陳秀紅, 李 坤, 靳 爽, 張中冕

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院 腫瘤科, 河南 鄭州, 450014)

非小細胞肺癌(NSCLC)的常見病理類型包括腺癌(LUAD)及鱗癌(LUSC)[1]。目前, NSCLC的治療已經(jīng)實現(xiàn)了從細胞毒藥物階段、分子靶向治療階段向以免疫檢查點抑制劑為代表的免疫治療階段的顯著改變，尤其是免疫治療進展迅速，在NSCLC、腎癌、霍奇金淋巴瘤等多種腫瘤治療中均有獲益，但總體療效仍不理想[2]。免疫治療主要機制包括了程序性死亡受體-1(PD1)及其配體(PD-L1)通路的阻斷, PD-L1及PD1為免疫治療的重要靶點; PD-L1廣泛表達于癌細胞、抗原呈遞細胞等，與PD1的結合可導致T淋巴細胞功能受損，故PD-L1抑制劑特異性靶向PD-L1蛋白可以避免腫瘤細胞免疫逃逸的發(fā)生[3]。PD-L1作為典型的跨膜結構域蛋白，多項研究[4-9]揭示其轉運相關的關鍵調(diào)控因子如二甲雙胍、趨化素樣因子超家族(CMTM)、亨廷頓相互作用蛋白1相關蛋白(HIP1R)、外泌體以及各種翻譯后修飾，其中的糖基化、磷酸化、棕櫚?；头核鼗绕渲匾?。糖基化的PD-L1影響參與泛素化過程酶的磷酸化，阻斷了泛素E3連接酶識別PD-L1, 從而影響PD-L1泛素化。PD-L1磷酸化影響其從內(nèi)質網(wǎng)至高爾基體的轉運，缺失磷酸化的PD-L1被內(nèi)質網(wǎng)相關降解蛋白消除。棕櫚?；ㄟ^阻斷PD-L1泛素化保持PD-L1的穩(wěn)定，抑制溶酶體對PD-L1的降解[10]。

卵巢腫瘤泛素異肽酶1(OTUB1)是卵巢腫瘤域蛋白酶去泛素酶家族成員之一，在腫瘤及神經(jīng)退化等疾病中發(fā)揮重要作用，作用機制包括了下調(diào)泛素化調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性等[11]。近期研究[12]發(fā)現(xiàn)，OTUB1阻止內(nèi)質網(wǎng)相關PD-L1降解，明確包括了乳腺癌、肺癌、腎癌及肝癌細胞系等。目前OTUB1在NSCLC組織方面的研究較少，NSCLC中OTUB1是否存在對PD-L1表達的調(diào)節(jié)有待進一步探索，也能為提高免疫治療效果提供可選擇方案。本研究通過評價腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(TCGA)中NSCLC組織及癌旁正常組織的OTUB1 mRNA差異性，回顧性分析NSCLC組織及癌旁正常組織中OTUB1蛋白差異性?；诨虮磉_譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)探討數(shù)據(jù)庫中NSCLC的OTUB1與PD-L1 mRNA相關性，采用免疫組織化學染色(IHC)測定NSCLC組織中OTUB1及PD-L1蛋白表達，探究兩者相關性及OTUB1表達與臨床特征及對無復發(fā)生存期(RFS)的影響，探討非小細胞肺癌免疫治療的可能方向，闡明NSCLC可能的發(fā)生機制及新的RFS預測因素。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫Genomic Date Commons Portal(GDC)(https: //portal.gdc.cancer.gov) (2021年4月30日)中下載LUAD(n=535)及癌旁正常組織(n=59)和LUSC(n=502)及癌旁正常組織(n=49)的OTUB1 表達數(shù)據(jù)，下載的OTUB1表達數(shù)據(jù)類型為采用轉錄組測序技術(RNA-Seq)所獲得的HTSeq-FPKM數(shù)據(jù)[13]; 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析其數(shù)據(jù)庫下載的NSCLC中OTUB1與PD-L1 mRNA表達相關性[14]。

1.2 組織樣本來源

收集2016年6月—2019年12月鄭州大學第二附屬醫(yī)院病理確診為NSCLC并接受了肺癌切除術及淋巴結清掃術的患者的癌組織46例及癌旁正常肺組織蠟塊包埋樣本41例。納入標準: 病理確診為NSCLC、明確的TNM分期、完整的隨訪記錄及臨床信息(包括年齡、性別、吸煙史、分化程度及轉移淋巴結數(shù)等)、至少接受術后標準治療者。排除標準: 術前接受放化療、免疫治療、其他腫瘤病史、死因非肺癌患者。NSCLC者46例，中低分化15例，高分化31例; Ⅰ～Ⅱ期30例, Ⅲ期16例; 年齡29～74歲，有吸煙史26例，無吸煙史20例; 肺鱗癌22例，肺腺癌24例，癌旁正常組織41例。截至2021年5月30日，對所有患者隨訪，包括門診隨訪、入院檢查及電話回訪。無復發(fā)生存期(RFS)指手術至腫瘤復發(fā)或者任何原因死亡的時間(以月為單位)。本臨床研究方案經(jīng)鄭州大學第二附屬醫(yī)院倫理學委員會批準(倫理批件號2021209)。

