秦啟偉

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，海洋生物資源保護(hù)與利用粵港澳高校聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)免疫與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

病毒是一類(lèi)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的微小生物，一般是在蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹一種脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)作為遺傳物質(zhì)。病毒沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無(wú)法獨(dú)立生長(zhǎng)及復(fù)制，只有借助宿主細(xì)胞才能完成自身的復(fù)制和繁衍，是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物[1]。病毒盡管結(jié)構(gòu)和組成極其簡(jiǎn)單，卻是對(duì)人類(lèi)及其他動(dòng)物生存威脅最大的病原之一。2019年12月爆發(fā)的SARS-CoV-2導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019, COVID-19)，僅用2個(gè)月就席卷全球，截至2021年10月6日，全球累計(jì)感染約2.37億人，死亡人數(shù)超483萬(wàn)。人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)、乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)和禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)等病毒也嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康、動(dòng)物安全和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展等。魚(yú)類(lèi)等水生動(dòng)物棲息在水中，環(huán)境復(fù)雜多變，深受病毒感染的威脅。目前，已從養(yǎng)殖或野外魚(yú)類(lèi)當(dāng)中分離到多種病毒性病原，如神經(jīng)壞死癥病毒(Nervous necrosis virus，NNV)、石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus， ISKNV)和草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)等[2]。這些病毒已成為嚴(yán)重威脅水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的最重要病原之一，病毒性疾病一旦暴發(fā)，無(wú)法有效治理，易造成重大經(jīng)濟(jì)損失，危害嚴(yán)重。因此，對(duì)病毒侵染宿主過(guò)程的詮釋是認(rèn)識(shí)、預(yù)防及控制病毒性疾病暴發(fā)的重要途徑。

病毒侵染細(xì)胞是一個(gè)多步驟且與多種細(xì)胞結(jié)構(gòu)相作用的極復(fù)雜過(guò)程，主要包括進(jìn)入、運(yùn)輸、脫殼、復(fù)制、子代病毒組裝和釋放等一系列步驟[3]。如圖1所示，病毒侵染起始于病毒與細(xì)胞膜的黏附接觸，一般通過(guò)多糖-蛋白復(fù)合物的低親和靜電相互作用，繼而病毒與受體特異性結(jié)合，并通過(guò)膜融合或內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入方式和機(jī)制復(fù)雜多變。病毒進(jìn)入細(xì)胞之后，常常被分選至內(nèi)體囊泡中，并借助細(xì)胞骨架運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核或近核區(qū)等特定部位，釋放病毒核酸，啟動(dòng)病毒基因復(fù)制和蛋白表達(dá)。這些新合成的病毒蛋白和病毒核酸逐步成熟并被運(yùn)輸?shù)讲《狙b配位點(diǎn)，組裝完成的子代病毒通過(guò)出芽、胞吐或裂解細(xì)胞而釋放到細(xì)胞外，又可感染新的宿主細(xì)胞[2]。

圖1 動(dòng)物病毒生命周期(修改自Gao等)[4]Fig.1 Animal virus life cycle(modified from Gao et al)[4]

病毒侵染細(xì)胞，不僅病毒與細(xì)胞之間的相互作用是動(dòng)態(tài)的，而且細(xì)胞自身也處于不斷動(dòng)態(tài)變化中[5]。通過(guò)傳統(tǒng)生物化學(xué)、分子生物學(xué)和透射電子顯微鏡等技術(shù)，可以分析病毒在某個(gè)特定時(shí)間、空間、平均化的感染情況，但是難以獲得病毒侵染的動(dòng)態(tài)過(guò)程和詳細(xì)機(jī)制。隨著生物物理學(xué)、化學(xué)和材料科學(xué)的快速發(fā)展及在生物學(xué)的滲透，研究非均勻體系實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化的單病毒示蹤(Single-virus tracking，SVT)技術(shù)的建立，使得研究人員能夠追蹤單個(gè)或多個(gè)病毒粒子的侵染過(guò)程，可視化、實(shí)時(shí)檢測(cè)病毒-細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，更加全面精細(xì)地闡述病毒侵染的時(shí)空動(dòng)態(tài)過(guò)程及機(jī)制。

雖然單病毒示蹤技術(shù)目前主要應(yīng)用在高等哺乳動(dòng)物病毒研究中，但是已開(kāi)始逐步應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)病毒感染機(jī)制研究中。本文中將系統(tǒng)介紹單病毒示蹤技術(shù)的方法體系，總結(jié)該技術(shù)在病毒特別是魚(yú)類(lèi)病毒感染機(jī)制研究中的成果，并對(duì)該技術(shù)應(yīng)用于病毒學(xué)研究的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

1 單病毒示蹤技術(shù)體系

從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，基于光學(xué)顯微鏡的單病毒示蹤技術(shù)使人類(lèi)能夠?qū)崟r(shí)親眼“看到”病毒如何感染宿主細(xì)胞，將人類(lèi)的視野聚焦到單粒子水平病毒的可視化研究。1980年，Helenius等[6]首次在固定的動(dòng)物細(xì)胞中檢測(cè)到單個(gè)熒光標(biāo)記的西門(mén)利克森林病毒(Semliki forest virus, SFV)。1981年，Barak等[7]實(shí)時(shí)追蹤活細(xì)胞中的單個(gè)低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL)-受體復(fù)合物，這是首次報(bào)道在活細(xì)胞中進(jìn)行的單粒子示蹤(Single-particle tracking, SPT)試驗(yàn)。1985年，發(fā)展出了更適合二維SPT的成像技術(shù)和圖像分析算法，為單病毒示蹤技術(shù)奠定了基礎(chǔ)[8-13]。1988年， Bachi等對(duì)單個(gè)呼吸道合胞體病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)的出芽和融合過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)觀察[4]。1990年，Lowy等觀察了單個(gè)流感病毒-細(xì)胞融合[5]。同年，Georgi等利用熒光顯微鏡在活細(xì)胞中檢測(cè)到單個(gè)呼腸孤病毒(Reovirus serotype 1)并追蹤了其侵染細(xì)胞的早期階段[6]。此后，多色熒光標(biāo)記病毒粒子的示蹤、三維空間單病毒示蹤技術(shù)及動(dòng)物體內(nèi)的病毒示蹤等相繼被報(bào)道，單病毒示蹤技術(shù)成為研究病毒侵染機(jī)制的有力工具[7-20]。

