侯 彪，王子升，周藝璇，楊偉強，王銀偉

(1.河南理工大學(xué) 能源科學(xué)與工程學(xué)院，河南 焦作 454000；2.國家能源投資集團 神東技術(shù)研究院，陜西 神木 719315)

0 引 言

厭氧消化最早是在生物有機體的自然生理過程中引入的，現(xiàn)已被戰(zhàn)略性地應(yīng)用于煤層生物氣資源的開采與利用。研究表明，煤的生物利用度可能會限制生物氣生成的速率和產(chǎn)量[1-2]。因此，目前大部分研究主要集中在如何增加煤的溶解性以及解聚性。然而，煤層生物氣生成的主要條件不僅包括底物煤，還存在較復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，即水解、酸化、產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷等決定性步驟[3]。根據(jù)條件的不同，每個步驟都有可能成為限制生物氣生成速率和產(chǎn)量的關(guān)鍵[4]。例如，產(chǎn)酸細(xì)菌與水解部分有關(guān)，可作用于聚合物(主要是多糖和蛋白質(zhì))產(chǎn)生短鏈脂肪酸(如乙酸、丁酸)，使這些小分子酸類物質(zhì)用于由產(chǎn)甲烷古菌驅(qū)動下的進一步甲烷的生成[5]。值得注意的是，任何上述成分或者含量發(fā)生變化都會導(dǎo)致厭氧消化過程出現(xiàn)差異。

據(jù)統(tǒng)計，大多數(shù)煤制生物甲烷的研究主要集中于煤的固體結(jié)構(gòu)及液相產(chǎn)物變化對最終甲烷生成的影響[6-9]。然而，厭氧微生物中的功能基因和一些相關(guān)酶的表達(dá)對底物(即碳水化合物、蛋白質(zhì)等)代謝以及最終生物甲烷的生成至關(guān)重要[10-11]。而現(xiàn)階段關(guān)于這一主題的研究內(nèi)容很少。盡管對于煤階與微生物群落結(jié)構(gòu)和分布特征之間的相關(guān)性已得到初步證實[12]。但轉(zhuǎn)化過程中功能性酶的基因表達(dá)和甲烷產(chǎn)量之間的聯(lián)系仍然不清楚。

鑒于基因組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，目前可以實現(xiàn)在復(fù)雜條件下對參與生物甲烷生成的關(guān)鍵基因和功能酶的鑒定[13]。因此，基于煤的生物產(chǎn)氣潛力與關(guān)鍵基因和功能表達(dá)的耦合關(guān)系，分析了不同煤階煤制生物甲烷過程中的產(chǎn)氣特征，同時評估了以不同煤階煤作為厭氧發(fā)酵底物下的甲烷生成潛力。之后通過16S rRNA基因功能預(yù)測技術(shù)分析了不同煤階煤制生物甲烷過程中參與底物代謝的相關(guān)基因功能表達(dá)水平。研究將煤的生物產(chǎn)氣特征與微生物基因功能表達(dá)進行了有機結(jié)合，為生物成因煤層氣的潛在生成機制提供新的見解。

1 試 驗

1.1 試驗材料

試驗煤樣選擇內(nèi)蒙古勝利煤田、河南義馬千秋煤礦、山西大同泉嶺煤礦和河南平頂山煤礦新鮮的褐煤、長焰煤、氣煤和焦煤，煤樣工業(yè)分析和元素分析分別按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015進行，測試結(jié)果見表1。試驗前將煤樣粉碎至80～100目(0.15～0.18 mm)，并在60 ℃下干燥24 h，密封保存。

