高子武，吳丹璇，王恒鵬，吳鵬，屠明亮，許志誠(chéng)，孟祥忍*

1(揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225127)2(江蘇省淮揚(yáng)菜產(chǎn)業(yè)化工程中心，江蘇 揚(yáng)州，225127)

腌制是肉制品重要的加工環(huán)節(jié)，能使肉品呈現(xiàn)特有的色澤及風(fēng)味，具有改善肉品品質(zhì)的作用[1]。值得注意的是，不同腌制方式會(huì)造成腌肉制品中鹽分、水分、保水性及嫩度等品質(zhì)的變化，且腌制效率差異明顯，間接導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性發(fā)生不同程度的變化，最終影響產(chǎn)品品質(zhì)。傳統(tǒng)腌制工藝存在鹽分滲透速度慢、不均勻等現(xiàn)象[2]，若腌制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，還易引起微生物污染，無(wú)法適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)需求。研究發(fā)現(xiàn)，真空滾揉、超聲波輔助等腌制技術(shù)能有效提高腌料傳質(zhì)速率，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)特性改變，并改善肉的品質(zhì)[2]。在真空滾揉腌制過(guò)程中，肌纖維的完整性不斷降低，肌纖維間隙逐漸增大，鈣激活酶被激活并促進(jìn)肌原纖維蛋白的酶解。PATRASCU等[3]及謝媚等[4]認(rèn)為真空滾揉處理產(chǎn)生的機(jī)械和鹽溶作用不僅能促進(jìn)腌制液的滲透，而且有利于肌球蛋白的提取，從而提高熱處理后肉的黏附性。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會(huì)破壞肌原纖維結(jié)構(gòu)，加速肌原纖維蛋白的降解，其促滲作用增加了肌球蛋白的溶解度[5]。KANG等[6]認(rèn)為，超聲波輔助腌制處理可以提高牛肉的肌原纖維碎片化指數(shù)，降解肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T，從而提高牛肉嫩度。

肌原纖維蛋白約占肌肉蛋白的55%～65%，是肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)，一定程度上直接影響肉品品質(zhì)[4,6]。目前，有關(guān)肉制品腌制處理過(guò)程中蛋白質(zhì)特性變化的研究側(cè)重于和嫩度建立聯(lián)系，鮮有不同腌制方式下肉制品肌原纖維蛋白特性及水分遷移規(guī)律的探究。本試驗(yàn)通過(guò)比較靜置、真空滾揉及超聲波輔助3種腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白氧化、結(jié)構(gòu)特性與水分分布的變化規(guī)律，揭示不同腌制方式下牛肉肌原纖維蛋白特性與保水性的內(nèi)在聯(lián)系，以期為腌肉制品的質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冷鮮西冷牛肉，購(gòu)于揚(yáng)州麥德龍超市；氯化鈉、溴酚藍(lán)、三氯乙酸、乙酸乙酯、鹽酸胍、尿素、鹽酸、氫氧化鈉、β-巰基乙醇、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸[glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid，EGTA]，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HKS-30VT型真空滾揉機(jī)，無(wú)錫哈克遜工貿(mào)有限公司；UC-600E型超聲波清洗器，上海精其儀器有限公司；FA1004(1/1000)型電子天平，浙江力辰儀器科技有限公司；H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)有限公司；AccuFat-1050型低場(chǎng)核磁共振分析儀，江蘇麥格邁有限公司；BIO-RAD型伯樂(lè)電泳儀，北京賽百奧科技有限公司；722 N型紫外分光光度計(jì)，上海菁華儀器有限公司；VORTEX 1型渦旋混勻儀，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；DXRxi型顯微拉曼成像光譜儀，美國(guó)Thermofisher公司；BCD-346型海爾冰箱，青島海爾有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