單病毒示蹤是一種使用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的單個(gè)病毒粒子或病毒組分的實(shí)時(shí)成像技術(shù)(圖2)，是SPT技術(shù)在病毒學(xué)領(lǐng)域的具體應(yīng)用。借助單病毒示蹤技術(shù)，研究人員可以觀察單個(gè)病毒粒子或病毒組分與活細(xì)胞相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程，實(shí)時(shí)獲取病毒侵染過(guò)程中重要或關(guān)鍵分子事件[21-22]。例如，病毒如何啟動(dòng)進(jìn)入，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程中相關(guān)宿主蛋白在空間和時(shí)間上發(fā)生怎樣的變化，病毒基因組釋放在細(xì)胞內(nèi)何時(shí)何地進(jìn)行等。這些信息的獲得能夠最本質(zhì)和最真實(shí)地揭示病毒侵染和致病等生命活動(dòng)，對(duì)病毒學(xué)研究具有重大意義。

圖2 單病毒示蹤熒光顯微成像系統(tǒng)[5]Fig.2 Fluorescence microscopes for single-virus imaging[5]

1.1 熒光標(biāo)記單粒子

要成功示蹤單個(gè)病毒粒子，首先必須對(duì)目標(biāo)粒子和感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行足夠數(shù)量且不影響生物活性及細(xì)胞功能的熒光標(biāo)記。能夠進(jìn)行標(biāo)記的理想熒光探針應(yīng)具有的特點(diǎn)包括耐光和不易發(fā)生光漂白，高吸光系數(shù)和高量子產(chǎn)率，易被激發(fā)，熒光強(qiáng)度波動(dòng)小，體積小，以及對(duì)標(biāo)記的病毒或宿主影響小等。在活細(xì)胞中，較長(zhǎng)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的熒光探針可避免激發(fā)光的光毒性，且易與細(xì)胞自發(fā)熒光信號(hào)區(qū)分。目前，病毒標(biāo)記常用的熒光標(biāo)記物主要包括有機(jī)熒光染料、熒光蛋白和量子點(diǎn)等。

1.1.1 有機(jī)熒光染料 有機(jī)熒光染料是含有共軛雙鍵、苯環(huán)等結(jié)構(gòu)的小分子化合物，具有尺寸小、易合成、種類(lèi)多(基本覆蓋了從紫外到近紅外的光譜范圍)等優(yōu)勢(shì)，在熒光成像領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。常見(jiàn)的熒光染料包括氰色素類(lèi)(如Cy2、Cy3、Cy5)、Alexa Fluor染料家族(如Alexa Fluor488、Alexa Fluor598、Alexa Fluor647)、親脂性染料(如DiO、DiI、DiD)等，以及一些具有特殊性質(zhì)的有機(jī)熒光染料，如pH敏感熒光染料(CypHer5)和靶向核酸染料(SYTO和Hoechst系列)等。Seisenberger等[23]通過(guò)共價(jià)化學(xué)反應(yīng)用Cy5染料標(biāo)記腺病毒的衣殼，詳細(xì)闡述了該病毒在活細(xì)胞內(nèi)的侵染過(guò)程。Van der Schaar等[24]和Lakadamyali等[25]用親脂性染料DiD標(biāo)記病毒包膜，分別研究了流感病毒、登革熱病毒(Dengue virus，DenV)的侵染路徑。

1.1.2 熒光蛋白 綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是由下村修在20世紀(jì)60年代早期從維多利亞多管發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)并純化[26]。經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展，熒光蛋白的光譜已經(jīng)覆蓋從紫外到近紅外光譜，廣泛應(yīng)用于生物成像領(lǐng)域[27-28]。Rietdorf等[29]利用GFP標(biāo)記的牛痘病毒(Vaccinia virus, VV)觀察了其從病毒組裝的近核位點(diǎn)到細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)。除了常見(jiàn)的GFP、YFP和RFP等熒光蛋白，研究人員還開(kāi)發(fā)出許多特殊性質(zhì)的熒光蛋白，如pH敏感的熒光蛋白、光激活熒光蛋白和雙分子互補(bǔ)熒光蛋白等。Hogue等[30]用pH敏感GFP標(biāo)記偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)并追蹤了其運(yùn)動(dòng)和胞吐。

1.1.3 量子點(diǎn) 量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)，又稱(chēng)為發(fā)光半導(dǎo)體納米微晶體，最早是在20世紀(jì)80年代制備得到，其光譜可以隨量子點(diǎn)的大小、形狀和組成的變化而變化，目前已經(jīng)覆蓋藍(lán)色到近紅外的光譜范圍。量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)(單一波長(zhǎng)的光可同時(shí)激發(fā)多顏色的量子點(diǎn))、較大的斯托克斯位移、熒光強(qiáng)度高、抗光漂白能力強(qiáng)、熒光壽命較長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，比傳統(tǒng)的有機(jī)染料發(fā)射熒光更強(qiáng)、光穩(wěn)定性更好，在熒光成像方面展現(xiàn)出極大的發(fā)展?jié)摿31-32]。Liu等[33]利用QDs標(biāo)記流感病毒，并在三維空間尺度追蹤了與Rab5和Rab7相關(guān)的病毒感染過(guò)程。Lü等[34]用QDs標(biāo)記PRV并進(jìn)一步分析了病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑。

