李順勤，賈永秀，賈洪玉，隋文杰*，張 民，劉 銳，吳 濤

（1.天津科技大學(xué)省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，山東濟(jì)南 250100；4.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

尾菜是指蔬菜在種植、采收、運(yùn)輸、銷(xiāo)售及生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)中無(wú)法利用或被拋棄的部分[1-3]。尾菜含水率一般70%～95%，pH 6.0～9.0，可溶性固形物含量5%～19%，主要干物質(zhì)包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等[4-5]。大規(guī)模無(wú)法利用的尾菜，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2019 年我國(guó)蔬菜年產(chǎn)量在7.9 億t 以上，尾菜量保守估計(jì)至少達(dá)2.63 億t[7]。因此，尾菜治理與資源化利用已成為亟需解決的難題。

目前，尾菜的處理方式主要有直接還田、堆肥、青貯飼料與沼氣利用等，在實(shí)際處理中受制于占地面積大、處理周期長(zhǎng)與產(chǎn)品附加值低等多種因素[8-10]。濕解技術(shù)作為一種常用的生物質(zhì)水熱預(yù)處理手段，已逐漸被用于食品領(lǐng)域[11-13]。將尾菜置于反應(yīng)罐，利用飽和蒸汽加熱達(dá)到設(shè)定溫度，并維持一定時(shí)間，短時(shí)間內(nèi)使尾菜組織快速升溫升壓，促進(jìn)物料發(fā)生水熱降解與聚合反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一系列縮合反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)化成為穩(wěn)定的腐植酸類(lèi)物質(zhì)[14-15]。腐植酸（humic substances，HS）是一類(lèi)呈棕黑色或棕褐色，酸性、無(wú)定形的有機(jī)大分子物質(zhì)。依據(jù)溶解性差異，腐植酸可分為富里酸、胡敏酸和胡敏素[16]。其中，富里酸（fulvic acid，F(xiàn)A）具有水溶性好、分子量小、氧化還原能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，含羧基、羥基、酚羥基等多種活性官能團(tuán)，在消炎、減輕潰瘍、抗氧化等方面有顯著療效[17-19]。

基于以上尾菜產(chǎn)生與利用過(guò)程中存在的處理周期長(zhǎng)、產(chǎn)品附加值低的問(wèn)題，本研究采用濕解技術(shù)處理西蘭花廢棄根莖并從中提取純化得到富里酸，并進(jìn)一步考察富里酸的總還原能力以及對(duì)ABTS+自由基、DPPH 自由基、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力，為尾菜資源化利用及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花根莖，收集于天津科技大學(xué)泰達(dá)校區(qū)第二學(xué)生餐廳。

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、抗壞血酸鈉、過(guò)硫酸鉀、過(guò)氧化氫、水楊酸、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯化鐵與三氯乙酸等，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。

三羥甲基氨基甲烷、ABTS、DPPH，生化試劑，國(guó)藥化學(xué)試劑有限責(zé)任公司。

濃鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%～38%），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-200B 試驗(yàn)臺(tái)，河南鶴壁正道生物能源有限公司；CP64 電子天平（0.000 1 g），上海奧豪斯儀器有限公司；MODULYOD-203 真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Thermo fisher 科技公司；DH-101 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐公司；XMTD-204 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，天津市歐諾儀器儀表有限公司；SHZ-82A 振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 富里酸制備

1.3.1 西蘭花濕解處理

將新鮮的西蘭花根莖切片，于70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至相對(duì)含水率為40%。取250.0 g 原料置于反應(yīng)罐內(nèi)，通入飽和水蒸氣至1.1 MPa（184 ℃）、1.7 MPa（204 ℃）與2.3 MPa（220 ℃），并維持10 min，迅速打開(kāi)卸料閥泄壓放料，收集濕解物料，自然風(fēng)干后保存待用。

1.3.2 富里酸提取純化

將濕解物料與原料置于105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥4 h，參考NY/T 1867—2010 富里酸含量測(cè)定[20]。參考IHSS推薦的方法，提取純化富里酸[21]。稱(chēng)取3.0 g 濕解物料或原料，加入0.1 mol/L 氯化氫溶液100.0 mL，在室溫下振蕩提取，1 h 后放置過(guò)夜，搖勻離心，并用中速濾紙過(guò)濾，濾液即為富里酸。并采用XAD-8 型樹(shù)脂和鈉型732 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)行洗脫純化，冷凍干燥后于70 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干，研細(xì)并稱(chēng)量質(zhì)量，即得純化富里酸樣品。

1.4 富里酸抗氧化性測(cè)定

1.4.1 ABTS+自由基清除率測(cè)定

參考包騏林等[22]的方法。稱(chēng)取20.0 mg 富里酸，加20 mL 蒸餾水配制成1.0 mg/mL，分別稀釋為不同梯度富里酸溶液（0.001～1.0 mg/mL）。

ABTS 溶液配制方法：稱(chēng)取過(guò)硫酸鉀與ABTS，配制成終濃度為7.0 mmol/L 的溶液，在黑暗室溫下反應(yīng)12 h。設(shè)定波長(zhǎng)為734 nm，采用pH 7.4 的PBS 緩沖液稀釋反應(yīng)液至吸光度值A(chǔ)0為0.7±0.02，作為待用溶液。

