曾靖雯，劉傲璐，王 帥，邢朝鳳，張宗猛，唐敏怡，彭月榮，畢欣耘，李芳紅，趙子建

(廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥學院，廣東 廣州 510006)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE)是一種多發(fā)于青年女性的累及多臟器的自身免疫性結締組織病，具有廣泛的臨床表現(xiàn)。有研究表明其免疫病理反應主要表現(xiàn)為細胞因子、B細胞免疫和T細胞信號轉導的異常[1]。傳統(tǒng)的SLE治療以非特異性的激素和免疫抑制劑為主，長期使用可引起嚴重的副作用和不良反應。因此需要尋找到一種安全可靠的有效治療，替代或減少激素和免疫抑制劑的使用是SLE長期治療的一個重要方向。慢性移植抗宿主病模型(chronic graft versus host disease， cGVH)是通過骨髓移植誘導小鼠的狼瘡特征[2]。我們通過將BM12小鼠淋巴細胞腹腔注射到C57BL/6J(B6)小鼠體內(nèi)，建立cGVH小鼠模型，該模型受體的抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APCs)對供體CD4+T細胞的異源激活導致cGVH，其癥狀與SLE相似[2]。

人類和動物研究表明，ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs)可以抑制炎癥。ω-3 PUFAs主要包括3種，分別為α-亞麻酸(alpha-linolenic acid，α-LA)，其學名為順式十八碳三烯-9，12，15-酸，速記法名稱為18：3 ω-3，是一種含有3個雙鍵的ω-3不飽和脂肪酸；二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)，其學名為順式二十碳五烯-5，8，11，14，17-酸，速記法名稱為20：5 ω-3，是一種含有5個雙鍵的ω-3不飽和脂肪酸；二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)其學名為順式二十二碳六烯-4，7，10，13，16，19-酸，速記法名稱為22：6 ω-3，是一種含有6個雙鍵的ω-3不飽和脂肪酸。它們是必需脂肪酸，人體不能自主合成，需從外界攝入。ω-6 PUFAs主要包括亞油酸(linoleic acid，LA)和花生四烯酸(arachidonic，AA)等，ω-6 PUFAs及其代謝產(chǎn)物具有促炎癥作用。在日常生活飲食中，ω-6/ω-3 PUFAs二者比率已經(jīng)接近20 ∶1。而大量食物含有ω-6 PUFAs，只有少部分食物含有ω-3 PUFAs，從而使得ω-6 PUFAs攝入過多，然而ω-6 PUFAs中的花生四烯酸AA會進一步代謝為前列腺素E2、白三烯 B4 等促炎癥因子，從而引起一些慢性疾病的發(fā)生[3]。ω-3 PUFAs及其代謝產(chǎn)物具有抑制炎癥的作用，與ω-6 PUFAs之間是相互拮抗的關系[3]。因此在食物中有效提高ω-3 PUFAs，同時降低ω-6 PUFAs的含量，平衡二者比例對于相關代謝慢性疾病具有重要意義。研究表明[4-6]，低比例的ω-6/ω-3 PUFAs(接近1 ∶1)可以降低許多慢性疾病的風險，如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥和Ⅰ型糖尿病。

在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，T細胞參與了自身免疫的啟動和持續(xù)，B細胞可通過抗體依賴性或非依賴性促進或抑制自身免疫。Pestka等[7]的一項獨立研究發(fā)現(xiàn)富含ω-3 PUFAs的飲食可延緩狼瘡小鼠的發(fā)作并顯著減輕自身免疫性腎小球腎炎，血漿自身抗體和蛋白尿的嚴重程度。重要的是，這種自身免疫的抑制被發(fā)現(xiàn)與SLE小鼠腎臟或脾臟中CD4+T細胞特異性基因表達的普遍降低有關。有一項關于ω-3 PUFAs靶向B細胞影響同源T細胞活化的研究，健康C57BL/6J小鼠服用魚油可抑制B220+B細胞刺激Th1細胞因子分泌的能力[8]。