1.2 熒光顯微鏡成像系統(tǒng)

標(biāo)記好的病毒粒子需在具備檢測(cè)器靈敏度高、成像速度快、激發(fā)體積小等性質(zhì)的熒光顯微鏡下觀察，目前，落射熒光顯微鏡(Epifluorescence microscopy)、共聚焦顯微鏡(Confocal microscopy)和全內(nèi)反射熒光顯微鏡(Total internal reflection fluorescence microscopy)是最常用的3種熒光顯微鏡裝置[5]。

1.2.1 落射熒光顯微鏡 落射熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，利用平行光束照射大范圍樣品區(qū)域，并用高數(shù)值孔徑物鏡收集來(lái)自樣品的發(fā)射光，具有成像景深大、信號(hào)損失小、快速寬場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可用于長(zhǎng)距離追蹤病毒運(yùn)動(dòng)[5，35]。由于成像景深大，且細(xì)胞本身有自發(fā)熒光會(huì)產(chǎn)生背景噪音，落射熒光顯微鏡成像的信噪比低，不適合對(duì)熒光信號(hào)較弱的病毒粒子進(jìn)行追蹤。

1.2.2 共聚焦顯微鏡 共聚焦顯微鏡是單病毒示蹤中常用的一種成像裝置。共聚焦顯微鏡在普通的顯微鏡基礎(chǔ)上，以激光作為光源，在光路中加入了相對(duì)于物鏡焦平面共軛的照明針孔與探測(cè)針孔，使樣品中只有處于焦平面的部分能夠被激發(fā)光照射，且只有焦平面處發(fā)射的熒光被光檢測(cè)器接收，有效地降低了成像的背景噪音，同時(shí)實(shí)現(xiàn)Z軸方向不同焦平面的連續(xù)成像，完成對(duì)樣品的三維成像。但是，這種成像技術(shù)也會(huì)導(dǎo)致信號(hào)損失。常用的共聚焦顯微鏡主要包括點(diǎn)掃描式和轉(zhuǎn)盤(pán)式兩種。點(diǎn)掃描式共聚焦顯微鏡通過(guò)激光掃描頭逐點(diǎn)逐行地掃描樣品，成像速度較慢。轉(zhuǎn)盤(pán)式共聚焦顯微鏡在點(diǎn)掃描式共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，其光路中使用多個(gè)微透鏡-針孔聚焦模組構(gòu)成的陣列替代傳統(tǒng)的單個(gè)透鏡-針孔聚焦模組，并置于高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤(pán)上，實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)成像，同時(shí)，利用高靈敏的電荷耦合器件(Charge coupled device,CCD)對(duì)熒光信號(hào)同時(shí)采集，有效地提高了成像速度[36-37]。

1.2.3 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 全內(nèi)反射熒光顯微鏡屬于寬場(chǎng)成像技術(shù)，以入射光(角度足夠大)照射在兩個(gè)折射率不同的介質(zhì)的臨界面(如細(xì)胞和玻璃基底的界面)發(fā)生全內(nèi)反射時(shí)產(chǎn)生的消逝波作為激發(fā)光，激發(fā)靠近臨界面區(qū)域約200 nm以?xún)?nèi)的熒光信號(hào)，從而有效避免樣品其他區(qū)域的熒光干擾，提高信噪比和成像質(zhì)量。然而，該成像技術(shù)也因此受限于研究接近細(xì)胞表面的生命活動(dòng)[38]。

此外，近年來(lái)快速發(fā)展的突破光學(xué)衍射極限的超分辨熒光顯微鏡，如受激發(fā)射損耗顯微鏡(Stimulated emission depletion microscopy,STED)、結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(Structured illumination microscopy,SIM)、光激活定位顯微鏡(Photoactivation localization microscopy,PALM)和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(Stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)，使人們能夠在更微小的尺度追蹤病毒的生命過(guò)程[22]。

1.3 熒光圖像數(shù)據(jù)分析

活細(xì)胞成像獲得的系列圖像，每一組可能由成百上千幀圖像組成，而每一幀圖像包含上百萬(wàn)字節(jié)的數(shù)據(jù)，需要通過(guò)一系列的計(jì)算機(jī)算法在大量的圖像信息中進(jìn)行圖片信號(hào)處理、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等，從而獲得病毒粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡、運(yùn)動(dòng)速率、運(yùn)動(dòng)方式等[5]。這一系列的圖像處理分析方法，主要包括降低圖像背景噪音、病毒顆粒的精確定位、軌跡重建和軌跡分析等(圖3)。

圖3 單病毒示蹤圖像處理過(guò)程(修改自Brandenburg等)[5]Fig.3 Procedure of image analysis of single-virus tracking technology(modified from Brandenburg et al)[5]

1.3.1 粒子定位 在試驗(yàn)條件下，單個(gè)病毒粒子的熒光信號(hào)與背景信號(hào)和噪音相比較弱，使得背景信號(hào)和噪音容易被作為假性峰值檢測(cè)到，因此，獲得的原始圖像首先要經(jīng)過(guò)空間濾波器如二維高斯卷積算法來(lái)降噪，然后再對(duì)圖像中的病毒粒子進(jìn)行高精度定位[39-40]。目前，已經(jīng)發(fā)展出數(shù)種高精度的粒子定位算法如反卷積技術(shù)、二維高斯擬合和質(zhì)心法等以精確地確定粒子的位置，這些算法大多基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)實(shí)現(xiàn)光斑定位[41-42]。二維高斯擬合法是最常用的一種算法，對(duì)光斑的定位精度高，可以精確到幾納米，但是需要反復(fù)迭代，計(jì)算速度慢。質(zhì)心法計(jì)算簡(jiǎn)單且速度快，但是容易受背景噪音干擾，定位精度較低。