吸取2.0 mL 不同濃度富里酸溶液（0.001～0.05 mg/mL），加入4.0 mL ABTS 稀釋液，緊接著渦旋30 s，于室溫下避光反應(yīng)10 min。以VC 為陽(yáng)性對(duì)照，在734 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。通過(guò)公式（1）計(jì)算其對(duì)ABTS+自由基的清除率。

1.4.2 DPPH 自由基清除率測(cè)定

參考左玉等[18]的方法。樣品溶液配制方法如1.4.1 所述。加入2.0 mL、0.10 mmol/L DPPH 溶液，渦旋30 s，在黑暗室溫下反應(yīng)30 min。設(shè)定波長(zhǎng)為517 nm，以蒸餾水為參比，測(cè)定樣品反應(yīng)液吸光度，記為A1。將2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL 蒸餾水振蕩均勻測(cè)定吸光度A0。將2.0 mL無(wú)水乙醇與2.0 mL 樣品溶液振蕩均勻，測(cè)定吸光度A2。按照公式（2）計(jì)算其對(duì)DPPH 自由基的清除率。

1.4.3 羥基自由基（·OH）清除率測(cè)定

參考段景峰等[23]的方法。樣品溶液配制方法如1.4.1所述。取2.0 mL 6 mmol/L 過(guò)氧化氫溶液、2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液與2.0 mL 樣品溶液，振蕩均勻，置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，緊接著加入2.0 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，置于水浴鍋中反應(yīng)30 min 后取出。設(shè)定波長(zhǎng)為510 nm，以蒸餾水為參比，測(cè)定樣品反應(yīng)液的吸光度，記為A1。同理2.0 mL 過(guò)氧化氫溶液、2.0 mL FeSO4溶液、2.0 mL 蒸餾水、2.0 mL 樣品溶液振蕩均勻，測(cè)定吸光度A2。2.0 mL 過(guò)氧化氫溶液、2.0 mL FeSO4溶液、4.0 mL蒸餾水振蕩均勻，測(cè)定吸光度A0。按照公式（3）計(jì)算其對(duì)·OH 自由基的清除率。

1.4.4 超氧陰離子自由基（O2·-）清除率測(cè)定

參考左玉等[18,23]的方法，樣品溶液配制方法如1.4.1所述。預(yù)先設(shè)定水浴鍋溫度為25 ℃，取pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖溶液5.0 mL 于試管中，置于水浴鍋20 min。將0.5 mL 鄰苯三酚溶液（濃度5.0×10-3mol/L）與2.0 mL 樣品溶液依次加入，渦旋30 s，進(jìn)行水浴反應(yīng)4 min。設(shè)定波長(zhǎng)為320 nm，以1.0×10-2mol/L HCl 溶液為參比，測(cè)定樣品反應(yīng)液的吸光度A1；將上述樣品溶液替換為2.0 mL 蒸餾水，測(cè)定吸光度A0；將鄰苯三酚溶液替換為0.5 mL HCl 溶液，測(cè)定吸光度A2。按照公式（4）計(jì)算其對(duì)O2·-自由基的清除率。

1.4.5 總還原力測(cè)定

參考左玉等[18]報(bào)道的方法，樣品溶液配制方法如1.4.1所述。取1.0 mL 樣品于試管中，依次加入磷酸鹽緩沖液（pH 6.6、0.2 mol/L）2.0 mL 和1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，渦旋30 s，置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min 后，加入10%三氯乙酸溶液2.0 mL 結(jié)束反應(yīng)。取上述反應(yīng)液2.0 mL 于試管中，依次加入2.0 mL 蒸餾水、0.4 mL 三氯化鐵（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%），在室溫下避光反應(yīng)30 min。設(shè)定波長(zhǎng)為700 nm，測(cè)定樣品反應(yīng)液與平行實(shí)驗(yàn)組吸光度值，取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理利用SPSS statistics 24 統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05，作圖采用Origin 9.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕解富里酸條件優(yōu)化

如圖1 所示，未純化前，原料直接提取的富里酸含量為118.1 g/kg；隨著濕解溫度的增加，富里酸含量呈逐漸增加的趨勢(shì)，當(dāng)條件為220 ℃、10 min 時(shí)，濕解后富里酸含量最高，為166.6 g/kg，較原料直接提取提高了38.0%。研究結(jié)果表明，濕解處理可以提高物料中富里酸含量。

由于提取方法為酸提，未純化的富里酸中可能含有大量的單糖、氨基酸、多肽等物質(zhì)，為考察濕解處理對(duì)富里酸得率的實(shí)質(zhì)影響，進(jìn)一步對(duì)粗富里酸進(jìn)行樹(shù)脂純化分離。如圖1 所示，原料中的富里酸純化后得率為6.1 g/kg；濕解溫度為204 ℃時(shí)，純化后富里酸得率最高，為32.9 g/kg，為原料提取的5.4 倍；隨著濕解溫度的增加，富里酸得率呈先上升后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明濕解處理可促進(jìn)半纖維素中乙?；臄嗔眩@著提高富里酸產(chǎn)率；但溫度過(guò)高，過(guò)于激烈的反應(yīng)環(huán)境不利于半纖維素、纖維素等物質(zhì)降解產(chǎn)物的穩(wěn)定存在，促使富里酸進(jìn)一步縮聚或降解為甲酸、糠醛等揮發(fā)性成分。因此，濕解富里酸的最適條件為204 ℃、10 min。

