qiáng)度均優(yōu)于早熟材料[9]。為進(jìn)一步明確野火球的飼用價(jià)值，對(duì)兩種類型的種質(zhì)材料在不同生育時(shí)期及不同器官組織中的常規(guī)養(yǎng)分與總黃酮含量進(jìn)行了比較分析，為野火球資源的合理利用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)新區(qū)牧草試驗(yàn)地

(地處40°49′N、114°41′E，海拔1063m)。該區(qū)域年平均降水量為335.2～534.6mm，年平均氣溫5.4℃；7月、8月的降水量約占全年降水總量的50%，平均氣溫17～22.9℃;無霜期130～140d，具備灌溉條件。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料為生長(zhǎng)第2～3年的野火球早熟與晚熟種質(zhì)材料，分別在其分枝期、現(xiàn)蕾期、開花期和種熟期取樣，并于開花初期刈割，一個(gè)月后取其再生草，將各時(shí)期單株莖、葉、花分離，風(fēng)干后用球磨儀打磨成100目，于干燥陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 研究?jī)?nèi)容和測(cè)定方法

1.3.1各器官形態(tài)及主要生長(zhǎng)特性

在各供試材料生長(zhǎng)第2～3年的6月初(早熟材料為開花期，晚熟材料為分枝期)，隨機(jī)刈割各材料5株，留茬高度10～15cm。觀察并測(cè)定其株高、莖葉形態(tài)及其占比、單株分枝數(shù)及生物量。刈割生長(zhǎng)一個(gè)月后，對(duì)其再生草的營養(yǎng)成分含量以及總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2營養(yǎng)成分含量測(cè)定

刈割各物候期2份材料，自然風(fēng)干后粉粹過篩，測(cè)定其常規(guī)養(yǎng)分含量。用傳統(tǒng)半微量凱氏定氮法，通過對(duì)待測(cè)樣品消化、蒸餾后以甲基紅-溴甲酚綠作為指示劑，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行滴定并計(jì)算其粗蛋白(CP)含量[10]；索氏浸提法測(cè)定粗脂肪(EE)含量[11]；基于濾袋技術(shù)改進(jìn)的范氏酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維測(cè)定法測(cè)定酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量[12]；馬福爐分析法(灰化法)測(cè)定粗灰分(Ash)；依據(jù)GB/T13885-2017標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定鈣(Ca)含量及有機(jī)質(zhì)(OM)含量。

1.3.3總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》方法測(cè)定[13～14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS(18.0版本)進(jìn)行分析，兩組間均數(shù)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，不滿足方差齊性則采用獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種種質(zhì)材料莖葉形態(tài)與生長(zhǎng)特性

在同一觀察期內(nèi)兩份材料表現(xiàn)出明顯的形態(tài)和生長(zhǎng)差異。由表1可知，早熟材料進(jìn)入開花盛期時(shí)晚熟材料還處于分枝期；晚熟材料莖粗、葉大、葉色深綠。由表2可知，晚熟材料的枝條長(zhǎng)度和葉莖比及生物量明顯高于早熟材料(P<0.01)。兩者在形態(tài)與生長(zhǎng)特性上均有較大差異，這些差異將會(huì)直接導(dǎo)致其化學(xué)成分的差異。

表1 兩種野火球種質(zhì)材料莖葉形態(tài)

表2 兩種野火球種質(zhì)材料單株生長(zhǎng)特性

2.2 兩種種質(zhì)材料不同生育期的營養(yǎng)成分

由表3可知，兩種種質(zhì)材料分枝期和開花期的蛋白質(zhì)含量均顯著高于種熟期(P<0.05)，分枝期的酸性洗滌纖維含量(35.51～35.78%)均顯著低于其余時(shí)期(P<0.05)，種熟期的中性洗滌纖維含量(59.53～59.95%)均高于其余時(shí)期。野火球早熟材料分枝期的有機(jī)質(zhì)、粗蛋白質(zhì)含量均高于晚熟材料；而晚熟材料現(xiàn)蕾期與種熟期的粗脂肪含量(2.90～2.93%)、開花期的酸性洗滌纖維含量(52.42%)和分枝期的鈣含量(2.02%)均較高。

表3 不同生育時(shí)期野火球種質(zhì)材料的營養(yǎng)成分含量(% DM)

為合理利用野火球資源，在分枝期對(duì)野火球早熟材料和晚熟材料進(jìn)行刈割，測(cè)定了再生草的營養(yǎng)成分。再生草(第二茬)與第一茬草的各項(xiàng)營養(yǎng)成分均有變化，其中早熟材料刈割后再生草的有機(jī)質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和鈣含量均有增加，晚熟材料的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和鈣含量均有增加，而纖維含量都顯著降低(P<0.05)?？傮w表現(xiàn)出再生草的營養(yǎng)價(jià)值高于第一茬草(表4)。

表4 早熟與晚熟材料再生草的營養(yǎng)成分含量(% DM)

2.3 兩種種質(zhì)材料不同生育期的總黃酮含量

植物體內(nèi)總黃酮類化合物的含量隨著植物的生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。為深度開發(fā)和利用野火球資源，分別在分枝期、現(xiàn)蕾期、開花期和種熟期取樣，檢測(cè)總黃酮類化合物的含量。由表5可知，早熟材料的總黃酮類化合物含量在現(xiàn)蕾期達(dá)到最高(8.223mg/g)，均顯著高于其他生育時(shí)期，在種熟期總黃酮類化合物含量最低(5.952mg/g)；晚熟材料的總黃酮類化合物含量在分枝期含量最高(為7.694mg/g)，而開花期含量最低(6.037mg/g)。野火球早熟材料的黃酮類化合物總量顯著(P<0.05)高于晚熟材料，其中晚熟材料在分枝期和種熟期具有較高的總黃酮含量。這種差異的產(chǎn)生，可能與兩種種質(zhì)材料生育期所處的環(huán)境條件不同有關(guān)。