腌制液：配制60 mg/mL NaCl溶液，置于0～4 ℃環(huán)境中冷藏備用。

樣品處理：將冷鮮西冷牛肉去除可見(jiàn)筋膜，吸干樣品表面血水，修整成規(guī)格約5 cm×5 cm×1.5 cm、質(zhì)量為(40±2) g的樣品，用保鮮膜包裹后置于4 ℃中平衡12 h后取出，浸漬于裝有腌制液的自封袋中，料液比為1∶1(g∶mL)，隨機(jī)分為4組，每組6份進(jìn)行不同腌制方式處理：(1)靜置腌制：將樣品置于0～4 ℃ 環(huán)境中分別腌制20、40 min，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取3份樣品進(jìn)行分析；(2)真空滾揉腌制：參考李鵬等[7]方法適當(dāng)修改，真空度設(shè)置為0.08 MPa，溫度0～4 ℃，轉(zhuǎn)速10 r/min，樣品進(jìn)行單向連續(xù)真空滾揉處理，分別在滾揉腌制20、40 min 時(shí)隨機(jī)取出3份進(jìn)行分析；(3)超聲波輔助腌制：于超聲波清洗器(40 kHz，60 W，4 ℃)中放入樣品，分別處理20、40 min后隨機(jī)取出3份分析；空白對(duì)照：將生肉置于0～4 ℃環(huán)境中冷藏備用。

1.2.2 肌原纖維蛋白提取

參照WU等[8]方法略微修改。取不同腌制方式處理樣品5 g，剪碎后加入4倍體積的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Na3PO4·12H2O，10 mmol/L NaH2PO4·2H2O，10 mmol/L Na2HPO4·12H2O，2 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mmol/L EGTA，pH 7.0)，10 000 r/min均質(zhì)60 s，挑去筋膜后，2 000×g離心15 min(4 ℃)后棄上清液，重復(fù)上述操作3次；取沉淀再用4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液以10 000 r/min均質(zhì)30 s，2 000×g離心15 min(4 ℃)后棄上清液，重復(fù)上述操作2次，所得沉淀即為肌原纖維蛋白，于0～4 ℃冰箱保存，48 h內(nèi)使用完。

1.2.3 表面疏水性測(cè)定

參照CHELH等[9]方法測(cè)定。取1 mL 1 mg/mL懸浮液加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，空白對(duì)照為1 mL提取緩沖液(0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0)加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，渦旋振蕩混勻10 min后離心(4 ℃，4 000×g，15 min)，取上清液稀釋10倍后在595 nm處測(cè)定吸光值，表面疏水性計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：OD空白，空白樣品的吸光度值；ODMP，樣品的吸光度值。

1.2.4 總巰基含量測(cè)定

參照張海璐等[10]方法適當(dāng)修改。取0.5 mL 5 mg/mL蛋白懸浮液，加入2.5 mL的Tris-Gly-8 mol/L 尿素緩沖液(pH 8.0)，再加入0.02 mL 4 mg/mL DTNB溶液，振蕩搖勻后25 ℃下反應(yīng)30 min，然后于412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(A412)。以不加DTNB的樣品作為對(duì)照。總疏基含量計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A412，412 nm下的吸光值；e，分子吸光系數(shù)，13 600 L/mol·cm；D，水浴前稀釋倍數(shù)；c，蛋白濃度。

1.2.5 羰基含量測(cè)定

參照LEVINE等[11]方法適當(dāng)修改。在1.5 mL的離心管中加入0.1 mL 5 mg/mL蛋白液與0.5 mL的2 mol/L HCl溶液(含0.02 mol/L DNPH)，在25 ℃反應(yīng)40 min，空白樣品中加入0.5 mL不含DNPH的2 mol/L HCl溶液；在上述反應(yīng)液中分別加入0.5 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))的三氯乙酸，振蕩后離心(4 ℃，11 000×g，5 min)棄去上清液；用1 mL乙醇-乙酸乙酯溶液(1∶1，體積比)洗滌蛋白質(zhì)沉淀3次；將蛋白質(zhì)沉淀懸浮于1 mL的 6 mol/L鹽酸胍溶液中，在37 ℃ 條件下水浴30 min，在370 nm下測(cè)定吸光度值，利用摩爾吸光系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參照曹錦軒等[12]方法適當(dāng)修改。將不同腌制方式處理的牛肉肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為20 mg/mL，真空冷凍干燥后磨碎，取適量樣品平鋪于玻璃載片上，進(jìn)行拉曼光譜掃描。測(cè)定參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)532 nm，功率為100 mW，600 g/mm光柵，狹縫200 pum，3次掃描數(shù)據(jù)，獲取光譜波數(shù)在400～3 600 cm-1。數(shù)據(jù)采用Peakfit 4.12軟件對(duì)酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)處進(jìn)行去卷曲、二階求導(dǎo)及曲線擬合。