1.3.2 粒子軌跡重建 軌跡重建就是將同一個(gè)顆粒在不同幀圖像中的坐標(biāo)按時(shí)間順序連接在一起。這一步最大的困難是需要保證所連接的坐標(biāo)確實(shí)來(lái)自同一個(gè)顆粒，因?yàn)橥粡垐D像中多個(gè)粒子可以被定位，距離較近的粒子會(huì)干擾判斷，并且這些粒子在活細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)往往非常復(fù)雜，包括粒子碰撞、融合、分裂、跳躍和閃爍等，這些問(wèn)題導(dǎo)致粒子運(yùn)動(dòng)軌跡重建的步驟非常復(fù)雜。目前，已有不同的自動(dòng)化算法可實(shí)現(xiàn)軌跡重建[43-44]。這些算法通常利用粒子光斑大小、距離、熒光強(qiáng)度等參數(shù)來(lái)判斷不同幀圖像的病毒粒子是否為同一粒子。Jaqaman等[44]基于代價(jià)矩陣建立了多假設(shè)算法來(lái)解決復(fù)雜的光斑合并、拆分與閃爍等問(wèn)題。

1.3.3 粒子軌跡分析 對(duì)重建的軌跡進(jìn)行分析，可以獲得病毒的運(yùn)動(dòng)速率、均方位移、擴(kuò)散系數(shù)，以及與其他蛋白或細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間共定位時(shí)間、熒光強(qiáng)度的變化等，從而定量地獲得一系列病毒運(yùn)動(dòng)相關(guān)的參數(shù)。粒子的瞬時(shí)運(yùn)動(dòng)速度是粒子運(yùn)動(dòng)相關(guān)的重要參數(shù)之一，基于重建的粒子軌跡，可以獲得粒子在不同幀圖像間的運(yùn)動(dòng)距離，結(jié)合拍攝圖像的時(shí)間間隔，就可以獲得粒子在不同時(shí)間點(diǎn)的瞬時(shí)運(yùn)動(dòng)速度。另外，根據(jù)粒子的均方位移(mean-square displacement, MSD，即粒子在一段時(shí)間內(nèi)平方距離的平均值)與時(shí)間間隔的依賴(lài)關(guān)系可以對(duì)粒子運(yùn)動(dòng)模式進(jìn)行分類(lèi)，進(jìn)一步獲得粒子運(yùn)動(dòng)的擴(kuò)散系數(shù)、擬合速度等參數(shù)。粒子運(yùn)動(dòng)模式主要包括擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)、定向運(yùn)動(dòng)、非正常擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)和受限運(yùn)動(dòng)[45-46]。

除了獲得粒子運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)模式和擴(kuò)散系數(shù)等外，病毒粒子在不同幀圖像的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化規(guī)律、聚集和解聚以及與其他熒光信號(hào)的定位情況等也可以被進(jìn)一步分析。

2 單病毒示蹤在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用

目前，國(guó)內(nèi)外許多課題組，包括莊小威、龐代文、崔宗強(qiáng)和王宏達(dá)等許多學(xué)者帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)，推動(dòng)了單病毒示蹤技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，使人類(lèi)“看到”病毒如何感染宿主細(xì)胞。

2.1 病毒黏附

一些病毒如鼠白血病病毒(Murine leukemia virus，MLV)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)、HIV、水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、小鼠多瘤病毒樣顆粒(Murine polyoma virus-like particle，MPy VLP)、人乳頭瘤病毒-16假病毒(Human papillomavirus-16 pseudovirus，HPV-16 PsV)、VV、1型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type 1, HSV-1)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)等，到達(dá)細(xì)胞表面后，能夠以依賴(lài)微絲的方式在細(xì)胞表面運(yùn)動(dòng)[47-52]。HPV-16 PsV在細(xì)胞表面具有4種典型運(yùn)動(dòng)模式，包括小區(qū)域(直徑30～60 nm)內(nèi)的受限運(yùn)動(dòng)、緩慢漂移的受限運(yùn)動(dòng)、突然終止的快速隨機(jī)運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)距離的線性定向運(yùn)動(dòng)。HPV-16 PsV的定向運(yùn)動(dòng)大多是在沿著細(xì)胞表面富含微絲的突起如絲狀偽足或收縮纖維上進(jìn)行的，且運(yùn)動(dòng)速度也與微絲收縮的速度相似[5]。甲型流感病毒(Influenza A virus)到達(dá)細(xì)胞表面也顯示了4種不同的運(yùn)動(dòng)模式，包括受限、定向的彈射(速度高達(dá)1～2 μm/s)、漂移和混合模式等，并且病毒的不同運(yùn)動(dòng)模式受細(xì)胞表面黏附因子濃度的影響[53]。

通過(guò)常規(guī)的生物學(xué)分析法去了解病毒結(jié)合如何誘導(dǎo)受體聚集或者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的詳細(xì)機(jī)制是非常困難的，因?yàn)椴《竞褪荏w之間的相互作用常常發(fā)生在一瞬間。實(shí)時(shí)追蹤犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)依賴(lài)網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞過(guò)程，研究人員發(fā)現(xiàn)，大部分CPV衣殼蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptors，TfR)小于5個(gè)，大約25%結(jié)合有TfR的病毒側(cè)向擴(kuò)散到達(dá)進(jìn)入位點(diǎn)，76%的CPV由于病毒衣殼和細(xì)胞受體之間的低親和力結(jié)合而在內(nèi)吞之前脫離細(xì)胞膜[54]。