1.3 免疫組織化學(IHC)及評分

IHC染色采用的試劑來自單克隆兔抗OTUB1抗體(affbiotech, 編號DF9998)和多克隆兔抗PD-L1抗體(Abcam, 編號ab213524)。實驗步驟如下: 石蠟切片脫蠟、水化及修復, 3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗(OTUB1為1∶400, PD-L1為1∶150)后4 ℃過夜; 加二抗孵育, DAB顯色、蘇木素復染及脫水封片。PD-L1根據(jù)腫瘤比例評分(TPS)標準: 即任何染色強度的PD-L1膜染色的腫瘤細胞在所有腫瘤細胞中所占百分比，定義膜染色有0分(<1%)、1分(1%～<50%)、2分(≥50%), 0分為陰性表達組，≥1分為陽性表達組。OTUB1評分標準: 隨機選取切片的5個視野(放大倍數(shù)400倍)，參考抗體說明書，按細胞質中染色強度評分: 即0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色); 結合陽性細胞所占百分比，評估為0分(≤5%)、1分(>5%～25%)、2分(>25%～50%)、3分(>50%～75%)和4分(>75%)。OTUB1表達以0～4分為陰性表達, 5～12分為陽性表達。病理切片由鄭州大學第二附屬醫(yī)院2位病理醫(yī)師獨立、盲法評分，分析PD-L1、OTUB1的表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用R軟件中“l(fā)imma”及“beeswarm”包分析來源于TCGA中癌組織與癌旁正常組織中OTUB1表達情況，應用wilcox. test統(tǒng)計分析并描繪散點圖。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，相關性分析采用Sperman等級相關分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗，對有意義的預后因素應用COX回歸多因素分析。計數(shù)資料采用頻數(shù)、率表示，比較采用χ2檢驗。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 NSCLC組織與癌旁正常組織中OTUB1mRNA及蛋白表達差異結果

TCGA下載的LUAD(n=535)及癌旁正常組織(n=59)的OTUB1 mRNA比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); TCGA下載的LUSC(n=502)及癌旁正常組織(n=49)的OTUB1 mRNA比較，差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。IHC顯示OTUB1主要表達于細胞質中，見圖2。46例肺癌組織中, OTUB1陽性28例(60.9%), 陰性18例(39.1%); 相應的41例癌旁正常組織中, OTUB1陽性15例(36.6%), 陰性26例(63.4%); 肺癌組織與癌旁正常組織的OTUB1表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 提示NSCLC組織中OTUB1 mRNA及蛋白表達均高于癌旁正常組織。

A: TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD及癌旁正常組織OTUB1 mRNA比較; B: TCGA數(shù)據(jù)庫中LUSC及癌旁正常組織OTUB1 mRNA比較。

2.2 NSCLC組織中OUTB1與PD-L1在mRNA、蛋白表達水平的相關性

基于GEPIA應用Spearman分析來自其數(shù)據(jù)庫中NSCLC的OTUB1與PD-L1 mRNA水平表達的相關性，結果顯示無相關性(r=-0.006,P=0.850), 見圖3。46例肺癌組織中, OTUB1陽性28例(60.9%), 陰性18例(39.1%); PD-L1陽性27例(58.7%), 陰性19例(41.3%); Spearman相關性分析提示兩者蛋白水平具有相關性(r=0.323,P=0.029)。

2.3 NSCLC組織中OTUB1表達與各臨床特征的關系

不同TNM分期患者OTUB1表達差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=4.278,P=0.039), 見表1。

表1 NSCLC組織中OTUB1表達與各臨床特征的關系

2.4 NSCLC患者術后RFS的影響因素分析

TNM分期(P<0.001)、轉移淋巴結個數(shù)(P=0.001)、分化程度(P=0.042)是RFS的影響因素; OTUB1陰性、陽性表達患者的中位RFS分別18、19個月，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLC患者術后RFS的影響因素分析(Kaplan-Meier法)

2.5 NSCLC患者術后RFS影響因素的多因素分析

根據(jù)Kaplan-Meier單因素分析結果，以轉移淋巴結數(shù)、分化程度、TNM分期建立COX多因素風險模型，結果提示分化程度(Hr=3.143, 95%CI為1.407～7.024,P=0.005)及TNM分期(Hr=3.467, 95%CI為1.425～8.435,P=0.006)是影響RFS的獨立危險因素，轉移淋巴結數(shù)不是影響RFS的獨立危險因素(Hr=2.267, 95%CI為0.859～5.980,P=0.098)。