1.2.7 SDS-PAGE

采用丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠和5%的濃縮膠。肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度為4 mg/mL，加入 5×Loading buffer混合，100 ℃水浴10 min，上樣前離心30 s，上樣量為5 μL。濃縮膠中采用恒壓80 V，進(jìn)入分離膠后恒壓110 V，直至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后進(jìn)行染色、脫色處理。

1.2.8 水分分布測(cè)定

利用低場(chǎng)核磁共振分析儀(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)測(cè)定不同腌制方式處理牛肉中的水分分布。稱取(20±1) g不同腌制方式處理牛肉樣品，規(guī)格約為2.5 cm×5 cm×1.5 cm，將樣品用保鮮膜均勻包裹后放入專用核磁管中，封口膜封口并放在射頻管道中，測(cè)定每個(gè)樣品的弛豫時(shí)間，采用CPMG脈沖序列測(cè)定樣品橫向弛豫時(shí)間T2。具體參數(shù)設(shè)置：接收增益為80，回波間隔為800 μs，采樣點(diǎn)數(shù)為3 000，掃描次數(shù)為32，間隔時(shí)間為2 000 ms。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值進(jìn)行反演。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，采用Excel 2010、Origin 2017及SPSS 22.0對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，差異顯著水平α為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

肌原纖維蛋白的表面疏水性與其氧化、結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，因此表面疏水作用力對(duì)維持蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能特性至關(guān)重要[13]。肌原纖維蛋白表面疏水性越強(qiáng)，則說(shuō)明其變性程度越大，相反亦是。由圖1可知，不同腌制方式下牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性差異顯著(P<0.05)，且均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明腌制處理改變了肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)，暴露了分子內(nèi)部苯丙氨酸，色氨酸殘基等疏水性的氨基酸殘基，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的表面疏水性增強(qiáng)[14]。靜置腌制40 min牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性顯著高于靜置腌制20 min處理組，可能是因?yàn)殡缰埔褐蠳aCl逐漸滲入牛肉內(nèi)部，使牛肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開(kāi)，蛋白內(nèi)部的疏水性基團(tuán)充分暴露。胡遠(yuǎn)輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)大黃魚(yú)肌原纖維蛋白被0～0.4 mol/L NaCl處理時(shí)，表面疏水性逐漸增大可能是NaCl使蛋白分子外部親水作用與內(nèi)部疏水作用失衡所致。相反，在真空滾揉腌制及超聲波輔助腌制處理組中，腌制40 min的牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性均低于同一腌制方式下腌制20 min，可能是真空滾揉及超聲波處理對(duì)肌原纖維蛋白空間構(gòu)象破壞較為嚴(yán)重，暴露出更多疏水性基團(tuán)，而腌制后期蛋白進(jìn)一步氧化降解，出現(xiàn)較多的聚集交聯(lián)所致[14]。由圖1可見(jiàn)，超聲波輔助腌制牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性較其他腌制方式處理組降低，而蛋白表面疏水性一定程度上可以表征蛋白質(zhì)水合能力的指標(biāo)[16]，其值越小蛋白質(zhì)保水能力越強(qiáng)，結(jié)合水和不易流動(dòng)水含量越多，因而推測(cè)超聲波輔助腌制一定程度上可以增強(qiáng)牛肉的保水性。