2.2 病毒進(jìn)入

通過(guò)單病毒示蹤技術(shù)，能觀察病毒進(jìn)入活細(xì)胞的精細(xì)過(guò)程。流感病毒(Influenza virus)和VSV誘發(fā)網(wǎng)格蛋白從頭組裝[39，55-56]，而CPV和DenV則進(jìn)入細(xì)胞膜上已經(jīng)裝配好的網(wǎng)格蛋白有被小窩(Clathrin-coated pit, CCPs)[54, 57]。另外，流感病毒能夠同時(shí)利用兩種途徑進(jìn)入細(xì)胞：大部分病毒粒子促進(jìn)CCPs的從頭合成，從而通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞；而其余病毒粒子通過(guò)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴(lài)型的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。通過(guò)這兩種方式進(jìn)入的流感病毒粒子表現(xiàn)出相似的運(yùn)輸過(guò)程，并且具有相似的基因釋放效率[39]。

實(shí)時(shí)追蹤SV40病毒粒子與GFP熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜微囊，結(jié)果表明，大多數(shù)SV40與細(xì)胞膜微囊共定位，激活酪氨酸激酶并重聚微絲形成actin tail位于包含病毒粒子的細(xì)胞膜微囊，經(jīng)過(guò)動(dòng)力蛋白依賴(lài)的頸部收縮后，包含SV40的細(xì)胞膜微囊離開(kāi)細(xì)胞膜，沿著微管向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)動(dòng)[58-61]。

2.3 病毒的胞內(nèi)運(yùn)輸

病毒進(jìn)入細(xì)胞之后，常常借助細(xì)胞骨架進(jìn)行胞內(nèi)運(yùn)輸。大部分病毒粒子依賴(lài)微管運(yùn)動(dòng)，HSV、流感病毒、SV40、HIV、SFV和手足口病毒(Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)等病毒粒子能以數(shù)微米每秒的速度沿微管運(yùn)輸[25，59, 62-66]。但也有少量的病毒只依賴(lài)微絲運(yùn)動(dòng)，并且具有不可思議的高速度。脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)只依賴(lài)微絲進(jìn)行快速的不定向運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)速度高達(dá)5 μm/s[67]。乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HbsAg)也被發(fā)現(xiàn)只依賴(lài)微絲進(jìn)行快速的胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)[68]。

很多病毒粒子的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程同時(shí)依賴(lài)微管和微絲。流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)可被分為3個(gè)階段，首先流感病毒粒子在細(xì)胞膜內(nèi)邊緣區(qū)域依賴(lài)微絲的運(yùn)動(dòng)，隨后由動(dòng)力蛋白介導(dǎo)的沿著微管向近細(xì)胞核區(qū)域的快速運(yùn)動(dòng)，最后在近核區(qū)沿著微管進(jìn)行雙向的往復(fù)運(yùn)動(dòng)[25]。同樣地，在三維空間尺度實(shí)時(shí)追蹤HIV病毒粒子的運(yùn)動(dòng)發(fā)現(xiàn)，HIV在胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)會(huì)依賴(lài)微管和微絲[66]。

2.4 病毒脫殼

病毒進(jìn)入細(xì)胞后，要將自身基因組從衣殼的包裹中釋放到細(xì)胞質(zhì)特定位點(diǎn)或細(xì)胞核中，才能啟動(dòng)后續(xù)復(fù)制。用熒光染料Syto 82和CypHer5分別標(biāo)記PV的RNA和衣殼，在熒光顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察病毒的基因組釋放，發(fā)現(xiàn)PV的RNA釋放只發(fā)生在病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞之后靠近細(xì)胞膜的囊泡中[21]。這個(gè)研究解決了長(zhǎng)久以來(lái)有關(guān)PV的RNA釋放位點(diǎn)的爭(zhēng)論。Qin等[69]用量子點(diǎn)標(biāo)記流感病毒的vRNP，追蹤了單個(gè)病毒的脫殼過(guò)程，發(fā)現(xiàn)病毒8個(gè)vRNP在脫殼過(guò)程中以單獨(dú)而非組團(tuán)的方式從晚期內(nèi)體釋放到細(xì)胞質(zhì)，每個(gè)vRNA均以典型的三階段運(yùn)動(dòng)模式進(jìn)入細(xì)胞核，而后又以?xún)煞N不同的擴(kuò)散模式運(yùn)動(dòng)到其復(fù)制位點(diǎn)。

大部分DNA病毒和一些RNA病毒在其基因組釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后必須經(jīng)歷核運(yùn)輸來(lái)啟動(dòng)病毒后續(xù)感染事件。腺病毒(Adenovirus)通過(guò)kinesin-1介導(dǎo)與NPC相作用，完全破壞衣殼釋放DNA入核[70]，而且只有6%～48%的病毒DNA能進(jìn)入細(xì)胞核，即使增加感染細(xì)胞的病毒數(shù)量，進(jìn)入細(xì)胞核的病毒DNA也不能隨之增加，運(yùn)輸病毒DNA的位點(diǎn)可能是有限的[71]。含有FLAsH標(biāo)記的整合酶的HIV在經(jīng)過(guò)微管依賴(lài)的運(yùn)動(dòng)、微絲依賴(lài)的運(yùn)動(dòng)及核膜上的受限運(yùn)動(dòng)后，在細(xì)胞核內(nèi)還將進(jìn)行擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)[66]。研究者普遍認(rèn)為，完整的HIV-1不能入核且脫殼發(fā)生在細(xì)胞核膜附近，然而，Burdick等[72]追蹤GFP標(biāo)記病毒衣殼蛋白的HIV-1脫殼過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)，完整(或近乎完整)的病毒會(huì)在脫殼前進(jìn)入細(xì)胞核并完成逆轉(zhuǎn)錄，在基因組整合之前1.5 h內(nèi)且靠近(<1.5 μm)基因整合位點(diǎn)處開(kāi)始脫殼，豐富了人們對(duì)于HIV-1脫殼機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