表1 煤樣的工業(yè)分析與元素分析

1.2 生物產(chǎn)氣試驗

培養(yǎng)基配制方案按照文獻[14]進行準(zhǔn)備。將配制好的培養(yǎng)基放入高溫滅菌鍋內(nèi)于121 ℃滅菌3 h，滅菌結(jié)束后按照3∶1的比例倒入馴化的菌液(來源為礦井水)，利用N2驅(qū)替瓶內(nèi)空氣3 min，用封口膜密封，放置在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中富集4 d。將20 g粉碎后的煤樣加入250 mL錐形瓶內(nèi)，同時加入富集4 d的菌液200 mL，利用N2驅(qū)替瓶內(nèi)空氣3 min，攪拌均勻后放入35 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行為期32 d的產(chǎn)氣實驗，每組實驗設(shè)置3個平行樣。用集氣袋收集氣體，甲烷定量分析使用氣相色譜儀(Agilent 7890GC)。分別用HM、CYM、QM和JM表示以褐煤、長焰煤、氣煤與焦煤為底物的生物產(chǎn)氣試驗。

1.3 甲烷生成動力學(xué)

修正的Gompertz模型通常用于模擬厭氧發(fā)酵過程中CH4的累積生成特征，使用該模型(式(1))評估和對比不同煤階煤制生物甲烷過程中CH4生成動力學(xué)，該等式描述如下：

(1)

其中：y為累積甲烷產(chǎn)量，mL/g；A為累積甲烷產(chǎn)量潛力，mL/g；μm為最大比甲烷產(chǎn)量，mL/(g·d)；λ為滯后期，t，為CH4首次產(chǎn)生所用的時間，也表示微生物適應(yīng)環(huán)境所用的時間。

1.4 微生物代謝功能預(yù)測

4個試驗組的發(fā)酵液的全基因組DNA是用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取的。使用Qubit 2.0評估DNA濃度，以確保達(dá)到測序要求。在測序之前，每個發(fā)酵液中的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物以等摩爾量標(biāo)準(zhǔn)化，用于構(gòu)建聚合酶鏈反應(yīng)擴增子文庫。之后所有樣本被送到上海生工進行測試，根據(jù)說明使用Illumina MiSeq(2×300 bp)系統(tǒng)進行文庫構(gòu)建，最終利用PICRUSt軟件分析不同發(fā)酵液的代謝功能與功能基因差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 煤制生物氣產(chǎn)氣特征分析

對不同煤階煤厭氧發(fā)酵過程中的累積產(chǎn)氣量與甲烷產(chǎn)量進行了分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 累積產(chǎn)氣量與甲烷產(chǎn)量生成特征

從圖1可以看出，CYM的累積產(chǎn)氣量明顯高于其他試驗組(圖1a)，且生物甲烷產(chǎn)量較HM、QM和JM分別增加了10.82%、38.88%和73.49%(圖1b)。前人的研究證實，煤的生物產(chǎn)氣量會隨著煤階增加而逐漸降低。這是因為與低階煤相比，高階煤的雜原子含量較低，芳香結(jié)構(gòu)縮合度較高[15]，導(dǎo)致其生物利用度降低。然而，F(xiàn)ALLGREN等[16]的研究表明高階煤可能比低階煤具有更高的甲烷生成潛力。同時，有學(xué)者證實瀝青比干酪根更具微生物轉(zhuǎn)化甲烷潛力[17]。這表明煤階高低不是生物甲烷產(chǎn)量潛力的有利指標(biāo)。煤中的金屬元素含量、黏土礦物以及導(dǎo)電性對發(fā)酵環(huán)境也有重要的影響。產(chǎn)生的影響如下：

1)金屬元素。①釋放金屬離子，是厭氧發(fā)酵中厭氧微生物的必要營養(yǎng)來源[18]；②有助于DNA復(fù)制、關(guān)鍵酶的形成[19]；③降低了發(fā)酵體系中H2S的含量[20]。

2)黏土礦物。具有較高的比表面積和規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)，吸水性和膨脹性較好。黏土吸水使其層間距增大，可提高微生物與煤的有效接觸，且黏土中的無機礦物對微生物產(chǎn)甲烷有促進作用[21]。同時，起到pH緩沖作用，從而穩(wěn)定厭氧發(fā)酵系統(tǒng)。