A-空白對(duì)照(生肉)；B-靜置腌制20 min；C-靜置腌制40 min；D-真空滾揉腌制20 min；E-真空滾揉腌制40 min；F-超聲波輔助腌制20 min；G-超聲波輔助腌制40 min(下同)圖1 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.1 Effects of different curing processing on surface hydrophobicity of beef myofibrillar protein注：字母不同表示該性質(zhì)差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白總巰基的影響

肌原纖維蛋白中的總巰基容易被氧化為二硫鍵，導(dǎo)致總巰基含量降低，因此總巰基含量是表征蛋白氧化程度的關(guān)鍵指標(biāo)之一[17]。由圖2可見(jiàn)，靜置腌制20 min的牛肉肌原纖維蛋白總巰基含量與空白對(duì)照組無(wú)顯著差別(P>0.05)，當(dāng)靜置腌制時(shí)間延長(zhǎng)至40 min時(shí)，牛肉肌原纖維蛋白總巰基含量開(kāi)始下降，說(shuō)明鹽溶液會(huì)促進(jìn)肌原纖維蛋白的氧化。真空滾揉腌制處理牛肉肌原纖維蛋白總巰基含量在各處理組中最低，可見(jiàn)真空滾揉腌制在一定程度上加速了牛肉肌原纖維蛋白的氧化降解，促進(jìn)了蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，使更多巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵[18]。超聲波輔助腌制20 min 時(shí)牛肉肌原纖維蛋白總巰基含量最高，達(dá)69.16 nmol/mg，可能是短時(shí)間內(nèi)超聲波輔助腌制處理導(dǎo)致牛肉鹽溶性蛋白溶出，結(jié)合了牛肉中的結(jié)合水，在牛肉表面形成一層阻斷氧氣的保護(hù)膜，抑制了肌原纖維蛋白氧化所致[19]。當(dāng)超聲波輔助腌制40 min時(shí)，由于腌制時(shí)間延長(zhǎng)使NaCl充分滲入牛肉中以及超聲波的空化作用促進(jìn)了肌原纖維蛋白分子的伸展，加速了蛋白的氧化降解，進(jìn)而導(dǎo)致總巰基含量有所下降。

圖2 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白總巰基的影響Fig.2 Effects of different curing processing on total sulfhydryl groups of beef myofibrillar protein

2.3 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白羰基的影響

羰基是判斷肌原纖維蛋白氧化程度的主要指標(biāo)之一，肌原纖維蛋白的側(cè)鏈或肽鍵受到羥基攻擊時(shí)通常會(huì)造成羰基含量增加，且在氧化過(guò)程中蛋白空間構(gòu)象也可能發(fā)生改變[6]。由圖3可見(jiàn)，靜置腌制牛肉肌原纖維蛋白羰基含量與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但真空滾揉腌制牛肉肌原纖維蛋白中羰基含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，且真空滾揉腌制時(shí)間越長(zhǎng)，羰基含量越高，說(shuō)明肌原纖維蛋白在真空滾揉腌制的過(guò)程中被氧化，處理時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白氧化程度越嚴(yán)重，同時(shí)也反映出真空滾揉處理較大程度地改變了牛肉肌原纖維蛋白的空間構(gòu)象。超聲波輔助腌制組牛肉肌原纖維蛋白羰基含量也顯著高于空白對(duì)照組及靜置腌制組(P<0.05)，且羰基含量隨腌制時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。王安然[20]和XIONG等[21]研究認(rèn)為脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可以與肌原纖維蛋白產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合使蛋白羰基值增加，因而推測(cè)牛肉中少量脂肪在超聲波的作用下發(fā)生氧化反過(guò)來(lái)促進(jìn)了肌原纖維蛋白的氧化，導(dǎo)致牛肉肌原纖維蛋白中羰基含量升高。

圖3 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白羰基的影響Fig.3 Effects of different curing processing on carbonyl groups of beef myofibrillar protein