2.5 子代病毒粒子的組裝和釋放

病毒復(fù)制的子代基因組如何運(yùn)動(dòng)是存在已久的問(wèn)題。流感病毒在細(xì)胞核中完成基因組復(fù)制后，其vRNPs從細(xì)胞核通過(guò)循環(huán)內(nèi)體向細(xì)胞膜附近運(yùn)輸[73]。Chen等[74]通過(guò)單粒子示蹤發(fā)現(xiàn)，大部分HIV-1的RNA在細(xì)胞質(zhì)中以不依賴(lài)細(xì)胞骨架的非定向、隨機(jī)漫步的方式運(yùn)動(dòng)，并且不受病毒Gag(Group-specific antigen)蛋白是否表達(dá)的影響。

MLV傾向于在細(xì)胞之間的接觸區(qū)域裝配子代病毒，在細(xì)胞接觸區(qū)域發(fā)生的病毒裝配比非接觸區(qū)域約高10倍[75]。細(xì)胞內(nèi)具有囊膜的VV病毒粒子從核周的裝配區(qū)域通過(guò)微管向細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)[5]。這些病毒粒子與細(xì)胞膜融合，成為與細(xì)胞連接的細(xì)胞相關(guān)囊膜病毒(Cell-associated enveloped virus)[76]。VV的囊膜蛋白B5R激活Src家族激酶，進(jìn)而磷酸化病毒蛋白A36R，接著使微絲聚合形成典型的肌動(dòng)蛋白尾，從而促進(jìn)病毒在細(xì)胞之間的擴(kuò)散[77]。裝配完成的ASFV子代病毒粒子同樣沿著微管向細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)，隨后借助微絲聚合從細(xì)胞中釋放[78-79]。

此外，Liu等[80]基于Halo Tag定點(diǎn)標(biāo)記病毒衣殼的重組PRV并結(jié)合多樣的Halo Tag標(biāo)簽蛋白熒光配體，對(duì)親代病毒進(jìn)入、胞內(nèi)運(yùn)輸，以及子代病毒衣殼組裝、在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)進(jìn)行研究，完成了對(duì)PRV完整的生命周期的示蹤。

3 單病毒示蹤技術(shù)在水生動(dòng)物病毒研究中的應(yīng)用

除了哺乳動(dòng)物病毒，單病毒示蹤技術(shù)也逐漸應(yīng)用于水生動(dòng)物病毒侵染機(jī)制研究。本課題組利用小分子熒光染料對(duì)純化的SGIV粒子進(jìn)行熒光標(biāo)記，在共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)追蹤SGIV侵染宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程。SGIV能夠沿著細(xì)胞表面的絲狀偽足樣突起到達(dá)細(xì)胞表面后進(jìn)入細(xì)胞(圖4(a))，或者隨著細(xì)胞表面突起的收縮而到達(dá)細(xì)胞表面(圖4(b))；進(jìn)入細(xì)胞的病毒粒子分別與早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體和溶酶體共定位，并沿微絲和微管運(yùn)動(dòng)，瞬時(shí)速度可達(dá)0.9 μm/s，分別破壞微絲和微管后，病毒粒子運(yùn)動(dòng)受到顯著影響；同時(shí)結(jié)合特異性抑制劑和共定位分析，本課題組發(fā)現(xiàn)，SGIV進(jìn)入細(xì)胞的方式與其他虹彩病毒明顯不同，SGIV進(jìn)入細(xì)胞通過(guò)pH、dynamin依賴(lài)的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞，而不通過(guò)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞；并且首次發(fā)現(xiàn)虹彩病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的途徑亦包括巨胞飲(圖4(c))[81]。

圖4 SGIV侵染宿主細(xì)胞[81]Fig.4 SGIV infests host cells[81]

通過(guò)自主建立的基于原子力顯微鏡(Atom force microscopy, AFM)的微觀生物力測(cè)量新方法——力示蹤技術(shù)，首次研究SGIV侵染宿主細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)機(jī)制。病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞的位移峰值分別為(180.2±21.6)、(81.0±6.2)nm，分別對(duì)應(yīng)于病毒粒子連接在探針尖端或側(cè)面時(shí)進(jìn)入細(xì)胞的情況；兩種情況下，病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞的時(shí)間分別為(1.42±0.68)、(0.82±0.06)s，病毒粒子的最大瞬時(shí)速度約為200 nm/s。而應(yīng)用恒定位置模式的力示蹤技術(shù)能夠測(cè)量單個(gè)SGIV病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞的作用力，單個(gè)SGIV病毒粒子受到細(xì)胞的內(nèi)吞作用力為(60.8±18.5)pN[82]。相關(guān)研究結(jié)果極大地豐富了對(duì)虹彩病毒進(jìn)入方式的認(rèn)識(shí)，也拓展了單病毒粒子示蹤技術(shù)在水生動(dòng)物大分子DNA病毒研究中的應(yīng)用。