3 討 論

近年來研究[15-16]表明, OTUB1在調(diào)控細胞增殖、代謝及代謝相關蛋白方面具有重要作用，并在胃腺癌、結直腸癌及前列腺癌中均發(fā)現(xiàn)了OTUB1的高表達。KARUNARATHNA U等[17]證實了OTUB1下調(diào)FOXM1泛素水平而促進乳腺癌細胞的增殖能力; IGLESIAS-GATO D等[18]也闡述了OTUB1上調(diào)二氫睪酮誘導的前列腺癌細胞株的侵襲力; 但有關肺癌中OTUB1的表達的相關研究卻較少。PD-L1作為免疫治療的主要研究點，除了在遺傳、表觀遺傳、轉錄及翻譯等方面進行研究外，其在蛋白泛素化方面的調(diào)控也逐漸成為研究的熱點[19]。本研究采用生物信息學與免疫組化實驗相結合的方法探討OTUB1在肺癌組織中的表達及臨床意義，發(fā)掘可能調(diào)控PD-L1的新方向。

相較于OTUB2等其它OTUB1家族成員, OTUB1在泛素鏈切割方面具有較高的特異性，僅對K48連接多聚泛素鏈切割，此方式也是OTUB1下調(diào)泛素化的經(jīng)典機制。除此之外, OTUB1通過與攜帶泛素的E2連接酶結合而阻止泛素向蛋白底物的轉移[20-21]。ZHU D等[12]發(fā)行BT-549及MDA-MB-231乳腺癌細胞系敲除OTUB1后PD-L1蛋白水平顯著降低，且OTUB1的缺失對其影響只限于蛋白水平，其mRNA豐度并未受到影響。其機制可能正是OTUB1發(fā)揮了去泛素化酶作用，使PD-L1蛋白保持了較低的泛素化狀態(tài)，避免其在胞質內(nèi)被內(nèi)質網(wǎng)相關降解復合體(ERAD)降解?；贕EPIA分析顯示, OTUB1 mRNA及PD-L1 mRNA無明顯相關性，一定程度上預測了兩者在基因水平上相互調(diào)控或者被同一因素調(diào)控的可能性較低。本實驗采用IHC首次發(fā)現(xiàn)了NSCLC組織中OTUB1與PD-L1蛋白呈正相關，佐證了兩者可能存在蛋白水平調(diào)節(jié)的假設，此假設也與乳腺癌中已證實了的OTUB1經(jīng)下調(diào)PD-L1泛素化而避免其被降解的機制相符合。ZHU D等[12]發(fā)現(xiàn)NSCLC的A549細胞中OTUB1缺失引起了OTUB1蛋白量下降，與本實驗結果一致。

研究[22-25]表明, PD-L1表達水平的升高與腎細胞癌、肺癌、卵巢癌、鼻咽癌等癌癥的抗PD-L1療效及生存預后較差相關。PD-L1作為膜蛋白的一種，大部分均經(jīng)歷了持續(xù)的代謝和內(nèi)化，其釋放的動態(tài)循環(huán)和調(diào)控影響了細胞膜上PD-L1的數(shù)量，目前的免疫治療可能只針對暫時暴露于細胞表面的PD-L1[8]。此結果為靶向PD-L1提供了新的調(diào)控點，也為增強免疫治療成效提供了可能性。本研究通過分析來源于TCGA中數(shù)據(jù)及IHC驗證發(fā)現(xiàn)了OTUB1較癌旁正常組織表達上調(diào)，提示了其在NSCLC發(fā)生中可能具有一定的作用。BAIETTI M F等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在OTUB1下調(diào)RAS泛素化激活下游MAPK通路，成為野生RAS型非小細胞肺癌發(fā)生的重要機制。LI Y等[27]研究卻揭示了OTUB1通過阻斷UbcH5降低P53泛素化，從而維持P53穩(wěn)定性，使得P53在介導細胞凋亡和抑制細胞增殖方面發(fā)揮作用。ZHOU Y等[15]研究亦發(fā)現(xiàn)了OTUB1陽性表達為肺腺癌早期事件，與本研究Ⅲ期患者中陽性表達率較高不一致，考慮可能與入組病例數(shù)較少、納入標準不同有關。

本研究的局限性: ① 本研究存在臨床納入病例數(shù)較少的問題，缺乏大規(guī)模臨床入組。② OTUB1與PD-L1相關性僅局限于人肺腺癌、肺鱗癌病理類型，兩者之間mRNA關系僅來自于生物信息學分析。③ 由于實驗條件限制，缺乏肺癌細胞系中OTUB1與PD-L1蛋白水平相關性的驗證，即在NSCLC細胞系中敲除OTUB1 mRNA, 行PD-L1 mRNA及蛋白水平檢測，在NSCLC中OTUB1調(diào)節(jié)PD-L1的具體機制尚需進一步研究驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中OTUB1與PD-L1蛋白水平呈正相關，在NSCLC中也呈現(xiàn)高表達，提示OTUB1可能是PD-L1潛在的調(diào)節(jié)機制中至關重要的一環(huán)，也表明其在NSCLC發(fā)生中可能發(fā)揮一定的作用。