2.4 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)去卷積、二階求導(dǎo)和曲線擬合的方式對(duì)拉曼光譜峰進(jìn)行分峰處理，結(jié)果見(jiàn)圖4；不同腌制方式下牛肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化見(jiàn)圖5。如圖4所示，不同腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)有顯著區(qū)別(P<0.05)，空白對(duì)照組樣品的酰胺Ⅰ帶最大峰位置出現(xiàn)在1 661 cm-1處，而經(jīng)不同腌制方式處理后，樣品的最大峰位置均偏移至1 655 cm-1附近，且同一腌制方式下樣品腌制時(shí)間越長(zhǎng)，最大峰偏移程度越大。同時(shí)，從圖4中各處理組拉曼峰的相對(duì)強(qiáng)度來(lái)看，靜置腌制組樣品拉曼強(qiáng)度低于真空滾揉腌制組和超聲波輔助腌制組，表明真空滾揉和超聲波處理破壞了肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體的高級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)[16,22]。

圖4 不同腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白的拉曼光譜擬合曲線圖Fig.4 Raman spectrum fitting curve of beef myofibrillar protein treated by different curing processing

α-螺旋是蛋白質(zhì)分子內(nèi)的有序排列，主要由多肽鏈上羰基和氨基之間的分子內(nèi)氫鍵穩(wěn)定，β-折疊是蛋白質(zhì)分子間的有序排列，由分子間氫鍵維持[23]。由圖5可見(jiàn)，不同腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含量最高的為α-螺旋結(jié)構(gòu)，其次為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，無(wú)規(guī)則卷曲含量最少。與另外2種腌制方式處理組相比，真空滾揉腌制牛肉肌原纖維蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量明顯減少(P<0.05)，且β-折疊結(jié)構(gòu)含量顯著增加(P<0.05)，原因可能是真空滾揉處理破壞了維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵，并轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌麡?gòu)象。BEATTIE等[24]研究發(fā)現(xiàn)，嫩度較差的肌肉二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)含量顯著多于嫩度較好的肌肉。由圖5可知，經(jīng)超聲波輔助腌制的牛肉肌原纖維蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)含量顯著減少(P<0.05)，且超聲波輔助腌制40 min時(shí)牛肉肌原纖維蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)含量最低，僅為15.47%，說(shuō)明較長(zhǎng)時(shí)間的超聲波輔助腌制在一定程度上可以改善牛肉嫩度，這也與KANG等[6]研究結(jié)果相一致。隨著腌制時(shí)間從20 min延長(zhǎng)至40 min時(shí)，各腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量均呈上升趨勢(shì)，β-折疊均呈下降趨勢(shì)，可能與腌制過(guò)程中鹽分逐漸滲透使肌原纖維蛋白變性或聚集程度增加有關(guān)[7]。相比于空白對(duì)照組，3種腌制方式對(duì)樣品無(wú)規(guī)則卷曲含量影響并不明顯(P>0.05)，但β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著增加(P<0.05)。

圖5 不同腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化Fig.5 Changes of relative content of secondary structure of myofibrillar protein in beef treated with different curing processing