3)導(dǎo)電性。激活細(xì)胞間的信號傳遞，可在細(xì)菌和氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌之間形成間直接電子轉(zhuǎn)移的通道。SU等[22]研究證實在內(nèi)蒙古區(qū)塊采集的褐煤中高的金屬元素含量(是長焰煤的9倍)會對微生物生長有毒害作用，同時也會抑制酶的活性甚至失活，這是導(dǎo)致褐煤的煤制生物甲烷量下降的原因之一。同時，煤中黏土礦物的含量會隨著煤階的增加而增多[23]，長焰煤中黏土礦物含量較褐煤有所增加，有利于生物甲烷的生成。先前的研究表明，羧基在低階煤中含量豐富，并且隨著煤階的升高而緩慢下降[24]，羧基是降解的優(yōu)先目標(biāo)，與芳香族和脂類C—C鍵相比，其鍵離解能相對較低，可被微生物優(yōu)先利用，同時高階煤頑固的芳香結(jié)構(gòu)不利于煤的生物降解[25]。綜上所述，長焰煤可作為煤制生物甲烷的優(yōu)勢底物。

另外，前人的研究已經(jīng)證實，煤的生物產(chǎn)氣可分3個重要階段，即①緩慢增長→快速增長階段；②快速增長→緩慢增長階段；③緩慢增長→產(chǎn)氣停止階段。從圖1a中可以發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣量越大的試驗組3個階段越明顯，且HM和CYM在16～24 d產(chǎn)氣量增幅較大，而QM與JM的累積產(chǎn)氣量沒有較明顯上升期。

2.2 甲烷的動力學(xué)模型

改進的Gompertz模型能夠有效預(yù)測厭氧發(fā)酵的動力學(xué)強度[26]。滯后期(λ)表示微生物適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境動態(tài)變化所需的延遲響應(yīng)時間[27]。隨著底物煤階的升高，滯后期也在逐漸的增加(表2)，這可能是由于高階煤中較頑固的芳構(gòu)化結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)基中微生物的馴化需要延長的滯后期，高λ表明微生物適應(yīng)反應(yīng)環(huán)境的能力低，沼氣和CH4的產(chǎn)生時間較長，說明高煤階煤制生物甲烷會明顯延長厭氧發(fā)酵時間。然而，HM顯示最低的λ，但理論甲烷總產(chǎn)量較CYM低19.30%，結(jié)合KOCH等[28]的結(jié)論，這可能的原因是由于VFA積累，使得pH下降，進而破壞了產(chǎn)甲烷菌活性。

表2 生物甲烷產(chǎn)氣潛力預(yù)測

2.3 代謝功能的差異特征

在不同煤階煤的厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程中，CYM參與微生物代謝功能的相對豐度明顯高于其他試驗組(圖2)，這意味著以長焰煤作為發(fā)酵底物，可明顯改善有機物如碳水化合物、氨基酸和其他化合物的生物轉(zhuǎn)化。眾所周知，厭氧發(fā)酵過程中碳水化合物和氨基酸被生物代謝成揮發(fā)性脂肪酸是重要的且必經(jīng)的決定步驟，因此，微生物代謝功能的增強與高揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生是一致的。

圖2 基于KEGG數(shù)據(jù)庫的微生物群落代謝功能

研究分析了主要參與甲烷生成的4種代謝功能(次生代謝物生物合成、運輸和分解代謝；輔酶轉(zhuǎn)運與代謝；碳水化合物運輸和代謝；氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝)豐度與最大甲烷生成潛力之間的線性關(guān)系(圖3)。從圖3可以看出，參與輔酶轉(zhuǎn)運與代謝和碳水化合物運輸和代謝這2種代謝功能與最大甲烷生成潛力之間存在良好的線性關(guān)系(R2=0.727，R2=0.945)。為了更準(zhǔn)確地反映這些代謝功能的差異性，對其相關(guān)的表達(dá)基因進行了對比分析。

