吳婉琴, 江 豐, 范小龍, 陳 冉, 朱曉玲, 曹 琦,朱正偉, 朱松松, 王會(huì)霞

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心, 湖北 武漢 430075)

在食品中違法添加中藥材對(duì)人體健康具有潛在或顯性的危害,就中藥材的性質(zhì)而言,中藥材都有功能主治、適用人群、用法用量,具有與食品完全不同的功效和服用禁忌。但是,一些食品生產(chǎn)企業(yè)受利益的驅(qū)動(dòng),只顧中藥材功效而忽視其毒性和副作用,在所謂的“食療”、“養(yǎng)生”等食品中違法添加中藥材,例如:含有生地的燉鴨煲調(diào)料包、含有木香、白術(shù)的茶葉、含有女貞子和淫羊藿的椰園海寶(干制水產(chǎn)品)、含有紅豆杉和金櫻子的配制酒、含有杜仲和淫羊藿的飲料等。

在打擊向普通食品和保健食品中違法添加中藥材的行為過程中,監(jiān)管部門執(zhí)法人員只能通過查看產(chǎn)品配料表和到企業(yè)現(xiàn)場(chǎng)巡查等最傳統(tǒng)的方式來判斷食品中是否違法添加中藥材,但往往會(huì)因生產(chǎn)企業(yè)不如實(shí)標(biāo)注配料表或生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)非法添加的中藥材原料進(jìn)行隱藏等情況,形成監(jiān)管盲區(qū)。因此,食品中非法添加中藥材的鑒別工作在技術(shù)手段上面臨巨大的挑戰(zhàn)。

目前中藥材鑒別手段,主要有性狀鑒別[1]、顯微鑒別[2-4]、薄層鑒別[5-7]、中藥材特征圖譜[8-13]或指紋圖譜鑒定[14-17]、DNA條形碼分子鑒定[18-21]等方法,但是這些手段都是對(duì)中藥材原料的真?zhèn)舞b別,而對(duì)食品中違法添加中藥材的識(shí)別和鑒別,從本質(zhì)上可追溯為鑒定其違法添加中藥材的化學(xué)成分,而由于食品原料的多樣性、食品基質(zhì)和加工工藝的復(fù)雜性、加入的中藥材品種未知性等原因,導(dǎo)致所添加的中藥材在食品中可能與中藥材原料中的特征圖譜或指紋圖譜發(fā)生了變化,因而其不適用于食品中違法添加中藥材的鑒別。而目前在中藥材應(yīng)用較廣的DNA條形碼分子鑒定,是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定,但其在中藥材的鑒定中也具有一定的挑戰(zhàn),中藥材采收部位和時(shí)期的不同,導(dǎo)致DNA在組織中的降解程度不同,儲(chǔ)存時(shí)間和貯藏養(yǎng)護(hù)方式不當(dāng)也會(huì)影響中藥材質(zhì)量,從而影響DNA條形碼序列,而食品因其基質(zhì)不同以及加工工藝可能存在高溫和干燥過程的影響,均可能對(duì)中藥材的DNA條形碼序列造成影響,因此,單純憑借DNA條形碼分子鑒定食品中的中藥材具有一定的局限性。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF/MS)具有分析速度快、靈敏度和分辨率高、多組分同時(shí)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn),在分離分析復(fù)雜食品基質(zhì)中的內(nèi)源性組分和外來添加物中具有顯著優(yōu)勢(shì),大大提升了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的適用性,甚至不需要對(duì)照品,即可通過高精度的譜圖信息解析產(chǎn)品的特征組分。雖然,現(xiàn)在也存在中藥材中部分組分的質(zhì)譜庫(kù),但其所含化合物數(shù)量少,且化合物未與中藥材進(jìn)行關(guān)聯(lián),難以實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中中藥材的快速鑒別。

本研究通過建立“中藥材-特征組分”對(duì)應(yīng)清單,構(gòu)建了食品中常非法添加的62種中藥材中388種特征組分質(zhì)譜庫(kù),開發(fā)出一種基于HPLC-Q-TOF/MS信息的食品中中藥材鑒別方法,解決了食品中非法添加中藥材難以識(shí)別和確證的難題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜(Dionex Ultimate 3000)-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(SCIEX Triple TOF 5600+),配備Analyst 1.6工作站、Peak View定性篩查軟件、Library View數(shù)據(jù)庫(kù)軟件(美國(guó)SCIEX公司); Allegra X-15R型離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司); EDAA-2600T型超聲波清洗器(上海安譜科學(xué)儀器有限公司);渦旋混合器(美國(guó)TALBOYS公司); ME2002E分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)。

62種對(duì)照藥材:土茯苓、大薊、女貞子、山茱萸、川牛膝、川芎、丹參、五味子、升麻、巴戟天、木香、車前草、平貝母、玄參、生地黃、白及、白術(shù)、白芍、地骨皮、紅花、吳茱萸、杜仲、沙苑子、牡丹皮、蒼術(shù)、補(bǔ)骨脂、訶子、遠(yuǎn)志、佩蘭、刺五加、澤瀉、知母、羅布麻、金蕎麥、金櫻子、厚樸、枳殼、枳實(shí)、茜草、首烏藤、骨碎補(bǔ)、桑白皮、益母草、淫羊藿、菟絲子、銀杏葉、黃芪、湖北貝母、番瀉葉、蒲黃、蒺藜、墨旱蓮、刺玫果購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,側(cè)柏葉購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司,熟大黃、麥冬、天冬、購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司,蘆薈、紅景天、積雪草、柏子仁、桑枝購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,62種中藥材樣品和配制酒、代用茶、飲料樣品購(gòu)自電商平臺(tái),0.22 μm有機(jī)系濾膜(天津津騰公司),乙腈、甲醇均為色譜純(德國(guó)Merck公司),甲酸為質(zhì)譜純(美國(guó)Fisher Scientific公司),超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm, 25 ℃)(美國(guó)Millipore公司);其他試劑均為分析純。

1.2 儀器條件

1.2.1高效液相色譜條件

色譜柱:Thermo Accucore aQ色譜柱(150 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.3 mL/min;正離子掃描(ESI+)模式:流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液;負(fù)離子掃描(ESI-)模式:流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為超純水;采用二元梯度洗脫,洗脫程序:0～2 min, 5%A; 2～20 min, 5%A～95%A; 20～25 min, 95%A; 25～26 min, 95%A～5%A; 26～30 min, 5%A。

1.2.2TOF/MS工作條件

離子源:電噴霧離子源;ESI+模式下噴霧電壓5 500 V;ESI-模式下噴霧電壓4 500 V;離子源溫度550 ℃;氣簾氣241 kPa (35 psi);霧化氣:379 kPa(55 psi);輔助氣:379 kPa(55 psi);去簇電壓:60 V;碰撞能量:35 V;掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜,質(zhì)量采集范圍100～1 000 Da;全掃描二級(jí)質(zhì)譜,質(zhì)量采集范圍50～1 000 Da。質(zhì)量數(shù)校正液為10 mmol/L甲酸鈉溶液。

1.3 62種“中藥材-特征組分”對(duì)應(yīng)清單的構(gòu)建

依據(jù)衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號(hào))[22]中可用于保健食品的物品名單,確定食品中可能非法添加的62種中藥材原料清單,通過查閱文獻(xiàn)確定各中藥材多種特征組分對(duì)應(yīng)清單,每種中藥材包括5～10種特征組分,形成“中藥材-特征組分”對(duì)應(yīng)清單。

1.4 62種中藥材特征組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

1.4.1對(duì)照藥材提取液的制備

分別稱取62種對(duì)照藥材1.0 g于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇超聲提取10 min,靜置30 min后于4 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm有機(jī)系濾膜。

1.4.2中藥材特征組分高分辨質(zhì)譜庫(kù)的建立

依據(jù)“中藥材-特征組分”對(duì)應(yīng)清單,將對(duì)照藥材特征組分質(zhì)譜圖加入液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中:于Library View數(shù)據(jù)庫(kù)軟件中輸入每種對(duì)照藥材各特征組分的名稱(采用對(duì)照藥材名稱(序號(hào))-特征組分名稱的命名方式以期對(duì)篩查出的特征組分進(jìn)行藥材歸屬,如:淫羊藿1-淫羊藿苷、淫羊藿2-朝藿定A、淫羊藿3-朝藿定B、淫羊藿4-朝藿定C、淫羊藿5-寶藿苷Ⅰ、淫羊藿6-寶藿苷Ⅱ、淫羊藿7-2″-O-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ)、英文名稱、CAS號(hào)、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量,建立對(duì)照藥材各特征組分的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù);將采集的二級(jí)碎片離子圖譜添加至Library View數(shù)據(jù)庫(kù)軟件中相應(yīng)的特征組分化合物項(xiàng)下,由此建立對(duì)照藥材各特征組分的二級(jí)碎片離子譜庫(kù),包括離子采集模式、碰撞能量和特征碎片離子信息。

1.5 樣品前處理與靶向篩查分析

1.5.1樣品前處理

稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇超聲提取10 min,靜置30 min后于4 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm有機(jī)系濾膜。

1.5.2樣品靶向篩查分析

將待測(cè)樣品采集到的高分辨數(shù)據(jù)導(dǎo)入Peak View軟件,將建立好的對(duì)照藥材特征組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)化合物列表導(dǎo)入到Peak View軟件,設(shè)置鑒別方法參數(shù)、庫(kù)檢索參數(shù)后進(jìn)行匹配分析:化合物提取離子流響應(yīng)強(qiáng)度>100或信噪比(S/N)>5,母離子精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)碎片質(zhì)量數(shù)偏差設(shè)為±10 ppm,保留時(shí)間偏差設(shè)為±2.5%;數(shù)據(jù)庫(kù)綜合得分設(shè)置:質(zhì)量數(shù)偏差占比為20%,保留時(shí)間偏差占比為20%,同位素比值占比為20%,分子式匹配占比為20%,數(shù)據(jù)庫(kù)匹配占比為20%。通過與數(shù)據(jù)庫(kù)中的MS/MS譜圖及精確分子離子質(zhì)量數(shù)、碎片離子質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間等相關(guān)參數(shù)對(duì)比而自動(dòng)鑒定每個(gè)峰的候選物質(zhì)?；衔餀z出判定條件:綜合得分>70分,經(jīng)人工檢查化合物分子式、保留時(shí)間、一級(jí)同位素峰、一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)和二級(jí)碎片與譜庫(kù)化合物全部匹配。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜流動(dòng)相的優(yōu)化

