趙龍瑞，肖靜，尚晴，李濤，劉新社，官方霖

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710061

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，火場發(fā)現(xiàn)的尸體常常需要辨別是生前燒死還是死后焚尸，其主要依據(jù)是尸體是否存在生活反應(yīng)。傳統(tǒng)法醫(yī)學(xué)鑒定主要基于皮膚紅斑和水皰，呼吸道和（或）消化道內(nèi)的煙灰沉積以及血液中碳氧血紅蛋白濃度升高進(jìn)行判斷。但法醫(yī)病理學(xué)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)：在死后焚尸案例中尤其是死亡時(shí)間與焚尸時(shí)間十分接近時(shí)皮膚紅斑和水皰也會出現(xiàn)；在開放露天的火場中，呼吸道和消化道煙灰沉積以及血液中碳氧血紅蛋白濃度升高的現(xiàn)象可能不會發(fā)生，火場中的尸體更需要明確是燒死還是死后焚尸。因此，法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中需要更為科學(xué)、精準(zhǔn)、高效的方法對生前燒死和死后燒傷進(jìn)行鑒別。

白細(xì)胞分化群83（cluster of differentiation 83，CD83）編碼的蛋白質(zhì)是受體免疫球蛋白家族成員之一，參與抗原呈遞、免疫抑制等生命過程[1-2]。熱休克轉(zhuǎn)錄因子5（heat shock transcription factor 5，HSF5）是轉(zhuǎn)錄因子熱休克因子家族成員之一，有研究[3]表明，HSF5 在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡方面可能有重要作用。

在前期研究[4]中，本課題組建立了小鼠燒傷模型，使用芯片技術(shù)檢測出24 個(gè)差異表達(dá)的microRNA（其中19 個(gè)上調(diào)，5 個(gè)下調(diào)），并通過京都基因和基因組百科庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）、基因本體（gene ontology，GO）分析等篩選出293 個(gè)上游表達(dá)基因，其中CD83 和HSF5 基因表達(dá)水平變化較為明顯?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本研究將CD83 及HSF5 作為目標(biāo)基因，通過建立小鼠皮膚燒傷模型，檢測燒傷皮膚中CD83 及HSF5 的mRNA 變化，并在法醫(yī)學(xué)尸體解剖皮膚檢材中驗(yàn)證，以期探索其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚深Ⅱ度燒傷模型制作及檢材提取

采用由西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心提供的健康雄性BALB/c 小鼠［7～8 周齡，（25±3）g］進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分為生前燒傷組、空白對照組和死后燒傷組。

生前燒傷組按照參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行建模：腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，使用電動(dòng)剃毛刀剃除小鼠背部毛發(fā)，暴露背部皮膚。使用加熱至100 ℃的銅梳（30 mm×10 mm）燒灼小鼠背部皮膚，持續(xù)4 s，0.5 h 后腹腔注射過量0.3%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）處死所有小鼠，室溫（24 ℃）保存。通過組織學(xué)驗(yàn)證[4]，此過程可造成小鼠背部皮膚深Ⅱ度燒傷。生前燒傷組的小鼠依次在其處死后0、6、12、24、48、72、96、120 h 進(jìn)行取材（每時(shí)間點(diǎn)各3 只）。仔細(xì)將小鼠背部皮膚與肌肉進(jìn)行分離，使用外科剪取燒傷處皮膚5 mm×5 mm，取樣后立刻將其置于液氮中保存待檢。

空白對照組和死后燒傷組每組各3 只小鼠，采用前述方法麻醉脫毛并處死，空白對照組皮膚樣本取自未損傷的小鼠，死后燒傷組樣本取自處死小鼠0.5 h后，按照上述方法制造燒傷模型后取小鼠皮膚，取材大小均為5 mm×5 mm。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)過程均得到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會審核、批準(zhǔn)（審批號20190103）。