圖1 純化前后濕解富里酸的得率Fig.1 The yield of FA from treated samples before and after purification

2.2 富里酸對(duì)ABTS+自由基的清除能力

如圖2 所示，隨著濃度增加，富里酸清除ABTS+自由基的效果明顯增強(qiáng)。以VC 作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)富里酸具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。當(dāng)添加量為0.05 mg/mL時(shí)，富里酸對(duì)ABTS+自由基清除率為98.9%。富里酸中羧基和醌基等官能團(tuán)形成的芳香共軛體系，同APTS+自由基結(jié)合變?yōu)锳BTS，導(dǎo)致溶液藍(lán)綠色減弱或消失[19]。

圖2 富里酸的ABTS+自由基清除率Fig.2 APTS+radical scavenging of FA

2.3 富里酸對(duì)DPPH 自由基的清除能力

DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的含氮芳香環(huán)自由基[24]。如圖3 所示，在0.01～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，富里酸清除DPPH 自由基作用明顯增強(qiáng)；當(dāng)添加濃度為0.50 mg/mL 時(shí)，富里酸對(duì)DPPH 自由基清除率為97.4%，同富里酸濃度為1.00 mg/mL 時(shí)對(duì)DPPH 自由基的清除率相近。研究結(jié)果表明，富里酸具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，可能是破壞了N-中心自由基穩(wěn)定性而達(dá)到清除效果。富里酸中羧基和醌基等官能團(tuán)形成的芳香共軛體系[18]，同DPPH 自由基的孤對(duì)電子配對(duì)，導(dǎo)致吸收度減弱或消失[19]，富里酸對(duì)DPPH 自由基清除作用與濃度呈一定線性量效關(guān)系。

圖3 富里酸的DPPH 自由基清除率Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of FA

2.4 富里酸對(duì)羥基自由基（·OH）的清除能力

如圖4 所示，在0.2～1.5 mg/mL 范圍內(nèi)，富里酸清除·OH 的能力隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)添加濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，富里酸對(duì)·OH 清除率為43.3%，同等濃度下VC（對(duì)照）對(duì)·OH 清除率接近100%。研究結(jié)果表明，富里酸具有一定的·OH 清除能力?！H 是導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一種活躍的自由基[19]，富里酸中活性基團(tuán)同羥基自由基結(jié)合，終止自由基介導(dǎo)的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[19]。

圖4 富里酸的·OH 清除率Fig.4 ·OH scavenging of FA

2.5 富里酸對(duì)超氧陰離子自由基（O2·-）的清除能力

O2·-在人體中數(shù)量眾多且分布最廣。如圖5 所示，在0.05～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，富里酸清除O2·-作用隨著濃度增加逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，富里酸的O2·-清除率為56.7%，同等濃度下VC（對(duì)照）的O2·-清除率為99.9%。研究結(jié)果表明，富里酸具有一定的O2·-清除作用。富里酸中羧基和醌基等官能團(tuán)形成的芳香共軛體系，同O2·-結(jié)合，達(dá)到清除效果[19]，且富里酸的O2·-清除作用與濃度呈正相關(guān)。

圖5 富里酸的O2·-清除率Fig.5 O2·-scavenging of FA

2.6 富里酸總還原力

如圖6 所示，隨著濃度增加，富里酸的總還原力逐漸增大。當(dāng)濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，富里酸的總還原力吸光值為1.0；以同等濃度VC 為對(duì)照，其吸光度值為3.3。研究結(jié)果表明，富里酸總還原力為VC 的三分之一左右，具有一定的還原能力。富里酸中的部分活性基團(tuán)作為電子給予體，將Fe3+還原為Fe2+，破壞自由基鏈反應(yīng)的電子供體，達(dá)到清除自由基的效果[19]。

圖6 富里酸的總還原力Fig.6 Reduction capacity of FA

3 結(jié)論

研究表明，以富里酸得率為指標(biāo)，得出濕解處理西蘭花根莖的最適條件為204 ℃、10 min，富里酸得率為162.96 g/kg，相比原料提高38.0%。進(jìn)一步采用酸提、XAD-8 型樹(shù)脂和鈉型732 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂制備富里酸，經(jīng)純化后富里酸得率為32.9 g/kg。在0.5 mg/mL 添加濃度下，濕解富里酸對(duì)ABTS+自由基和DPPH 自由基的清除率超過(guò)90%，對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為14.1%與32.3%。可見(jiàn)，富里酸具有較強(qiáng)的ABTS+自由基、DPPH 自由基清除能力，以及一定的羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力，且隨著濕解富里酸濃度的增加，其抗氧化作用增強(qiáng)。