2.5 不同腌制方式對(duì)牛肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響

由SDS-PAGE凝膠電泳圖(圖6)可知，在不同腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白泳道上存在多條共同條帶，主要包括肌球蛋白重鏈、α-肌動(dòng)素、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白輕鏈1、肌鈣蛋白Ⅰ亞基、肌球蛋白輕鏈2和肌球蛋白輕鏈3等。圖6中，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白的譜帶最為明顯，驗(yàn)證了肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是肌原纖維蛋白主要組成的觀點(diǎn)[14]。一般情況下，蛋白質(zhì)分子發(fā)生降解主要表現(xiàn)為分子質(zhì)量較高處的條帶出現(xiàn)模糊、弱化和擴(kuò)展，較低分子質(zhì)量區(qū)域則呈現(xiàn)出新的條帶或條帶顏色加深[25]。與空白對(duì)照組及靜置腌制組相比，真空滾揉和超聲波輔助腌制牛肉肌原纖維蛋白在10～26 kDa處條帶呈現(xiàn)加深，43～95 kDa處條帶呈現(xiàn)模糊及肌球蛋白重鏈處有輕微擴(kuò)散現(xiàn)象，說(shuō)明真空滾揉及超聲波輔助腌制處理一定程度上加速了牛肉肌原纖維蛋白的降解，可能是因?yàn)榕Ｈ饧〖?xì)胞中的一些內(nèi)源性蛋白酶在滾揉及超聲波等外力的影響下釋放，從而使肌原纖維蛋白的溶出及降解。這也與胡鵬等[19]認(rèn)為滾揉處理會(huì)加快成熟早期羊肉肌原纖維蛋白降解的結(jié)論相印證。但在同一腌制方式下不同腌制時(shí)間處理的牛肉肌原纖維蛋白條帶差異并不顯著(P>0.05)。

圖6 不同腌制方式處理牛肉肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE map of beef myofibrillar protein treated by different curing processing

2.6 不同腌制方式對(duì)牛肉水分分布的影響

2.6.1 不同腌制方式對(duì)牛肉橫向弛豫時(shí)間T2的影響

LF-NMR主要通過(guò)橫向弛豫時(shí)間來(lái)反映肉制品中不同狀態(tài)水分的遷移規(guī)律[16,20]。圖7及表1顯示了經(jīng)不同腌制方式處理后牛肉中水分狀態(tài)的變化，由圖7可見(jiàn)，在1～1 000 ms的弛豫時(shí)間內(nèi)有3個(gè)峰，其橫向弛豫時(shí)間分別為T(mén)2b(1～10 ms)、T21(10～100 ms)、T22(100～1 000 ms)，分別代表結(jié)合水、不易流動(dòng)水及自由水[20]，這與康大成[26]研究超聲波輔助腌制對(duì)牛肉水分分布的結(jié)果基本一致。

相關(guān)研究表明，弛豫時(shí)間T2越短，水與底物結(jié)合越緊密，保水性越好；T2越長(zhǎng)，水與底物的結(jié)合越松散，水分越自由，保水性也越差[27]。由圖7、表1可知，靜置腌制組牛肉的弛豫時(shí)間T22顯著高于其他處理組(P<0.05)，不易流動(dòng)水向自由水方向遷移，可能是因?yàn)殪o置腌制時(shí)鹽分效應(yīng)顯著，較高濃度的鹽溶液加速牛肉肌原纖維斷裂及蛋白質(zhì)溶解，加快了牛肉的水分流失。同時(shí)說(shuō)明經(jīng)真空滾揉和超聲波處理后的牛肉肌原纖維蛋白構(gòu)象在外力的作用下發(fā)生變化，并一定程度上減緩鹽分效應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)了牛肉的保水性。真空滾揉腌制組牛肉的T21顯著低于靜置腌制及超聲波輔助腌制組(P<0.05)，且滾揉時(shí)間越長(zhǎng)，T21越短，表明較長(zhǎng)時(shí)間真空滾揉處理可以降低牛肉中水分自由度，增強(qiáng)結(jié)合水和不易流動(dòng)水與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力[28]。超聲波輔助腌制組牛肉的T2b較其他處理組明顯縮短(P<0.05)，可能是超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)較大程度地破壞了牛肉蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，致使牛肉中結(jié)合水向不易流動(dòng)水和自由水轉(zhuǎn)變，這與超聲波輔助腌制處理能夠明顯改變牛肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果相互印證。

圖7 不同腌制方式處理牛肉的弛豫時(shí)間T2圖譜Fig.7 Relaxation time T2 map of beef treated with different curing processing

表1 腌制方式對(duì)牛肉中不同狀態(tài)水分的弛豫時(shí)間T2的影響Table 1 Effect of curing processing on relaxation time T2 of water in different states in beef