1.2 人體皮膚燒傷樣本提取

人體皮膚燒傷樣本取自死亡原因?yàn)橹囟葻齻虬橐谎趸迹–O）中毒的法醫(yī)學(xué)尸體解剖實(shí)際案例，其中男性樣本10 例，女性樣本5 例，對照組取自相同案例未受損傷處皮膚。利用Agilent RNA 6000 Nano 試劑盒（美國Agilent 公司）結(jié)合Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）檢測RNA 完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN），詳細(xì)信息見表1。解剖時(shí)仔細(xì)將取材部位皮膚和肌肉進(jìn)行分離，并在燒傷和未燒傷部位皮膚各取5 mm×5 mm，置于裝有2.0 mL RNA 穩(wěn)定保存液（RNAlaterTMstabilization solution，RNAlater）的離心管中，并迅速放入液氮中保存。本研究由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)過程均得到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會審核、批準(zhǔn)（審批號20190103）。

表1 案例資料Tab.1 Cases information

1.3 RT-qPCR

使用PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）獲得總RNA 的cDNA 拷貝。使用ECOTMReal-Time PCR 系統(tǒng)（美國Illumina 公司）和SYBR?Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa 公司）在48 孔反應(yīng)板上進(jìn)行RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)。選用GAPDH作為RT-qPCR 的內(nèi)參，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，55 ℃15 s，95 ℃15 s，1 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：2×Realtime PCR Mix 5.0 μL，內(nèi)參及目的基因的上下游引物各0.5μL，無菌無酶水3.0μL，cDNA 1.0 μL，總體積為10.0 μL，通過2-ΔΔCt方法確定其相對表達(dá)水平?；蛱禺愋砸镄畔⒁姳?。

表2 RT-qPCR 特異性引物序列Tab.2 Specific primer sequences for RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣本均進(jìn)行3 次RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用非參數(shù)Mann WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行個(gè)體間的比較，通過Spearman’s Rho 檢驗(yàn)分別進(jìn)行RIN 與年齡、性別、死后經(jīng)過時(shí)間（postmortem interval，PMI）等參數(shù)的相關(guān)性分析。選用Graphpad prism 7.0（美國GraphPad Software 公司）和Stat-View（美國StatView 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。同時(shí)計(jì)算mRNA 相對含量在組間的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），F(xiàn)C 值越大，差異越顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚燒傷樣本

與死后燒傷組和空白對照組相比，生前燒傷組（死后0 h）CD83 和HSF5 的mRNA 水平升高（P＜0.05，表3）。CD83 的mRNA 水平升高在死后96 h 仍可明顯檢出，而HSF5的mRNA 水平升高可以持續(xù)至死后72 h（表3）。生前燒傷組（死后0 h）、死后燒傷組和空白對照組RIN 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但隨著PMI 的延長，生前燒傷組RIN 逐漸降低（表4）。

表3 不同PMI下CD83 和HSF5 的差異倍數(shù)Tab.3 Fold change of CD83 and HSF5 at different PMI（n=3，xˉ ±s）

表4 死后120 h 內(nèi)RIN 變化Tab.4 RIN changes within PMI 0 h and 120 h（n=3，）

表4 死后120 h 內(nèi)RIN 變化Tab.4 RIN changes within PMI 0 h and 120 h（n=3，）

2.2 人體皮膚燒傷樣本

與人體正常皮膚相比，在15 例（男性10 例，女性5 例）尸體樣本中，11 例（男性7 例，女性4 例，59 h≤PMI≤75 h，3.4≤RIN≤5.0）CD83 和HSF5 的mRNA 升高（P＜0.05），4 例（男性3 例，女性1 例，52 h≤PMI≤73 h，3.9≤RIN≤4.9）變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表5 人體檢材中燒傷與未燒傷處皮膚CD83 和HSF5 差異倍數(shù)Tab.5 Fold changes of CD83 and HSF5 in human burned and unburned skin samples（n=3，）

表5 人體檢材中燒傷與未燒傷處皮膚CD83 和HSF5 差異倍數(shù)Tab.5 Fold changes of CD83 and HSF5 in human burned and unburned skin samples（n=3，）