魚(yú)類(lèi)傳染性造血組織壞死癥病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)、大菱鲆呼腸孤病毒(Scophthalmus maximus reovirus，SMReV)、草魚(yú)呼腸孤病毒(GCRV)和對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)等水生動(dòng)物病毒分別被量子點(diǎn)或小分子熒光染料標(biāo)記進(jìn)行了單病毒示蹤分析。量子點(diǎn)標(biāo)記的IHNV 通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入魚(yú)類(lèi)宿主細(xì)胞，在早期內(nèi)吞小泡通過(guò)微絲運(yùn)輸進(jìn)入胞漿，然后通過(guò)微管運(yùn)輸?shù)竭_(dá)早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體，最后到達(dá)溶酶體，IHNV沿微管運(yùn)動(dòng)可持續(xù)數(shù)秒，瞬時(shí)運(yùn)動(dòng)速度約0.59 μm/s[83]。量子點(diǎn)標(biāo)記的SMReV結(jié)合到細(xì)胞膜上可以在數(shù)秒內(nèi)通過(guò)新生的CCP進(jìn)入細(xì)胞，且大部分病毒能夠在感染30 min內(nèi)以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，而后先借助微絲在近膜區(qū)運(yùn)動(dòng)而后依賴(lài)微管向細(xì)胞中心運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)速度約0.23 μm/s[84]。GCRV經(jīng)過(guò)量子點(diǎn)標(biāo)記后，同樣被觀察到沿微管運(yùn)動(dòng)[85]。DiO/DiD標(biāo)記的WSSV在細(xì)胞中可能利用溶酶體進(jìn)行運(yùn)輸[86]。

目前，應(yīng)用單病毒示蹤技術(shù)進(jìn)行研究的水生動(dòng)物病毒還比較少，尚屬于起步階段。

4 存在問(wèn)題及展望

單病毒示蹤技術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究病毒感染宿主細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程和機(jī)制，包括病毒進(jìn)入、運(yùn)輸、基因組傳遞和子代病毒組裝和釋放等。作為一項(xiàng)多學(xué)科交叉發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，單病毒示蹤技術(shù)的發(fā)展得益于化學(xué)、物理、計(jì)算機(jī)、細(xì)胞生物學(xué)和病毒學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域研究人員的共同努力。隨著這些學(xué)科的不斷發(fā)展，單病毒示蹤技術(shù)也處于持續(xù)快速發(fā)展中，然而單病毒示蹤技術(shù)仍面臨一些問(wèn)題與挑戰(zhàn)。

4.1 單病毒示蹤技術(shù)研究存在問(wèn)題與挑戰(zhàn)

1)病毒標(biāo)記物選擇。大部分病毒粒子尺寸很小，且感染過(guò)程可能持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，就要求用于單病毒示蹤的熒光標(biāo)記物必須具備優(yōu)異的性能，要求標(biāo)記物熒光信號(hào)強(qiáng)、穩(wěn)定性高、抗淬滅、無(wú)毒性、尺寸盡可能小、操作簡(jiǎn)便且不影響病毒感染活性。然而，目前常用的標(biāo)記物仍存在不同的問(wèn)題。有機(jī)熒光染料尺寸小、使用方便，可通過(guò)簡(jiǎn)便快速的操作與病毒囊膜、衣殼或核酸偶聯(lián)，但熒光強(qiáng)度較弱、易淬滅且需要純化病毒。并且對(duì)于尺寸很小(如粒子直徑20～30 nm)的病毒，在不引起染料分子間自淬滅效應(yīng)(self-quenching effects)和病毒感染活性的情況下，能夠連接到病毒粒子的熒光染料數(shù)量是非常受限的。熒光蛋白可以通過(guò)常規(guī)的基因操作手段特異性地標(biāo)記病毒成分，但操作繁瑣、熒光強(qiáng)度較弱、尺寸較大且可能影響病毒活性。量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度高、耐光漂白，但尺寸較大、存在非特異性吸附且可能影響病毒感染力。

2)制備多色標(biāo)記病毒。病毒的完整生命周期包括進(jìn)入、運(yùn)輸、脫殼、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、組裝和釋放，熒光標(biāo)記的病毒如何在整個(gè)感染過(guò)程持續(xù)地以高分辨率被監(jiān)測(cè)仍是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。病毒的不同組分都可以被熒光標(biāo)記，衣殼和囊膜有更多的標(biāo)記物和標(biāo)記方法可供選擇，但是病毒內(nèi)部組分如病毒核酸被熒光標(biāo)記是比較困難的。只有衣殼或囊膜被標(biāo)記的病毒粒子可以用于示蹤病毒早期感染過(guò)程，但是不適于病毒感染過(guò)程的持續(xù)示蹤，如觀察病毒核酸復(fù)制、子代病毒粒子組裝和釋放等過(guò)程。因此，制備多色標(biāo)記不同結(jié)構(gòu)的病毒才能更好地對(duì)病毒感染過(guò)程進(jìn)行持續(xù)地觀察。如何高效地?zé)晒鈽?biāo)記病毒核酸、子代病毒，有效地區(qū)分親代病毒和子代病毒，同時(shí)標(biāo)記病毒的不同組分包括囊膜、衣殼和核酸，這些問(wèn)題的解決仍有待進(jìn)一步的探討。

3)成像技術(shù)。病毒感染過(guò)程涉及大量的宿主蛋白和病毒蛋白之間的相互作用，有些作用過(guò)程是比較快速或稀少的，往往需要更高的時(shí)間分辨率和空間分辨率來(lái)高效捕捉相關(guān)過(guò)程。理想的成像技術(shù)具有成像快速、分辨率高、自動(dòng)對(duì)焦、三維成像等性能。目前常用的熒光顯微鏡仍存在成像速度和分辨率較難同時(shí)兼顧，且儀器操作繁瑣等問(wèn)題。共聚焦顯微鏡操作相對(duì)簡(jiǎn)便，且適合活細(xì)胞成像，但受限于分辨率，無(wú)法清晰成像小于200 nm的結(jié)構(gòu)。三維成像比二維成像能提供更多的信息，而三維成像也依賴(lài)于高時(shí)空分辨率的成像儀器。