2.6.2 不同腌制方式對(duì)牛肉橫向弛豫時(shí)間T2峰面積的影響

不同腌制方式對(duì)牛肉弛豫時(shí)間T2所對(duì)應(yīng)峰面積P2的影響結(jié)果如表2所示，其中P2b、P21、P22分別表示T2b、T21、T22的弛豫峰面積相對(duì)比例，通過(guò)相對(duì)比例的變化可以直觀看出樣品中各狀態(tài)水分的相對(duì)含量，進(jìn)而反映各組樣品保水性的變化[29]。同時(shí)由圖7可見(jiàn)，主峰為T(mén)21所對(duì)應(yīng)的峰，其信號(hào)幅度高于總信號(hào)的90%，表明不同腌制方式下不易流動(dòng)水是牛肉中水分的主要存在形態(tài)，不易流動(dòng)水的相對(duì)含量與牛肉的保水性高度相關(guān)[29-30]。由圖7及表2可知，經(jīng)真空滾揉腌制和超聲波輔助腌制處理的牛肉P2b、P21明顯高于未腌制及靜置腌制牛肉(P<0.05)，且隨著超聲波腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，牛肉P22顯著降低(P<0.05)。主要是因?yàn)檎婵諠L揉和超聲波的空化作用均能夠加速牛肉肌原纖維溶脹及鹽溶性蛋白的溶出，增強(qiáng)牛肉吸水能力，增加肌細(xì)胞內(nèi)水分含量，進(jìn)而提高牛肉的保水性。這與ZHENG等[30]認(rèn)為P2b和P21與肌肉保水性呈正相關(guān)，P22與保水性呈負(fù)相關(guān)的觀點(diǎn)相互印證。相反，靜置腌制20 min和40 min的牛肉P21均顯著小于其他處理組(P<0.05)，P22均顯著大于其他處理組(P<0.05)，表明靜置腌制牛肉保水性最低。李鵬等[7]和李俠等[16]研究也認(rèn)為提高肌肉不易流動(dòng)水橫向弛豫時(shí)間對(duì)應(yīng)的峰面積，能夠提高肉制品保水性，改善產(chǎn)品品質(zhì)。因此，超聲波輔助腌制和真空滾揉腌制對(duì)提高牛肉保水性具有積極作用。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以未腌制牛肉為對(duì)照，探究了牛肉在不同腌制方式下水分分布及肌原纖維蛋白的氧化和結(jié)構(gòu)特性。相比空白對(duì)照組，3種腌制方式處理組的肌原纖維蛋白表面疏水性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，其中超聲波輔助腌制組表面疏水性相對(duì)較低。真空滾揉腌制處理牛肉肌原纖維蛋白總巰基含量最低，羰基含量最高，表明蛋白氧化程度最大。真空滾揉處理較大程度地破壞了維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵，α-螺旋結(jié)構(gòu)被破壞后向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。與對(duì)照組相比，超聲波輔助腌制組肌原纖維蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少，牛肉嫩度得到改善。真空滾揉和超聲波輔助腌制牛肉肌原纖維蛋白在低分子質(zhì)量條帶呈現(xiàn)加深，高分子質(zhì)量條帶呈現(xiàn)模糊及肌球蛋白重鏈處有輕微擴(kuò)散現(xiàn)象，表明蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生降解。真空滾揉腌制組牛肉的T21顯著低于其他2種腌制方式處理組(P<0.05)，且滾揉時(shí)間越長(zhǎng)，T21越短。真空滾揉腌制和超聲波輔助腌制牛肉P2b、P21明顯高于未腌制及靜置腌制牛肉(P<0.05)。綜上，相比于靜置腌制，在腌制過(guò)程中，真空滾揉和超聲波會(huì)加速牛肉肌原纖維蛋白的氧化，促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)的降解，其中超聲波輔助腌制更有利于提高牛肉保水性，改善牛肉嫩度，對(duì)提升產(chǎn)品品質(zhì)具有重要作用。