圖3 代謝功能與最大甲烷生成潛力之間的線性關(guān)系

2.3.1 氨基酸代謝

通常氨基酸的代謝是指其形成和轉(zhuǎn)化。因此，通過根據(jù)氨基酸的形成和轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的相對豐度來進行預(yù)測分析，相關(guān)功能基因描述見表3，分析對比結(jié)果如圖4所示。

表3 氨基酸代謝相關(guān)功能基因描述

圖4 氨基酸形成與轉(zhuǎn)化相關(guān)功能基因豐度對比

不同煤階煤發(fā)酵過程中與氨基酸形成相關(guān)的酶的基因豐度差異較大(圖4)。CYM中參與谷氨酸合成的gltB的相對豐度最高[29]。此外，CYM中能夠?qū)⒑鶊F轉(zhuǎn)移到L-丙氨酸的asdA[30]的相對豐度比HM、QM和JM分別高15.69倍、4.79倍、3.27倍。另一方面，與氨基酸轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶的基因在不同底物條件下也發(fā)生了變化。gdhA基因在4組試驗組中的整體豐度較低，該基因與谷氨酸脫氫酶有關(guān)[31]，谷氨酸脫氫酶能將谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，這有利于丙酮酸合成，其整體變化趨勢與甲烷產(chǎn)量成正比關(guān)系。CYM中較高的編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和參與草酰乙酸合成的yhdR基因和aspC基因豐度，有利于乙酸和丙酸的產(chǎn)生，為產(chǎn)甲烷菌提供更充足的營養(yǎng)源。CYM中同時也存在較高豐度的AGXT基因(參與丙酮酸的直接合成)，為VFA和H2/CO2的生產(chǎn)提供了更多的發(fā)酵前體物。

如圖4所示，對氧化還原酶和磷酸甘油酸變位酶(糖酵解酶)至關(guān)重要的以及有助于絲氨酸形成的serA基因相對豐度與煤階幾乎成反比關(guān)系，即煤階越低，則serA基因豐度越高，這可能與低階煤中含有較高殘余糖類物質(zhì)有關(guān)。在CYM中有較豐富的soxD基因和soxG基因，其編碼與甘氨酸形成相關(guān)的氧化還原酶，并作用于供體化合物的氨氮基團。顯然，這2個基因的豐度與甲烷測試結(jié)果成正相關(guān)關(guān)系。此外，編碼能夠?qū)-絲氨酸水解為丙酮酸的D-絲氨酸脫水酶的dsdA基因豐度在CYM中有強的活躍性，進而促進發(fā)酵體系中脂肪酸的生成。

2.3.2 脂肪酸生物合成

在有機物厭氧發(fā)酵過程中，脂肪酸生物合成途徑與VFA的形成密切相關(guān)。因此，進一步分析了脂肪酸生物合成途徑中與VFAs產(chǎn)生相關(guān)的功能基因，相關(guān)功能基因描述見表4。fabG基因在整體功能占比最大，該基因已被報道與酰基還原酶的編碼有關(guān)，?；€原酶以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)作為電子受體[32]，并且在脂質(zhì)代謝和脂肪酸合成中起重要作用。

表4 脂肪酸生物合成相關(guān)功能基因描述

乙酰輔酶a羧化酶對應(yīng)于4個同源基因accA、accB、accC、accD和bccA。其中，accA、accB、accC、accD的相對豐度處于較高水平，并且在CYM中的相對豐度高于其他試驗組(圖5)。KRIVORUCHKO等[33]得出，碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等主要底物被乙酰輔酶a通過常見的代謝途徑降解，它也是脂肪酸生產(chǎn)的前體物質(zhì)。accA、accB、accC和accD參與了代謝模塊中的碳水化合物代謝、能量代謝和脂質(zhì)代謝，accA和accD可以生成C—C鍵，而accC可以在化學(xué)連接模塊中生成C—C和C—H鍵。然而，與其他乙酰輔酶a羧化酶相比，bccA的相對豐度較低，它們在煤代謝過程中的貢獻率相對較低，可以推斷底物煤的加入可能會破壞這2種基因的表達(dá)。

