周 昊 陳虹霞 陶 冉 葉建中 王成章

（1.中國林業(yè)科學研究院林產化學工業(yè)研究所，生物質化學利用國家工程實驗室，國家林業(yè)和草原局林產化學工程重點實驗室，江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

松樹是我國的主要樹種之一，廣泛分布于東北及華北地區(qū)，是重要的木材和松脂生產原料[1-2]。我國松樹有20 余種，資源面積超過1 400 萬hm2[3]。次生代謝產物是林木的重要組成部分，對林木顏色、抗性、防腐性、強度、滲透性等性質具有很大影響[4-9]。松木中含有豐富的次生代謝產物。研究表明：其中的酚類和萜類成分對松木材防腐、抗蟲等性能具有重要影響。任琴等[10]研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松中萜類化合物的組成、含量和組成差異與抗性之間有明顯的相關性，對松木抗病蟲害具有重要作用。李堅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，落葉松甲醇提取物對一些腐朽菌具有很好的抑制能力。目前，針對不同品種松木的次生代謝產物，有關其化學組成與木材防腐性相關的研究鮮有報道。因此，本研究以6 種不同品種的松木材為原料，通過溶劑浸提得到不同品種松木的石油醚和甲醇提取物，采用液質聯(lián)用法（LCMS）和氣質聯(lián)用法（GC-MS），分別對甲醇提取物和石油醚提取物的化學成分進行分析。同時，對不同品種松木的石油醚和甲醇提取物的主要成分和含量進行比較，并采用牛津杯法檢測不同品種松木的石油醚和甲醇提取物對木腐菌（密粘褶菌）的抑制效果。通過評價松木中關鍵次生代謝產物對木材防腐性能的影響，為松木木材保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolicaLitv.）、落葉松[Larix gmelinii(Rupr.) Kuzen.]、花旗松[Pseudotsuga menziesii(Mirb.) Franco]、輻射松（Pinus radiataD.Don）、馬尾松（Pinus massonianaLamb.）、油松（Pinus tabuliformisCarr.）6 種松木芯材由江蘇省長山林場提供；密粘褶菌[Gloeophyllum trabeum(Pers.: Fr.) Murr.]由中國林科院菌種保存中心提供；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）購于南京庫侖生物科技有限公司；甲醇、石油醚等化學試劑均為分析純，購于南京化學試劑有限公司。

1.2 設備

往復式水浴恒溫搖床（SHA-82A 型，常州金壇精達儀器制造有限公司）；電子天平（BSA224S 型，德國賽多利斯公司）；旋轉蒸發(fā)儀（RE-2000A 型，上海亞榮生化儀器廠）；質譜儀（XEVO-G2XS-QTOF-MS，美國waters公司）；氣相色譜質譜聯(lián)用儀（7890A/5975C，美國安捷倫公司）。

1.3 提取物制備

將6 種松木樣品切成小段，粉碎備用。分別取松木粉末100 g，加入到1 000 mL的圓底燒瓶中，加入500 mL的石油醚，90 ℃條件下回流提取2 h，提取2 次后，合并2 次的提取液，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收石油醚，所得沉淀物即為松木石油醚提取物。

松木經(jīng)石油醚提取后得到脫脂松木粉，分別取脫脂松木粉200 g，加到1 000 mL的圓底燒瓶中，加入500 mL的甲醇溶液，75 ℃條件下回流提取2 次，每次2 h，合并2 次甲醇提取液，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收甲醇，所得沉淀物即為松木甲醇提取物。

1.4 松木石油醚提取物GC-MS分析[12-17]

稱取松木石油醚提取物0.1 g，用色譜正己烷溶液置于10 mL容量瓶中定容，隨后用0.45 μm有機微孔濾膜過濾，將濾液置于進樣瓶內進行GC-MS分析。

GC測試條件：色譜柱為HP-5石英毛細管柱 (30 m ×0.25 mm × 0.25 μm)；柱溫80 ℃下，保持5 min；然后升溫(5 ℃/min)至250 ℃；再保持20 min；進料量為1 μL；載氣為He；載氣流量1 mL/min；分流比50∶1。

質譜測試條件：EI離子源溫度230 ℃；注入口溫度為250 ℃；電子能量70 eV。采用Wiley 275 標準譜庫檢索定性。

1.5 松木甲醇提取物LC-MS分析[18-20]