注：1）與未損傷皮膚相比，P＜0.05。

3 討論

在火場發(fā)現(xiàn)尸體時(shí)，法醫(yī)需要謹(jǐn)慎評估死亡原因和死亡方式，即判斷是否存在殺人后焚尸以掩蓋案件真相的可能。然而，傳統(tǒng)的鑒定指標(biāo)如尸體皮膚紅斑、呼吸道煙塵等在法醫(yī)病理實(shí)踐過程中可能會存在不明確甚至缺失的情況，這些情況的出現(xiàn)提示尋找準(zhǔn)確可靠的生活反應(yīng)指標(biāo)的重要性。據(jù)報(bào)道[5-6]，一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可用于探究生活反應(yīng)。GAUCHOTTE 等[7]認(rèn)為，CD15 及類胰蛋白酶是生活反應(yīng)存在的可靠標(biāo)志物。目前有關(guān)生前燒傷與死后焚尸的生活反應(yīng)鑒別研究較少，免疫組織化學(xué)研究[8-10]表明，生前燒死尸體的呼吸道和肺部中熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）表達(dá)水平升高。KUBO 等[11]研究認(rèn)為，生前燒死尸體皮膚中水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）的mRNA 表達(dá)明顯增加。然而在實(shí)際檢案中，相關(guān)指標(biāo)缺乏統(tǒng)一的量化標(biāo)準(zhǔn)，無法進(jìn)行科學(xué)精準(zhǔn)的檢測，尤其是免疫組織化學(xué)法等受取材等因素的影響，顯微鏡下觀察可能會出現(xiàn)漏檢錯(cuò)檢的情況，進(jìn)行鏡檢也較為耗時(shí)費(fèi)力，而針對mRNA 的檢測則更為精確高效，但針對燒傷相關(guān)基因檢測并未形成系統(tǒng)。皮膚是人體最大的器官，覆蓋人體表面，在火場中，皮膚作為第一接觸熱源的組織器官，相對呼吸道、血液等，反應(yīng)更為靈敏、直接。因此，本研究通過對皮膚燒傷動(dòng)物模型和人體燒傷樣本的研究，以期尋找有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的生活反應(yīng)指標(biāo)。

對小鼠的研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，生前燒傷皮膚中CD83 和HSF5 的mRNA 水平明顯升高，而死后燒傷組并沒有明顯變化，提示CD83 及HSF5 傷后反應(yīng)靈敏。針對尸體隨時(shí)間推移存在不同程度的死后變化現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)通過對不同時(shí)間點(diǎn)的RIN 變化進(jìn)行了觀測。RIN 反映RNA 的降解情況，最小值為1，表示RNA 完全降解；最大值為10，表示RNA 完整、未降解[12]。本研究中，RIN 隨著時(shí)間增加而降低，符合死后mRNA 降解的一般變化。與空白對照組相比，生前燒傷組于死后0 h CD83 和HSF5 表達(dá)量明顯增加，且隨著時(shí)間推移，表達(dá)量有所降低，但CD83 表達(dá)量在死后96 h 仍明顯高于空白對照組，HSF5 表達(dá)量增加也可以持續(xù)至死后72 h。這些結(jié)果表明，即使尸體存在腐敗、自溶等死后現(xiàn)象，CD83 和HSF5 的mRNA 高表達(dá)在一定時(shí)間內(nèi)仍可檢測出，有望成為鑒別生前燒傷生活反應(yīng)指標(biāo)。為進(jìn)一步探索CD83 和HSF5 的法醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，檢測15 例人體皮膚燒傷樣本的mRNA 水平變化，為減少mRNA 降解對本實(shí)驗(yàn)的影響，實(shí)驗(yàn)測量了所有人體樣本的RIN，結(jié)果顯示所有樣本的RIN 均大于3，提示樣本mRNA 的完整性較好。在15 例人體樣本中，11 例CD83 和HSF5 的mRNA 升高，4 例沒有明顯變化，該情況是否與個(gè)體差異有關(guān)還要進(jìn)一步驗(yàn)證?？傮w來講，本研究由于客觀條件受限，符合實(shí)驗(yàn)要求的燒傷人體樣本數(shù)量不足，無法對人體樣本相同部位mRNA 進(jìn)行檢測，未排除不同人體部位mRNA 表達(dá)水平可能不一致的情況，以上問題都可能對結(jié)果造成影響。后續(xù)研究我們將進(jìn)一步完善各種不足，深入探究燒傷皮膚中的mRNA 變化，尋找可靠的生活反應(yīng)指標(biāo)。

綜上所述，本研究通過建立小鼠皮膚燒傷模型以及人體燒傷組織樣本驗(yàn)證，探索了CD83 及HSF5 在鑒別生前燒傷和死后焚尸中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，CD83 和HSF5 mRNA 有望作為皮膚燒傷生活反應(yīng)指標(biāo)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐。