袁春妹 張能華* 傅躍青 陳興英 金燁 沈曉華

金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是一類寄居于人類呼吸道、鼻咽部及皮膚的條件致病菌，是導(dǎo)致醫(yī)院感染的主要病原體之一。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）對大環(huán)內(nèi)酯類、慶大霉素等常見抗菌素的耐藥率＞80%，對目前上市的所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥［1］，故MRSA被稱為“超級細菌”。研究顯示，金黃色葡萄球菌感染與導(dǎo)管及其他醫(yī)療設(shè)備感染相關(guān)［2］，80%的假體感染是由葡萄球菌引起［3］，而且這些感染均與其形成的生物膜相關(guān)，當金黃色葡萄球菌以生物膜的形式存在，其耐藥性和致病性大大增加，治療和根除更加困難。替加環(huán)素是新一代的甘氨酰環(huán)類抗菌藥物，抗菌譜廣且安全有效，在一定程度上還能破壞鮑曼不動桿菌的生物膜，但有關(guān)于替加環(huán)素與金黃色葡萄球菌生物膜的研究較少。本文主要探討不同濃度替加環(huán)素對MRSA生物膜的作用及其機制，為臨床治療及院感防控提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入研究的30株MRSA均來自于2013年1月至2017年12月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬嘉興市中醫(yī)院的住院患者，同一患者同一部位分離出的重復(fù)菌株不重復(fù)計入。質(zhì)控菌株：鉛黃腸球菌ATCC700327和金黃色葡萄球菌ATCC29213均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑 VITEK-Compact2型全自動微生物分析儀、VITEK比濁儀（法國梅里埃公司），ST-360酶標儀（上?？迫A有限公司），小型低速離心機（Thermo公司），PCR反應(yīng)擴增儀（BIO公司），StepOne型熒光定量PCR儀、Stepone plus型熒光定量PCR儀（ABI），96孔細胞培養(yǎng)板（NEST公司），1%結(jié)晶紫染色液（北京索萊寶），Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、溶葡萄球菌酶（上海生工生物工程股份有限公司），定量PCR試劑SG Fast qPCR Master Mix（加拿大ABI公司）。

1.3 研究方法 （1）細菌的分離與鑒定：按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》及VITEK-2型號全自動化微生物分析儀器操作手冊進行規(guī)范化操作，對分離純化的細菌進行鑒定。通過VITEK-2型號全自動化微生物分析儀器鑒定，并經(jīng)過mecA 基因進行MRSA菌種的確認。（2）藥物敏感試驗：按照2016版美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）的標準，應(yīng)用微量肉湯稀釋法測定30株實驗菌株對替加環(huán)素的最低抑菌濃度（minimal inhibititory concentration，MIC）和最低生物被膜清除濃度（minimal biofilm eradication concentration，MBEC），每株菌做3個復(fù)孔。其中，替加環(huán)素對MRSA的MIC值采用歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）標準，替加環(huán)素≤0.12為敏感。（3）生物膜形成能力定量測定：采用96孔聚苯乙烯板結(jié)晶紫染色法測定30株MRSA菌株體外培養(yǎng)不同時間段形成生物膜的能力。全功能微孔板酶標儀檢測各孔在570 nm處的吸光度值，即OD570值。OD570值判讀依據(jù)：當OD570≥2ODc時，為強生物膜形成株；當ODc≤OD570＜2ODc時，為弱生物膜形成株；當OD570＜ODc時，為無生物膜形成株。（4）不同濃度的替加環(huán)素作用下生物膜形成定量測定：采用96孔聚苯乙烯板結(jié)晶紫染色法測定亞抑菌濃度及亞生物膜清除濃度替加環(huán)素作用下生物膜的變化。（5）不同濃度替加環(huán)素作用下生物膜相關(guān)基因的測定：按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明進行操作，將提取MRSADNA保存在-20 ℃。應(yīng)用熒光定量PCR測定icaA、sar、fnbA、agrI基因的相對表達量。生物膜相關(guān)基因相對表達量差異采用比較Ct值法（2-（ΔΔCt））公式計算：ΔCt=Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt（校準樣品）-ΔCt（實驗樣本），改變倍數(shù)=2-（ΔΔCt）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Microsoft office2007軟件和SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以（±s）表示，采用趨勢χ2檢驗，兩樣本間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定 結(jié)果顯示，30株實驗菌株均能形成生物膜。根據(jù)結(jié)果判讀依據(jù)：ODc=0.066，OD570≥4ODc，30株均為強生物膜形成株。所有菌株在24 h均已形成生物膜，24 h～48 h內(nèi)迅速生長。每株菌每個時間段所形成的生物膜量均有差異。5株菌培養(yǎng)48 h后生物膜形成量達到高峰，而后進入平臺期，96 h開始下降；16株菌在48 h產(chǎn)生的生物膜量達到高峰，72 h開始下降；另外9株菌在72 h產(chǎn)生的生物膜量達到高峰，而后開始下降。見表1。

表1 30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定（±s）

表1 30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定（±s）

編號 24 h 48 h 72 h 96 h 1 0.250±0.036 0.272±0.025 0.285±0.010 0.148±0.028 2 0.261±0.038 0.360±0.027 0.357±0.018 0.143±0.011 3 0.256±0.021 0.561±0.044 0.567±0.012 0.299±0.105 4 0.343±0.025 0.449±0.009 0.301±0.009 0.184±0.006 6 0.436±0.076 1.259±0.001 1.084±0.056 0.859±0.040 7 0.536±0.032 1.645±0.037 1.473±0.056 1.104±0.086 8 0.171±0.010 0.131±0.013 0.366±0.024 0.131±0.035 9 0.250±0.014 1.557±0.026 1.302±0.104 0.971±0.061 13 0.165±0.009 0.459±0.038 0.564±0.050 0.389±0.020 14 0.529±0.089 1.573±0.159 1.431±0.125 1.099±0.117 15 0.151±0.027 0.959±0.029 0.815±0.104 0.581±0.098 19 0.257±0.041 0.540±0.063 0.540±0.029 0.338±0.093 21 0.165±0.013 0.747±0.004 0.753±0.020 0.431±0.097 22 0.200±0.010 0.785±0.030 0.749±0.007 0.528±0.065 24 0.517±0.001 1.158±0.035 1.156±0.045 0.870±0.071 25 0.183±0.011 0.344±0.012 0.470±0.040 0.340±0.091 26 0.154±0.014 0.261±0.036 0.213±0.010 0.185±0.010 27 0.215±0.015 0.553±0.019 0.523±0.009 0.401±0.013 28 0.346±0.028 0.944±0.049 0.861±0.019 0.734±0.034 30 0.413±0.017 1.689±0.155 1.492±0.078 1.342±0.068 33 0.084±0.024 0.188±0.012 0.289±0.030 0.269±0.017 34 0.186±0.036 0.676±0.062 0.651±0.017 0.560±0.015 35 0.140±0.013 0.594±0.016 0.916±0.024 0.743±0.040 36 0.086±0.011 0.311±0.018 0.314±0.002 0.291±0.006 37 0.229±0.042 1.447±0.128 1.318±0.082 1.060±0.105 46 0.112±0.009 0.453±0.018 0.723±0.046 0.667±0.011 47 0.082±0.005 0.143±0.011 0.339±0.033 0.296±0.007 48 0.234±0.021 0.732±0.030 0.643±0.049 0.583±0.028 50 0.284±0.035 1.385±0.025 1.515±0.077 1.441±0.135 57 0.155±0.014 0.285±0.005 0.218±0.015 0.187±0.013

2.2 亞抑菌濃度替加環(huán)素對MRSA生物膜形成的作用 本實驗替加環(huán)素對30株MRSA的MIC值均≤0.12 μg/mL，參照CLSI標準均為敏感。對30株亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下的MRSA實驗菌株的生物膜量進行分析，分別測定1、1/2、1/4、1/8MIC替加環(huán)素條件下實驗菌株的生物膜生成量。結(jié)果顯示，所有菌株在亞抑菌濃度的替加環(huán)素作用下的生物膜形成能力均有下降，表明在亞抑菌濃度的替加環(huán)素作用下可顯著抑制MRSA實驗菌株生物膜的形成；大部分菌株隨著替加環(huán)素濃度的增加，生物膜形成量減少；只有少量MRSA實驗菌株表現(xiàn)為1/4MIC替加環(huán)素下生成增加，其生物膜形成量不完全與替加環(huán)素濃度呈負相關(guān)。見表2。

表2 亞抑菌濃度替加環(huán)素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

表2 亞抑菌濃度替加環(huán)素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

編號 0MIC 1MIC 1/2MIC 1/4MIC 1/8MIC 1 0.271±0.015 0.063±0.020 0.104±0.006 0.157±0.007 0.218±0.017 2 0.358±0.028 0.104±0.007 0.168±0.010 0.203±0.003 0.253±0.013 3 0.543±0.040 0.067±0.007 0.110±0.010 0.188±0.011 0.257±0.007 4 0.444±0.010 0.092±0.010 0.114±0.012 0.218±0.010 0.125±0.004 6 1.168±0.079 0.124±0.006 0.220±0.003 0.308±0.009 0.413±0.012 7 1.640±0.045 0.227±0.020 0.324±0.019 0.414±0.008 0.543±0.050 8 0.357±0.009 0.048±0.010 0.084±0.005 0.111±0.009 0.120±0.009 9 1.499±0.054 0.121±0.007 0.186±0.005 0.452±0.040 0.350±0.025 13 0.556±0.044 0.158±0.213 0.117±0.009 0.087±0.003 0.108±0.008 14 1.540±0.108 0.116±0.004 0.603±0.048 0.438±0.011 0.530±0.008 15 0.959±0.014 0.071±0.007 0.090±0.002 0.130±0.008 0.163±0.012 19 0.497±0.036 0.126±0.010 0.146±0.008 0.183±0.010 0.219±0.018 21 0.731±0.032 0.043±0.008 0.081±0.004 0.105±0.004 0.138±0.005 22 0.793±0.019 0.056±0.005 0.088±0.005 0.121±0.002 0.112±0.004 24 1.154±0.043 0.117±0.008 0.180±0.006 0.247±0.011 0.342±0.005 25 0.453±0.034 0.070±0.007 0.104±0.006 0.133±0.010 0.151±0.022 26 0.261±0.024 0.029±0.003 0.060±0.007 0.089±0.004 0.116±0.014 27 0.546±0.030 0.045±0.027 0.124±0.013 0.124±0.010 0.324±0.009 28 0.891±0.016 0.131±0.016 0.277±0.029 0.425±0.024 0.541±0.030 30 1.658±0.123 0.084±0.019 0.276±0.034 0.746±0.053 0.831±0.049 33 0.295±0.016 0.042±0.009 0.066±0.011 0.098±0.011 0.121±0.008

表2（續(xù)）

2.3 亞生物膜清除濃度替加環(huán)素下對MRSA生物膜的作用 MRSA菌株生物膜形成達高峰后加入一定濃度的替加環(huán)素，并以能消除已形成生物膜的最低濃度為最低生物膜形成濃度（MBEC），分別測定1、1/2、1/4、1/8MBEC 的替加環(huán)素作用下，30株MRSA菌株生物膜形成量的變化。結(jié)果顯示，替加環(huán)素對30株MRSA的MBEC各不相同，濃度32～128 ug/mL；1/2、1/4、1/8MBEC 替加環(huán)素對生物膜均有微弱的消除作用，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.894）。見表3-4。

表3 亞生物膜清除濃度替加環(huán)素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

表3 亞生物膜清除濃度替加環(huán)素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

編號 MBEC 0MBEC 1/2MBEC 1/4MBEC 1/8MBEC 1 64 0.253±0.021 0.212±0.006 0.217±0.012 0.224±0.007 2 64 0.345±0.027 0.270±0.018 0.317±0.046 0.224±0.015 3 128 0.517±0.039 0.423±0.012 0.440±0.024 0.419±0.003 4 64 0.425±0.007 0.327±0.021 0.322±0.007 0.319±0.003 6 128 1.093±0.066 1.084±0.112 1.028±0.017 0.982±0.053 7 128 1.514±0.068 1.522±0.031 1.331±0.021 1.425±0.044 8 32 0.334±0.012 0.277±0.009 0.268±0.025 0.264±0.025 9 128 1.501±0.045 1.385±0.050 1.488±0.051 1.668±0.057 13 64 0.535±0.049 0.433±0.008 0.459±0.018 0.452±0.012 14 128 1.483±0.073 1.418±0.044 1.569±0.021 1.475±0.118 15 128 0.945±0.009 0.738±0.017 0.678±0.021 0.650±0.031 19 64 0.475±0.049 0.372±0.019 0.340±0.047 0.377±0.021 21 128 0.713±0.038 0.594±0.029 0.650±0.027 0.715±0.013 22 128 0.777±0.021 0.521±0.011 0.610±0.059 0.608±0.007 24 128 1.151±0.076 0.982±0.023 1.323±0.065 1.367±0.051 25 64 0.433±0.040 0.263±0.022 0.250±0.031 0.286±0.052 26 32 0.248±0.029 0.113±0.007 0.124±0.004 0.129±0.014 27 64 0.521±0.034 0.389±0.012 0.426±0.015 0.465±0.010 28 128 0.875±0.024 0.760±0.015 0.815±0.017 0.869±0.017 30 128 1.635±0.039 1.533±0.066 1.577±0.023 1.706±0.025 33 32 0.275±0.012 0.225±0.008 0.257±0.021 0.240±0.008 34 64 0.669±0.029 0.552±0.023 0.565±0.013 0.592±0.012 35 64 0.896±0.018 0.792±0.008 0.832±0.019 0.848±0.028 36 32 0.300±0.025 0.303±0.007 0.316±0.009 0.324±0.008 37 128 1.420±0.078 1.283±0.056 1.302±0.037 1.415±0.074 46 64 0.658±0.084 0.580±0.020 0.613±0.014 0.711±0.010 47 32 0.327±0.028 0.281±0.004 0.310±0.012 0.334±0.009 48 128 0.694±0.061 0.553±0.020 0.609±0.028 0.698±0.016 50 128 1.334±0.166 1.263±0.048 1.295±0.042 1.333±0.020 57 32 0.250±0.025 0.225±0.014 0.230±0.021 0.255±0.011

表4 1/2、1/4、1/8MBEC替加環(huán)素對MRSA生物膜的差異性比較

2.4 RT-PCR法測定亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下生物膜相關(guān)基因相對表達量 選取實驗菌株中的四株菌在四個不同濃度替加環(huán)素作用24 h后進行RT-PCR檢測icaA、sarA、fnbA、agrI基因的相對表達量，并計算生物膜形成量與其之間的相關(guān)性，內(nèi)參基因為16sRNA。見表5。

表5 icaA，sarA，fnbA和agrI基因相對表達量

2.5 MRSA生物膜形成量與相關(guān)基因表達量的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，生物膜量與以下基因有相關(guān)性：icaA（PCC=0.873，P＜0.01），icaA和sarA（PCC=0.817，P＜0.01），icaA和fnbA（PCC=0.941，P＜0.01），sarA和fnbA（PCC=0.844，P＜0.01）。見表6。

表6 MRSA生物膜形成量與相關(guān)基因表達量的相關(guān)性分析

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種機會性人類病原體，感染的范圍從輕度皮膚感染到嚴重壞死性肺炎，同時是菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎的主要病原菌，還可引起骨關(guān)節(jié)、皮膚、軟組織、胸膜、肺和裝置相關(guān)感染。MRSA具有多重耐藥性，生物膜的形成是MRSA毒力因子之一［4］。生物膜是一種膜性結(jié)構(gòu)，MRSA由于生物膜的作用，并不引起強烈的炎癥反應(yīng)，因為生物膜隔絕了細菌與機體的直接接觸，使細菌得以與機體共存，即使在慢性黏附的狀態(tài)下［5］。更重要的是，生物膜能夠有效阻滯抗生素和機體防御系統(tǒng)對被膜內(nèi)細菌的殺傷，雖然部分抗生素能夠有效殺滅浮游菌，但還會不斷釋放浮游菌，從而導(dǎo)致感染遷延不愈。生物膜致病機制較為復(fù)雜，主要包括以下幾個方面［6-11］：①生物膜提供保護屏障，MRSA生物膜可通過多種機制對抗抗生素的殺菌作用，主要是表現(xiàn)在內(nèi)部微環(huán)境的改變、基質(zhì)屏障作用、群體感應(yīng)系統(tǒng)、被膜菌的表型變異以及主動外排系統(tǒng)等，為細菌的定植和侵入提供了屏障。②生物膜介導(dǎo)的免疫損傷。中性粒細胞不能進入生物膜內(nèi)殺傷細菌，只能圍繞在生物膜周圍，由于生物膜基質(zhì)屏障缺少特定的化學(xué)信號，這些細胞被激活后能釋放蛋白酶、細胞毒素等，可引起周圍組織損傷。③葡萄球菌生物膜能夠通過降低淋巴細胞釋放γ干擾素，可減少巨噬細胞的激活，也會導(dǎo)致周圍組織損傷。④生物膜能夠?qū)姑庖呦到y(tǒng)的清除，抗體和炎性細胞只能環(huán)繞在其周圍，很難進入生物膜內(nèi)，這樣就不能發(fā)揮吞噬殺傷作用。