4)活體成像。單病毒示蹤技術(shù)目前主要應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞中示蹤病毒，是一個(gè)簡(jiǎn)化的病毒感染模型。要充分了解病毒感染機(jī)制，需要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)。追蹤病毒侵染動(dòng)物活體的過(guò)程，有助于研究者探討病毒如何突破機(jī)體的防御屏障，如何在不同組織不同細(xì)胞間傳播等問(wèn)題。然而，由于活體成像技術(shù)的局限，動(dòng)物活體內(nèi)單個(gè)病毒的實(shí)時(shí)追蹤仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

5)圖像信息分析。分析獲得的圖像數(shù)據(jù)，必須精確定位圖像中的病毒粒子，并將同一個(gè)病毒粒子在每一幀圖像中的位置連接，從而構(gòu)建病毒粒子軌跡。然而，由于病毒在活細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)復(fù)雜，特別是當(dāng)大量病毒感染細(xì)胞時(shí)，粒子之間的干擾增強(qiáng)，如何用合適的算法獲得最真實(shí)的粒子軌跡，是一個(gè)不小的挑戰(zhàn)。另外，病毒粒子從接觸細(xì)胞表面開(kāi)始到最終完成子代病毒粒子的組裝和釋放，要經(jīng)歷一系列復(fù)雜的步驟，并且與宿主細(xì)胞的多種蛋白、結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用。在此過(guò)程中，各種各樣的病毒運(yùn)動(dòng)軌跡可以被追蹤到，而這些軌跡可能對(duì)應(yīng)于不同的事件，可能是病毒無(wú)法突破細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞，可能是病毒進(jìn)入細(xì)胞的不同方式，可能是病毒到達(dá)復(fù)制位點(diǎn)的“必經(jīng)之路”，可能是病毒“誤入歧途”而無(wú)法到達(dá)特定的復(fù)制位點(diǎn)。因此，病毒粒子的每一條運(yùn)動(dòng)軌跡都包含了大量的信息，如何快速、準(zhǔn)確、盡可能多地提取有用信息仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。目前的軌跡信息主要包括病毒運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)模式、擴(kuò)散系數(shù)、共定位情況等，如何更深入探究病毒運(yùn)動(dòng)軌跡與病毒感染進(jìn)程以及病毒與細(xì)胞的相互作用關(guān)系，仍有待進(jìn)一步的探索。

4.2 未來(lái)重點(diǎn)研究方向

針對(duì)目前存在的問(wèn)題，未來(lái)應(yīng)在以下幾個(gè)方面開(kāi)展重點(diǎn)研究。

1)完善病毒標(biāo)記技術(shù)。繼續(xù)開(kāi)發(fā)光學(xué)性能更優(yōu)良、尺寸更小的有機(jī)染料、熒光蛋白、標(biāo)簽蛋白、量子點(diǎn)和其他納米粒子等，以減少病毒示蹤過(guò)程中的熒光淬滅、細(xì)胞毒性等問(wèn)題，為病毒標(biāo)記提供更多選擇。除了常用的熒光蛋白、熒光染料和量子點(diǎn)等，生物正交反應(yīng)、核酸適配體等為病毒標(biāo)記提供了新的思路。同時(shí)，優(yōu)化現(xiàn)有標(biāo)記方法，開(kāi)發(fā)新的標(biāo)記方法，建立更加特異、高效且盡可能降低對(duì)病毒活性影響的標(biāo)記技術(shù)。這些都是目前制約病毒示蹤技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵，也是亟待解決的問(wèn)題，需要化學(xué)、物理和生物等交叉領(lǐng)域的研究者共同合作。

2)發(fā)展成像技術(shù)。目前，新的成像技術(shù)仍是亟需的。超分辨成像技術(shù)將光學(xué)顯微鏡的分辨率推進(jìn)到了10 nm的量級(jí)，使研究者能在很高的空間分辨率下觀察病毒感染過(guò)程。同時(shí)，研究者還可嘗試將不同類(lèi)型的顯微鏡聯(lián)合應(yīng)用，如STORM-AFM成像平臺(tái)、常溫超分辨光鏡-常溫電鏡融合成像技術(shù)、冷凍超分辨光鏡-冷凍電鏡融合成像技術(shù)，以及包括超分辨光學(xué)STED成像模塊、CARS成像模塊和AFM成像模塊等多模塊聯(lián)用的高分辨多功能化學(xué)成像系統(tǒng)。此外，發(fā)展活體成像儀器，建立可以應(yīng)用于活體水平的單病毒示蹤技術(shù)，為在體追蹤病毒感染奠定基礎(chǔ)。

3)優(yōu)化圖像處理技術(shù)。結(jié)合物理、數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)的前沿技術(shù)，優(yōu)化、發(fā)展圖像分析算法，特別是利用計(jì)算機(jī)視覺(jué)和人工智能機(jī)器學(xué)習(xí)等前沿方法，提高算法的自動(dòng)化和個(gè)性化程度，無(wú)需手動(dòng)反復(fù)調(diào)試算法的相關(guān)參數(shù)，從而提高圖像處理效率，降低手動(dòng)分析產(chǎn)生的誤差，以實(shí)現(xiàn)精確定位圖像中的病毒粒子及重構(gòu)其運(yùn)動(dòng)軌跡，提取具有相似特征的軌跡，對(duì)同一軌跡不同時(shí)刻的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行精細(xì)區(qū)分，從而便于研究者從成百上千條病毒運(yùn)動(dòng)軌跡中發(fā)現(xiàn)、總結(jié)規(guī)律，深入探究病毒侵染機(jī)制。