前期有研究證明ω-3 PUFAs能夠延緩并減輕MRL/lpr和B/W F1等狼瘡小鼠疾病，但研究主要使用的是富含ω-3 PUFAs的飼料，且沒有對DHA和EPA進行區(qū)分討論[7, 9]。除此之外，在過去探討ω-3 PUFAs對狼瘡小鼠影響的研究中，從未使用過BM12小鼠淋巴細胞誘導的cGVH狼瘡小鼠模型。因此，本課題首次使用了含量高達90%的混合型ω-3 PUFAs和含量高達97%的純化型EPA，探討其對BM12小鼠淋巴細胞誘導的cGVH狼瘡小鼠脾臟淋巴細胞亞群的調節(jié)作用，為進一步探索ω-3 PUFAs應用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床治療提供可行性分析和前期數(shù)據(jù)，為將來利用ω-3 PUFAs作為免疫調節(jié)藥物，輔助或減少副作用明顯的激素類藥物和免疫抑制藥物提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 受體鼠為SPF級雌性C57BL/6 J小鼠(7周齡)，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，供鼠為7～8周齡雌性BM12(I-Abm12B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ)小鼠，購自美國Jackson實驗室。小鼠均飼養(yǎng)于華南理工大學大學城校區(qū)SPF級實驗動物中心，動物中心使用許可證號：SYXK(粵)2017-0178。本實驗所用動物均符合廣東省人民醫(yī)院動物倫理審查標準。

1.1.2主要試劑 90% ω-3 PUFAs乙酯(其中EPA乙酯46.56%，DHA乙酯41.6%，總ω-3 PUFAs乙酯含量為90%，批號：G20140848)和97% EPA乙酯(批號：02200201)購自成都國為生物醫(yī)藥有限公司；單克隆流式抗體CD25 APC(557192)、PD-1 APC(562671)、CXCR5 PE(561988)、CD138 BB700(742124)、B220 PE-Cy7(552772)、CD95 FITC(554257)、GL-7 PE(561530)、染料Fixable Viability Stain780(565388)、刺激阻斷劑(550583)購自美國BD公司；IgG檢測試劑盒mouse IgG Elisa kit(6320)購自美國ADI公司。

1.1.3儀器 Cytation5多功能微孔檢測分析系統(tǒng)(美國Biotek)；低溫離心機(美國Thermo)；-80 ℃冰箱(中國美菱)；6色流式細胞儀(美國Cytek)；C6 plus流式細胞儀(美國BD)；GC氣相色譜儀(美國Agilent)。

1.2 方法

1.2.1無菌脾臟單個細胞懸液 脫頸椎處死小鼠，75%酒精放置10 min，在超凈工作臺內(nèi)取小鼠脾臟，放入無菌PBS中，用鑷子拉碎，70目篩網(wǎng)過濾除去組織和團塊，4 ℃、300 g離心 10 min，加入預冷的紅細胞裂解液，充分混勻振蕩，4 ℃靜置5 min，4 ℃、300 g離心 10 min，去上清，適量無菌PBS重懸，獲得無菌脾臟單個細胞懸液。

Fig 1 Time distribution of modeling and administration in cGVH mice

1.2.2動物分組及cGVH模型小鼠的建立 40只C57BL/6J小鼠被隨機分為正常對照組，模型對照組，90% ω-3 PUFAs組，97% EPA組，每組10只。模型組、90% ω-3組以及97% EPA組小鼠均接受腹腔注射1×108個供體BM12小鼠脾臟懸液細胞，建立cGVH模型小鼠，正常對照組腹腔注射等體積PBS。從造模當天開始，90% ω-3 PUFAs組灌胃含90% ω-3多不飽和脂肪酸的乙酯型魚油(4 g·kg-1·d-1)，97% EPA組灌胃含97% EPA的乙酯型魚油(4 g·kg-1·d-1)，正常和模型對照組灌胃生理鹽水，連續(xù)2周。于末次給藥后d 2，所有小鼠均處死，進行免疫指標檢測，并取實驗小鼠的血樣。小鼠模型建立和給藥時間分布如Fig 1所示。

1.2.3流式細胞術分析 調整小鼠脾臟淋巴細胞數(shù)量為1×109個·L-1，先進行細胞表面染色，破膜后進行核內(nèi)染色，洗滌后重懸細胞，上流式細胞儀檢測。對于細胞內(nèi)因子染色，各組細胞在培養(yǎng)的最后5 h內(nèi)加入刺激阻斷劑(2 mL·L-1)，破膜后進行胞內(nèi)染色，洗滌后重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.2.4ELISA檢測 小鼠眼球取血，分離血清，采用ELISA法檢測小鼠血清中總IgG水平。