ESI+模式下,比較考察了乙腈-5 mmol/L乙酸銨和乙腈-0.1%甲酸兩種流動(dòng)相體系,部分化合物在乙腈-5 mmol/L乙酸銨流動(dòng)相體系下峰形不佳出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,且峰響應(yīng)較差,故ESI+模式下選擇乙腈-0.1%甲酸流動(dòng)相體系。

ESI-模式下,比較考察了乙腈-水和乙腈-0.1%氨水兩種流動(dòng)相體系,部分化合物在乙腈-0.1%氨水流動(dòng)相體系下峰形不佳峰寬較大,響應(yīng)受到抑制,故ESI-模式下選擇乙腈-水流動(dòng)相體系。

2.2 “中藥材-特征組分”對(duì)應(yīng)清單表的建立

依據(jù)監(jiān)管信息、新聞報(bào)道、文獻(xiàn)資料,并結(jié)合前期研究初步形成可能非法添加的白術(shù)、杜仲、淫羊藿等中藥材原料及其多種特征組分對(duì)應(yīng)清單,并購(gòu)買原料進(jìn)行驗(yàn)證。最終形成的“中藥材-特征組分”對(duì)應(yīng)清單見表1。

表 1 “中藥材-特征組分”對(duì)應(yīng)清單表Table 1 Corresponding list of “traditional Chinese medicine-characteristic components”

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2.3 中藥材特征組分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

自建質(zhì)譜庫(kù)中每種對(duì)照藥材包括5～10種特征組分的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)和二級(jí)碎片離子譜庫(kù),共計(jì)62種中藥材中388種特征組分。部分信息見表2,具體信息見附表(http://www.chrom-China.com)。

2.4 樣品靶向篩查分析

采用本文建立的方法對(duì)市售62種中藥材樣品進(jìn)行分析篩查驗(yàn)證,62種中藥材樣品高分辨數(shù)據(jù)均可分別與已建立的62種對(duì)照藥材特征組分匹配一致,說明所建立的方法可有效篩查鑒別中藥材。

根據(jù)監(jiān)管信息、新聞報(bào)道并結(jié)合前期研究基礎(chǔ),常非法添加中藥材的食品主要有配制酒、代用茶以及飲料,故對(duì)市售的10批次配制酒樣品、10批次代用茶樣品和10批次飲料樣品進(jìn)行分析篩查,其中1批次配制酒樣品篩查匹配的化合物與淫羊藿藥材7種特征組分質(zhì)譜信息匹配一致,推斷該配制酒樣品中可能加入淫羊藿中藥材。該配制酒樣品靶向篩查結(jié)果見表3,配制酒樣品中淫羊藿7種特征組分與淫羊藿對(duì)照藥材7種特征組分碎片離子鏡像圖見圖1((上)樣品中淫羊藿特征組分碎片離子圖,(下)對(duì)照藥材中相應(yīng)的淫羊藿特征組分碎片離子圖)。

圖 1 配制酒樣品中淫羊藿特征組分的碎片離子鏡像圖Fig. 1 Spectral difference in results of characteristic components of epimedium in a prepared wine sample The upper part of each figure is the fragment ion diagram of the characteristic components of epimedium in the prepared wine sample, and the lower part is the fragment ion diagram of the corresponding characteristic components of epimedium in the control medicine.

3 結(jié)論

本文開發(fā)出一種高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀快速篩查鑒別食品中非法添加的62種中藥材的方法,本方法可以實(shí)現(xiàn)無標(biāo)準(zhǔn)品情況下中藥材的定性篩查,具有高通量、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷等特點(diǎn);針對(duì)監(jiān)管實(shí)際中常違法添加的中藥材原料進(jìn)行重點(diǎn)研究,解決了食品中非法添加的中藥材難以識(shí)別和確證的難題,以及原有利用個(gè)別標(biāo)志物無法初步反推添加的原料品種問題,克服了監(jiān)管部門執(zhí)法人員只能通過查看產(chǎn)品配料表和到企業(yè)現(xiàn)場(chǎng)巡查等最傳統(tǒng)的方式來判斷食品中是否違法添加中藥材造成的監(jiān)管盲區(qū),為打擊食品中非法添加中藥材違法行為提供技術(shù)方法和依據(jù)。

研究中所選定的易非法添加對(duì)照藥材種類目前僅包括可用于保健食品不可用于食品的種類,在后續(xù)的研究過程中應(yīng)該進(jìn)一步增加中藥材種類,包括不可用于保健食品的中藥材,更全面地扼制食品中違法添加中藥材行為的發(fā)生或發(fā)展,為監(jiān)管提供更全面的技術(shù)支持。