稱取松木甲醇提取物0.1 g，用色譜甲醇溶液置于10 mL容量瓶中定容，隨后用0.45 μm有機微孔濾膜過濾，將濾液置于進樣瓶內進行LC-MS分析。

LC測試條件：色譜柱：Cosmosil 5C18- MS-Ⅱ（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，80% B；5～35 min，80%B→44% B；35～45 min，44% B→40% B；45～65 min，40%B；65～75 min，40% B→80% B；75～80 min，80 %B）；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL。

MS測試條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，采用多反應監(jiān)測掃描模式；噴霧電壓4.5 k V；毛細管溫度350 ℃；吹掃氣壓力137.9 kPa；輔助氣流速為10 mL/min；掃描范圍為100～1 000 m/z；二級質譜碰撞能量（CID）：20 eV。采用UNIFI數(shù)據(jù)庫進行化合物鑒定。

1.6 抑菌性能試驗[21-22]

1.6.1 菌種活化與擴大培養(yǎng)

將密粘褶菌的菌種斜面接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。將活化后的菌種繼續(xù)接種到PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃ 條件下220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)36 h，使菌株在液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。

1.6.2 抑菌效果檢測

分別稱取松木甲醇提取物或石油醚提取物0.1 g，用水溶解加入10 mL容量瓶中定容待用。將已滅菌的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)10 mL 熔化倒入培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，吸取0.4 mL菌液均勻涂布于培養(yǎng)基上，分別在每個培養(yǎng)皿中央呈對稱放置2 個滅菌后的牛津杯（內徑6 mm，外徑7.8 mm，高10 mm），依次滴入0.3 mL松木甲醇提取物或石油醚提取物溶液，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱，30 ℃ 恒溫恒濕箱培養(yǎng)72 h，測量抑菌圈直徑并記錄。

2 結果與分析

2.1 不同品種松木石油醚提取物GC-MS分析

采用GC-MS對6個松木品種的石油醚提取物進行測定，確定各組成成分，采用峰面積歸一化法計算各成分相對百分含量，結果見表1。由表1可知，從6種松木石油醚提取物中共鑒定出45種化合物，主要為萜類、酯類和脂肪酸等。其中樟子松鑒定出16種，落葉松鑒定出9種，花旗松鑒定出20種，輻射松鑒定出17種，馬尾松鑒定出9種，油松鑒定出11種；總相對百分含量分別為96.82%，97.81%，98.63%，92.26%，99.96%和97.23%?？梢钥闯?，6種松木石油醚提取物主要含有長葉烯、石竹烯、氧化石竹烯、6-十八烯酸、脫氫樅酸和松香酸等化合物。此外，落葉松還含有較多量的13-表淚杉醇（21.63%）；花旗松含有較多量的2,6-二羥基-苯甲酸（6.73%）、5-氟-2-甲基苯甲酸（9.38%）和4α-[(R)-1,5-二甲基-3-氧代己基]-1-環(huán)己烯-1-羧酸（24.50%）；輻射松含有較多量的1,4-二甲基-2-硝基-咪唑（13.19%）和6，6-二甲基-10-亞甲基-1-氧雜-螺[4.5]癸烷（15.15%）；馬尾松含有較多量的1-羥基-6-(3-異丙烯基-環(huán)丙基-1-烯基)-6-甲基-庚-2-酮（6.90%）和2-氯-3-硝基-9,10-蒽二酮（5.25%）；油松含有較多量的γ-欖香烯（5.85%）和2-氯-3-硝基-9,10-蒽二酮（7.89%）。

表1 不同品種松木石油醚提取物的化學成分分析Tab.1 Chemical composition analysis of petroleum ether fractions of di☆erent pine varieties