敦禮睜開眼，仍然靠著靠背，先把右腳從被子里挪出來垂到床邊，然后坐直身子，右手撐著床，左手把被角掀開，挪動了一下屁股，坐到床沿上，將雙腳伸進床邊擺放的一雙灰色有暗花的棉拖鞋里。雖然一切動作都是極緩慢的，敦禮卻感到力氣被抽空了一樣，他不得不停了一下，好使自己緩過勁兒來，然后，站在地上。敦禮覺得從頭到腳都輕飄飄的，像一片紙，甚至是一縷風，舉手投足完全沒有一絲質感。腦子里的空洞又出現(xiàn)了。敦禮這次聽到的不是草籽花的低吟淺唱，而是一首鋼琴曲，感覺非常熟悉，一時卻怎么也想不起來到底是什么曲子。

2 結果

2.1 ω-3 PUFAs對小鼠外周血中多不飽和脂肪酸含量和比例的影響氣相色譜檢測各組小鼠外周血中ω-3 PUFAs含量，結果如Tab 1所示。與PBS組相比，90% ω-3組和97% EPA組小鼠外周血中EPA含量明顯高于PBS組(P<0.01)，90% ω-3組和97% EPA組小鼠外周血中AA含量明顯低于PBS組(P<0.01)；90% ω-3組小鼠外周血中DHA含量明顯高于PBS組中DHA的含量(P<0.01)；而與PBS組相比，cGVH組小鼠外周血中ω-3 PUFAs含量差異沒有統(tǒng)計學意義。此外，ω-6/ω-3 PUFAs的比例也發(fā)生了明顯變化，PBS組、cGVH組、90% ω-3組和97% EPA組中二者比例分別為6.20、5.74、1.66和1.55。說明魚油干預能夠有效改變小鼠外周血中ω-6/ω-3 PUFAs的含量和比例，為進一步分析ω-6/ω-3 PUFAs對cGVH小鼠的影響奠定了基礎。

2.2 ω-3 PUFAs對小鼠體重的影響cGVH小鼠造模后，會出現(xiàn)腹水現(xiàn)象，從而導致小鼠體質量增加。為了探討補充ω-3 PUFAs對小鼠腹水的影響，小鼠造模后，ω-3 PUFAs連續(xù)灌胃2周，每2 d監(jiān)測小鼠體質量變化。由Tab 2可以看出，與PBS組相比，cGVH組在造模后d 10、12、14，小鼠體質量明顯高于PBS組(P<0.05)；90% ω-3組在造模后d 12、14，小鼠體質量明顯高于PBS組(P<0.05)；97% EPA組在造模后d 12，小鼠體質量明顯高于PBS組(P<0.05)。但與cGVH組相比，90% ω-3和97% EPA組小鼠體質量差異沒有統(tǒng)計學意義。結果表明，小鼠造模后d 10開始出現(xiàn)腹水累積癥狀，而補充ω-3 PUFAs后，小鼠腹水產(chǎn)生被延后，但跟cGVH小鼠相比，發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFAs并不能阻止cGVH小鼠腹水的形成。

Tab 1 Analysis of ω-3 PUFAs and ω-6 PUFA compositions and ratios in blood samples of mice n=10)

Tab 2 Effect of ω-3 PUFAs treatment on body weight change of mice n=10)

Fig 2 Effects of n-3 PUFAs on subsets of spleen T lymphocytes in mice

2.3 ω-3 PUFAs對小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響

2.3.1對Treg細胞亞群影響 Treg具有抑制免疫應答、拮抗炎癥因子作用。為了探討補充ω-3 PUFAs對小鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響，脾細胞移植2周后，提取各組小鼠脾臟淋巴細胞，流式檢測T細胞亞群百分比，結果顯示：與PBS組相比，cGVH組明顯下調Treg亞群比例(P<0.01)，而97% EPA組明顯上調Treg亞群比例(P<0.01)。而與cGVH組相比，90% ω-3和97% EPA組明顯上調Treg亞群比例(P<0.01)(Fig 2A)。結果表明ω-3 PUFAs能夠明顯上調cGVH狼瘡小鼠脾臟淋巴細胞Treg亞群比例。