本實驗通過96孔聚苯乙烯板結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn)，留取的30株MRSA均形成生物膜，并且都是強生物膜形成株。從30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定表及生物膜生長曲線圖可見，菌株生物膜的生長周期具有差異性。細菌形成生物膜的階段為黏附→聚集與增殖→生物膜的成熟→細菌脫落與播散，由表1可見，培養(yǎng)24 h已經(jīng)完成黏附形成生物膜，24 h～48 h是聚集與增殖的快速階段，53.3%的菌株在此時間段成生物膜已經(jīng)達到高峰，72 h開始下降；16.7%的菌株在此階段生物膜形成量達到高峰，72 h量與其持平；30%的菌株在此階段生物膜繼續(xù)增殖至72 h達到高峰形成成熟的生物膜。72 h～96 h為細菌脫落與播散期，浮游菌遇到適宜的表面繼續(xù)附著、發(fā)展、成熟，形成循環(huán)。因此，生物膜的形成是一個動態(tài)過程，是導(dǎo)致感染遷延不愈的重要原因。

本研究使用1、1/2、1/4、1/8MIC替加環(huán)素對30株MRSA實驗菌株進行刺激。結(jié)果表明，所有應(yīng)用替加環(huán)素作用下的MRSA實驗菌株在亞抑菌濃度條件下其形成生物膜的能力均降低。此外，亞抑菌濃度的替加環(huán)素作用下可明顯抑制MRSA生物膜的形成。實驗菌株形成的生物膜量各自不同，在不同的亞抑菌濃度作用下，大部分的菌株在替加環(huán)素作用下表現(xiàn)為隨著濃度增加，生物膜形成量減少，呈負相關(guān)性。有少量菌株在亞抑菌濃度的替加環(huán)素作用下，其形成的生物膜不隨替加環(huán)素的濃度變化而變化，可能是因為亞抑菌濃度不僅不能破壞、減少生物膜，反而可能誘導(dǎo)刺激生物膜形成，這個問題值得繼續(xù)研究。

本研究檢測了替加環(huán)素對30株MRSA實驗菌株最低生物膜清除濃度。結(jié)果顯示，30株的MBEC均顯著高于其浮游菌的MIC，表明在替加環(huán)素作用下以生物膜形態(tài)存在的細菌與浮游菌耐抗菌素的能力相比大大增加。以1/2、1/4、1/8MBEC濃度刺激30株MRSA菌株，結(jié)果表明亞生物膜清除濃度對已經(jīng)形成的生物膜有微弱的消除作用，但不同MBEC的替加環(huán)素對成熟生物膜的作用無差異。臨床上，可以根據(jù)需要聯(lián)合用藥對MRSA成熟的生物膜進行干預(yù)。

本研究中亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下生物膜形成量與sarA、icaA和fnbA呈明顯相關(guān)性，提示亞抑菌濃度替加環(huán)素對MRSA生物膜影響的主要機制是對相關(guān)的生物膜基因如sarA、icaA、fnbA進行調(diào)控進而影響生物膜的形成。結(jié)果提示，亞抑菌濃度替加環(huán)素影響生物膜形成與agrI基因相關(guān)性不大，可能與本研究中6號菌株在亞抑菌濃度替加環(huán)素作用下的agrI未擴增有關(guān)，后期需要更多的實驗來證明與探究。

綜上所述，不同濃度替加環(huán)素的作用影響了相關(guān)基因的相對表達量，從而影響生物膜形成量的變化。替加環(huán)素影響生物膜形成的機制復(fù)雜，通過對毒力因子、基因的調(diào)控能否降低MRSA生物膜相關(guān)感染的發(fā)病率和病死率，還需進行深入的研究。另外，MRSA的耐藥形勢給臨床治療及院內(nèi)感染防控帶來極大的挑戰(zhàn)，提示臨床醫(yī)師必須合理選用抗菌藥物［12］。