表5 兩種種質(zhì)材料不同生育時(shí)期總黃酮含量(%DM)

由表6可知，兩種種質(zhì)材料的第一茬草和第二茬草總黃酮含量也有較大變化。兩茬草總黃酮含量晚熟材料顯著(P<0.05)高于早熟材料；第二茬草總黃酮含量顯著(P<0.05)高于第一茬草，其中早熟材料第二茬草與晚熟材料第一茬草的含量相當(dāng)。

表6 兩種野火球種質(zhì)材料再生草總黃酮含量

3 討論

3.1 野火球不同生育期常規(guī)養(yǎng)分與總黃酮含量的關(guān)系

在營養(yǎng)成分方面，野火球不同生育期粗脂肪和鈣含量沒有差異，其原因是受當(dāng)?shù)丨h(huán)境和土壤中元素含量的影響。隨著植物成長(zhǎng)生育期不斷推進(jìn)，植物木質(zhì)部和韌皮部生長(zhǎng)，粗蛋白質(zhì)、有機(jī)質(zhì)含量增加明顯，纖維含量具有明顯差異。氣候變化對(duì)牧草生長(zhǎng)發(fā)育有較大影響[15～16]。

不同物候期的植物，在積累營養(yǎng)物質(zhì)上有著顯著差別。豆科植物體內(nèi)異黃酮類化合物的積累，尤其易受到環(huán)境因素和遺傳因素的影響[17]。異黃酮在植物體內(nèi)由苯丙烷次生代謝途徑進(jìn)行生物合成，從苯丙氨酸出發(fā)，由苯丙氨酸解氨酶作用下脫去氨基得到肉桂酸，肉桂酸在一系列酶作用下得到香豆酸，香豆酸在香豆素輔酶連接酶、查爾酮合酶作用下經(jīng)過縮合反應(yīng)得到4-羥基查爾酮為代表的一系列異黃酮類化合物。調(diào)控苯丙烷類代謝途徑可以影響異黃酮在大豆中的合成，通過基因修飾等工作促進(jìn)植物體內(nèi)異黃酮類化合物的積累。對(duì)不同生育期大豆異黃酮合成相關(guān)的基因表達(dá)差異進(jìn)行分析顯示，植物體內(nèi)異黃酮含量與異黃酮合成相關(guān)酶的表達(dá)量直接存在較為顯著的相關(guān)關(guān)系，且在不同器官中相關(guān)基因的表達(dá)存在差異，這是導(dǎo)致不同器官在同一時(shí)期含有的營養(yǎng)物質(zhì)量不同的主要原因[18]；幼苗期時(shí)子葉中異黃酮含量明顯低于根莖，而壯苗期時(shí)葉片增多，葉中異黃酮含量增加，在盛花期時(shí)葉片中異黃酮含量已超過根莖中異黃酮含量。在大豆發(fā)芽后，種子中的異黃酮由富含營養(yǎng)物質(zhì)的子葉向根莖中轉(zhuǎn)移，隨著大豆幼苗成長(zhǎng)營養(yǎng)物質(zhì)又重新由根莖輸送回葉中。不同營養(yǎng)物質(zhì)在不同時(shí)期在組織間存在代謝轉(zhuǎn)移，使得測(cè)定的營養(yǎng)物質(zhì)含量發(fā)生變化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，野火球不同生育時(shí)期的兩種種質(zhì)材料總黃酮類化合物的含量不盡相同，早熟野火球總黃酮含量順序?yàn)楝F(xiàn)蕾期>開花期>分枝期>種熟期，晚熟野火球總黃酮含量順序?yàn)榉种ζ?種熟期>現(xiàn)蕾期>開花期。晚熟材料在分枝期具有較高的總黃酮含量，與其蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致，而早熟材料則相反。

3.2 野火球早熟與晚熟材料養(yǎng)分差異與利用方式

野火球與三葉草屬其他主要物種相比，其開花期粗蛋白質(zhì)含量和粗脂肪含量均低于紅三葉、白三葉、降三葉和雜三葉[20]，但其總黃酮含量顯著高于紅三葉[9]，這可能與各物種營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化等有關(guān)。野火球早熟材料與晚熟材料由于各生育時(shí)期所處環(huán)境條件(主要是溫度、光照、雨水)的不同，導(dǎo)致其在相同生育時(shí)期各化學(xué)成分的差異，因此從資源利用最優(yōu)化出發(fā)應(yīng)在各物質(zhì)含量較高的生育時(shí)期收割利用。為此，建議野火球早熟材料分枝期飼用，現(xiàn)蕾至開花期藥用；晚熟材料在分枝期至現(xiàn)蕾期飼用。無論是藥用還是飼用，其再生草均具有較高的利用價(jià)值。

4 結(jié)論

4.1野火球早熟材料花盛期為晚熟材料分枝期，晚熟材料的枝條長(zhǎng)度和葉莖比明顯高于早熟材料。

4.2野火球晚熟材料粗蛋白質(zhì)、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維和鈣含量及總黃酮類化合物含量均高于早熟材料。

4.3野火球早熟材料和晚熟材料再生草的營養(yǎng)物質(zhì)與總黃酮含量均高于第一茬草；在利用上晚熟材料在分枝期至現(xiàn)蕾期易飼用，早熟材料分枝期易飼用而現(xiàn)蕾至開花期藥用。