2.3.2對TFH細胞亞群的影響 濾泡B輔助T細胞(TFH)細胞的主要功能是增加高親和力B細胞和長壽漿細胞的形成，并幫助他們轉移到發(fā)生中心(germinal center，GC)。為了探討補充ω-3 PUFAs對小鼠脾臟淋巴細胞TFH亞群的影響，流式檢測各組小鼠脾臟淋巴細胞TFH亞群百分比，結果顯示：與cGVH組相比，90% ω-3組明顯下調TFH亞群比例(P<0.01)，但與97% EPA組的差異無統(tǒng)計學意義(Fig 2B)。結果表明ω-3 PUFAs能夠明顯下調cGVH狼瘡小鼠脾臟淋巴細胞TFH亞群比例。

Fig 3 Effects of n-3 PUFAs on subsets of spleen B lymphocytes in mice

2.4 ω-3 PUFAs對小鼠脾臟B淋巴細胞亞群的影響

2.4.1對GC B細胞亞群影響 GC是在自身免疫疾病中產(chǎn)生自身抗體的主要致病區(qū)域。為了探討補充ω-3 PUFAs對小鼠脾臟B淋巴細胞GC B亞群的影響，流式檢測各組小鼠脾臟淋巴細胞GC B亞群百分比，結果顯示：與PBS組相比，cGVH組GC B亞群顯著上調，但與cGVH組相比，90% ω-3和97% EPA組明顯下調GC B亞群比例(P<0.01)(Fig 3A)。結果表明ω-3 PUFAs能夠明顯下調cGVH狼瘡小鼠脾臟淋巴細胞GC B亞群比例。

2.4.2對漿細胞亞群影響 漿細胞是免疫系統(tǒng)中釋放大量抗體的一種B細胞。我們分析了ω-3 PUFAs干預的cGVH小鼠脾臟中漿細胞亞群的變化。結果顯示，與cGVH組相比，90% ω-3和97% EPA組明顯下調漿細胞亞群比例(P<0.01)，且97% EPA組漿細胞亞群比例與PBS組持平(Fig 3B)。結果表明ω-3 PUFAs能夠明顯下調cGVH狼瘡小鼠脾臟淋巴細胞漿細胞亞群比例。

2.5 ω-3 PUFAs對小鼠血清中總IgG含量影響ELISA檢測cGVH小鼠血清中總IgG結果表明：與PBS組相比，造模組小鼠血清中總IgG含量均明顯增加，但與cGVH組相比，97% EPA組小鼠血清中總IgG含量明顯減少(P<0.05)，與90% ω-3組的差異無統(tǒng)計學意義(Fig 4)。結果表明高含量EPA能夠減少cGVH狼瘡小鼠血清中總IgG含量，緩解cGVH狼瘡小鼠病癥。

Fig 4 Levels of serum IgG in cGVH mice (n=8) ##P<0.01 vs PBS; *P<0.05 vs cGVH.

3 討論

研究顯示，我國SLE的患病率估計為50～100/10萬人，遠高于歐洲和北美國家的 10～35/10萬人[10]。SLE可能與人群的遺傳、地理環(huán)境和激素刺激等多種因素有關，但參與SLE確切的細胞和分子機制仍然知之甚少。現(xiàn)在，對遺傳易感性的最新研究表明，環(huán)境觸發(fā)因素通常是通過與疾病相關多態(tài)性的細胞途徑起作用的。目前，有關SLE的免疫系統(tǒng)激活的特征是B細胞和T細胞過度增殖，以及對自身抗原的免疫耐受性喪失[11]。

因此，抑制T、B細胞增殖，進而減少自身抗體產(chǎn)生成為SLE治療的重要方向。目前，T、B細胞相關抑制劑用于治療SLE的藥物主要有Cyclophosphamide、Cyclosporine、Mycophenolate mofetil等。近年來，更是出現(xiàn)一些生物制劑，如Belimumab、Rituximab等單抗，能夠靶向B淋巴細胞刺激因子，抑制B淋巴細胞增殖和活化[11]。但傳統(tǒng)治療藥物伴隨著嚴重的副作用，而生物制劑物價格昂貴，且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)生物制劑的局限性，不同的細胞因子和細胞可能在不同的階段、不同的臨床表現(xiàn)中發(fā)揮不同的作用[11]。