（續(xù)表1）

2.2 不同品種松木甲醇提取物LC-MS分析

采用LC-MS對6 個松木品種的甲醇提取物進行測定，確定各組成成分，并記錄各化合物的響應值，結果見表2。由表2 可知，從6 種松木甲醇提取部位中共鑒定出59 種主要化合物，主要為酚類、有機酸類和黃酮類等。其中，樟子松鑒定出32 種，落葉松鑒定出44 種，花旗松鑒定出53 種，輻射松鑒定出48 種，馬尾松鑒定出37 種，油松鑒定出48 種?？梢钥闯觯@6 種松木的甲醇提取物共有成分主要是正丁苯酞、莪術烯、氧葉B、蓬莪術環(huán)二烯、二氫-N-甲基異石榴皮堿、催吐蘿芙木醇、金釵石斛素、14-去氧穿心蓮內酯、(10E)1,10-十七烷-二烯-4,6-二炔-3,8,9-三醇、鄰苯二甲酸丁醇異丁醇二酯、二氫獼猴桃內酯、鄰苯二甲酸酐、1-羥基蒽醌、傘形花內酯和桑酮。此外，樟子松還含有較多量的6,7-去氫青蒿酸、落葉松脂素、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸、(+)-1-羥基松脂素、3-叔丁基-4-甲氧基苯酚、臭靈丹酸等；落葉松含有較多量的遠志訕酮Ⅱ、3-硫酸基槲皮素、異落葉松脂素、6,7-去氫青蒿酸、反對香豆酸、弗斯生、澤瀉萜醇 C、臭靈丹酸、白及聯(lián)菲醇 D、2,4,6-三羥基苯乙酮-2,4-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘氨膽酸、鉤狀石斛素等；花旗松含有較多量的遠志訕酮Ⅱ、3-硫酸基槲皮素、(+)-1-羥基松脂酚、異落葉松脂素、裂環(huán)異落葉松脂素、芳姜黃酮、弗斯生、臭靈丹酸、乙酸-β-松油酯、白及聯(lián)菲醇 D、2,4,6-三羥基苯乙酮-2,4-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、甘氨膽酸、鉤狀石斛素、赤式-二羥基脫氫二松柏醇、3-O-乙酰基-咖啡酸等；輻射松含有較多量的對羥基苯甲蘋果酸、6,7-去氫青蒿酸、落葉松脂素、1,4-二羥基-2-甲氧基苯、弗斯生、松屬素、土荊皮酸 C2、13-羥基-9,11-十六烷二烯酸、白及聯(lián)菲醇 D、赤式-二羥基脫氫二松柏醇等；馬尾松含有較多量的6,7-去氫青蒿酸、(+)-1-羥基松脂素、弗斯生、松屬素、土荊皮酸 C2、白及聯(lián)菲醇 D、赤式-二羥基脫氫二松柏醇、13-羥基-9,11-十六烷二烯酸等；油松含有較多量的異落葉松脂素、芳姜黃酮、臭靈丹酸、3,3',5,5'-四甲氧基-反-茋、脫氫樅酸、松屬素、土荊皮酸 C2、白及聯(lián)菲醇 D、赤式-二羥基脫氫二松柏醇、13-羥基-9,11-十六烷二烯酸等。

（續(xù)表2）

2.3 不同品種松木石油醚和甲醇提取物的抑菌性

采用牛津杯法分別檢測了6 種松木的石油醚和甲醇提取物對密粘褶菌的抑制效果，結果見圖1～3。由圖可見，6 種松木的石油醚和甲醇提取物對密粘褶菌的生長均具有一定抑制作用。6 種松木石油醚提取物對密粘褶菌的抑菌能力大小為：馬尾松＞油松＞樟子松＞輻射松＞花旗松＞落葉松；6 種松木甲醇提取物對密粘褶菌的抑菌能力大小為：花旗松＞輻射松＞油松＞馬尾松＞落葉松＞樟子松。此外，可以看出松木石油醚提取物的抑菌效果優(yōu)于甲醇提取物，可能是因為在石油醚提取物含有更多的萜類物質和有機酸[23-25]。

圖1 6 種松木石油醚和甲醇提取物的抑菌圈大小Fig.1 Inhibition zone sizes of 6 pine petroleum ether and methanol extraction sites

圖2 6 種松木石油醚提取物的抑菌效果圖Fig.2 Bacteriostatic e☆ect of six pine petroleum ether extraction sites

圖3 6 種松木甲醇提取物的抑菌效果圖Fig.3 Bacteriostatic e☆ect of methanol extraction sites of 6 pine species

3 結論

1） 6種松木石油醚提取物主要包含萜類、酯類和脂肪酸等成分。其中，花旗松的提取物種類和含量較高；松木石油醚提取部位主要含有長葉烯、石竹烯、氧化石竹烯、6-十八烯酸、脫氫樅酸和松香酸等化合物。

2） 6種松木甲醇提取物主要包含酚類、有機酸類和黃酮類等成分。共有成分主要為正丁苯酞、莪術烯、催吐蘿芙木醇、金釵石斛素、二氫獼猴桃內酯、1-羥基蒽醌、傘形花內酯和桑酮等。

3） 6種松木的石油醚和甲醇提取物均能抑制密粘褶菌的生長，石油醚提取物的抑菌能力大小為：馬尾松＞油松＞樟子松＞輻射松＞花旗松＞落葉松；甲醇提取物的抑菌能力大小為：花旗松＞輻射松＞油松＞馬尾松＞落葉松＞樟子松；松木石油醚提取物的抑菌效果優(yōu)于甲醇提取物。