圖5 脂肪酸生物合成相關(guān)功能基因豐度對比

2.3.3 細(xì)胞膜合成

此外，在CYM中的群體感應(yīng)基因的相對豐度最高。群體感應(yīng)是一種調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以展示細(xì)菌的細(xì)胞密度信息，并表達(dá)相應(yīng)的調(diào)節(jié)基因。群體調(diào)控包括毒力因子產(chǎn)生、抗生素合成、細(xì)胞運動、孢子形成和生物膜形成[34-35]。本研究中，與胞外多糖合成和生物膜形成相關(guān)的crp基因[36]相對豐度在CYM中顯著增加(圖6)，該基因描述見表5。生物膜的形成對于保護細(xì)胞免受外界侵襲，提高細(xì)胞對環(huán)境壓力的抵抗力和耐受性非常重要，同時更多的胞外多糖表明有更多的底物為產(chǎn)酸細(xì)菌提供了產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的途徑，這也是CYM中甲烷產(chǎn)量較多的主要原因之一。

圖6 生物膜合成相關(guān)功能基因豐度對比

表5 細(xì)胞膜合成相關(guān)功能基因描述

2.3.4 不同煤階煤制生物甲烷代謝功能的差異討論

在酶水解過程中，水解厭氧菌和兼性細(xì)菌，如梭狀芽孢桿菌、腸桿菌和鏈球菌[37]，產(chǎn)生胞外水解酶(糖苷酶、肽酶或酯酶)[38]，它們破壞煤的大分子基質(zhì)[39]，釋放蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和較小的水溶性有機單體(糖、肽、氨基酸、長鏈脂肪酸和甘油酯)。

隨著煤階的降低，煤中的木質(zhì)素含量會呈現(xiàn)增加的趨勢，然后木質(zhì)素因其在厭氧條件下不可降解性(歸因于胞外酶所需氧氣的缺乏)，降低了木質(zhì)纖維素的比表面積，進而抑制其它有機組分的生物降解以及CH4形成[40-41]。褐煤中的木質(zhì)素含量較其他煤階有所增加，無法為厭氧微生物提供更充足的生存空間，使得產(chǎn)生的相關(guān)基因功能酶有所降低。另外，木質(zhì)素分解產(chǎn)物，如酚醛和酚酸，也可能對產(chǎn)甲烷菌有毒[42]。

有研究證實，底物中所含有的可溶性Ca2+離子可占據(jù)特定的木質(zhì)素表面官能團，防止了胞外酶吸附到木質(zhì)素上，進而增加了厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的高效性和穩(wěn)定性[43-44]。褐煤中降低的Ca2+與較高的木質(zhì)素含量，使得胞外酶更多的吸附于木質(zhì)素表面，從而降低了胞外酶的生物利用性，這是褐煤煤制生物甲烷產(chǎn)量以及檢測的代謝相關(guān)酶含量低于長焰煤的原因之一。

3 結(jié) 論

1)以長焰煤為底物的生物甲烷試驗出現(xiàn)不隨煤階增加而產(chǎn)氣總量減少的結(jié)果，其生物甲烷產(chǎn)量也呈現(xiàn)最大值。

2)隨著底物煤階的升高，滯后期也在逐漸的增加，即高煤階煤制生物甲烷實驗表現(xiàn)出較低的微生物適應(yīng)反應(yīng)環(huán)境的能力。

3)高的煤制生物甲烷產(chǎn)量，其參與微生物代謝功能的相對豐度也最高，且參與輔酶轉(zhuǎn)運與代謝和碳水化合物運輸和代謝這2種代謝功能與最大甲烷生成潛力之間存在良好的線性關(guān)系。

4)生物甲烷產(chǎn)量越高，發(fā)酵體系中參與氨基酸形成與轉(zhuǎn)化、脂肪酸和生物膜合成相關(guān)的功能基因豐度也會提高。