有研究表明，補充高劑量ω-3 PUFAs可以抑制自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡MRL/lpr小鼠淋巴細胞增殖且延后腎臟疾病的發(fā)生，并從而延長其生存期[9]。Das等[12]研究報道口服補充EPA和DHA可延長SLE的緩解期，且無任何副作用。

在大多數(shù)魚油研究中，主要使用了ω-3 PUFAs混合形式進行研究，而對EPA和DHA的作用尚未進行區(qū)分，盡管魚油中含有大量的DHA，但魚油的有利作用主要歸因于EPA。而近年來越來越多的研究聚焦于ω-3 PUFAs中關鍵成分EPA對各種疾病的影響。有研究已證明純化的EPA(而非DHA)具有潛在的抗動脈粥樣硬化性抗氧化劑和膜穩(wěn)定作用[13]。為了探討ω-3 PUFAs混合形式和純化EPA在狼瘡小鼠模型中是否發(fā)揮不同的免疫調節(jié)作用，本研究首次利用高含量ω-3 PUFAs和EPA對BM12小鼠脾臟淋巴細胞誘導的cGVH狼瘡小鼠模型進行干預，探討了ω-3 PUFAs混合形式和純化EPA對cGVH狼瘡小鼠T、B淋巴細胞亞群分化的影響。

在自身免疫疾病中，T、B免疫細胞參與SLE的發(fā)病。Treg細胞能夠抑制自身免疫，保護組織免受損傷[14]。有研究報道，SLE患者Treg水平降低，與SLE疾病活動指數(shù)有關[15]。而Carlsson等[16]發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFAs能夠上調Treg水平。本課題組在Ⅰ型糖尿病模型中的前期結果也證實了ω-3 PUFAs對Treg的上調作用[5]。本研究結果提示，ω-3 PUFAs在cGVH狼瘡小鼠體內(nèi)能夠通過明顯上調Treg亞群來糾正SLE免疫細胞和因子之間的平衡關系。

TFH細胞對生發(fā)中心的形成具有重要作用，一旦生發(fā)中心形成，就需要TFH細胞維持生發(fā)中心，并調節(jié)生發(fā)中心B細胞向漿細胞和記憶B細胞的分化。在狼瘡小鼠中，疾病發(fā)展伴隨著TFH細胞數(shù)量增加[15]。本研究發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFAs在cGVH狼瘡小鼠體內(nèi)能夠顯著下調TFH亞群，干預B細胞向漿細胞的分化的進程，從而延緩SLE的進展。

本研究結果顯示，ω-3 PUFAs改變cGVH狼瘡小鼠體內(nèi)B淋巴細胞亞群分化百分比，它可以顯著下調GC B和漿細胞亞群。B細胞亞群的比例與自身抗體的產(chǎn)生有一定的相關性，在SLE患者中，B細胞發(fā)育階段以及漿母細胞/漿細胞在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要的作用。有研究表明，給C57BL/6J小鼠喂食3周高劑量的ω-3 PUFAs，B細胞脂筏聚集減少[17]。有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者血清IgG水平升高，并與疾病嚴重程度相關[18]。而本研究結果證實，97% EPA組cGVH狼瘡小鼠血清中總IgG水平顯著降低，說明高含量EPA可以降低狼瘡小鼠血清IgG水平，緩解狼瘡小鼠的臨床表現(xiàn)。

以上研究結果提示，T、B淋巴細胞亞群在SLE發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，高含量ω-3 PUFAs通過調節(jié)T、B淋巴細胞亞群減輕cGVH狼瘡小鼠的免疫失衡，具有突出的免疫調節(jié)作用，這對于高含量ω-3 PUFAs用于SLE治療或輔助治療具有指導意義，但ω-3 PUFAs能否通過調節(jié)免疫平衡而影響SLE終末期器官損傷，還有待進一步的研究。