戈文斌，張琨，羅世通，周治，劉亞麗

1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，云南 昆明（650106）；2.云南大學(xué)附屬醫(yī)院正畸科，云南 昆明（650021）

牙周炎是以牙周組織的破壞為主要表征的炎癥感染性疾病，嚴(yán)重威脅人類口腔健康［1］，對(duì)受損牙周組織的修復(fù)再生是牙周炎治療的研究熱點(diǎn)［2］。作為牙周組織來源的干細(xì)胞，牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）在牙周組織抗炎及骨量的維持和修復(fù)方面具有重要作用［3］，是牙周組織損傷修復(fù)再生的主要候選細(xì)胞［4］。采取適當(dāng)?shù)牟呗?，提高PDLSCs的生物學(xué)性能，具有重要的意義。表觀遺傳可以調(diào)控基因和蛋白的表達(dá)水平及功能而無需改變DNA序列，從而對(duì)細(xì)胞的增殖與分化產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響機(jī)體發(fā)育與疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸，參與轉(zhuǎn)錄激活和抑制的蛋白因子在其中起到重要作用［5］。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）是重要的表觀遺傳調(diào)控分子，可以去除組蛋白賴氨酸側(cè)鏈上的乙?；?，逆轉(zhuǎn)染色質(zhì)的開放狀態(tài)，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)濃縮，從而阻遏基因的轉(zhuǎn)錄［6］。在細(xì)胞的增殖、分化等過程中，HDAC家族通過調(diào)控組蛋白的乙酰化水平發(fā)揮重要作用［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者牙周組織中HDAC9表達(dá)上調(diào)，提示HDAC9可能參與了牙周炎的進(jìn)展過程［9］。但HDAC9在牙周組織損傷修復(fù)再生方面的研究較少，本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默PDLSCs中HDAC9的表達(dá)，探討HDAC9對(duì)PDLSCs增殖與成骨分化的影響，旨在為干細(xì)胞應(yīng)用于牙周疾患的治療提供新的視角和策略。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基（SH30265.01B，Hyclone，美國），胎牛血清（AC03L055，上海李記生物科技有限公司，中國），CD34抗體（CD34-581-01）、CD45抗體（MHCD4501）、CD90抗體（A15794）、CD105抗體（MHCD10504）（Thermo Scientific，美國），siHDAC9序列及其陰性對(duì)照siNC序列（上海吉瑪，中國），細(xì)胞周期試劑盒（MA0334，大連美侖，中國），CCK-8試劑盒（MA0218，大連美侖，中國），兔抗人增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（10205-2-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（10494-1-AP）（Proteintech，中國），兔抗人RUNX2抗體（A2851，ABclone，中國），山羊抗兔二抗（511203，成都正能，中國），成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（HUXMA-90021，Cyagen，美國），總RNA提取試劑盒（LS1040，Promega，美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047，Takara，日本），qRT-PCR熒光染料試劑盒（RR820，Takara，日本），引物合成（上海生工，中國），流式細(xì)胞儀（CyFlow?Space，Partec，德國），酶標(biāo)儀（Multiskan MK3，Thermo Scientific，美國），凝膠成像儀（ChemiDocTMXPS+，Bio-Rad，美國），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudio5，Applied Biosystems，美國）。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs體外培養(yǎng)與鑒定 取得昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)（倫理號(hào)：KYKQ2021MEC028）并經(jīng)患者知情同意，收集12～20歲患者的因正畸治療而拔除的健康前磨牙。酶解組織塊法原代培養(yǎng)PDLSCs，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%以上時(shí)，采用有限稀釋克隆法純化并擴(kuò)增細(xì)胞。取第3代PDLSCs，胰酶消化，含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，分裝至EP管中，加入相應(yīng)的CD34、CD45、CD90、CD105抗體，4℃避光孵育0.5 h，含2%胎牛血清的PBS洗2次并重懸，流式細(xì)胞儀測(cè)定CD分子的表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 由上海吉瑪公司構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需的siHDAC9和siNC序列，取第3代PDLSCs，接種到6孔板中，當(dāng)PDLSCs密度達(dá)70%以上時(shí)，饑餓12 h，分為siNC組和siHDAC9組，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA。轉(zhuǎn)染24 h后，qRT-PCR測(cè)定干擾效果。siRNA序列和引物序列見表1。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) ①流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：siNC組和siHDAC9組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA。轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集各組細(xì)胞，4℃下75%冷乙醇固定18 h，加入染色工作液（按染色緩沖液∶碘化丙啶染色液∶RNase A＝100∶5∶2的比例配制），37℃孵育0.5 h，試驗(yàn)重復(fù)3次（n＝3），流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析。

②CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：以每孔3×103個(gè)細(xì)胞的量接種PDLSCs到96孔板中，分別轉(zhuǎn)染siHDAC9與siNC，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)調(diào)零孔，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染1、2、3、4 d后取出細(xì)胞，加入含CCK-8的培養(yǎng)基，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm時(shí)的OD值，繪制生長曲線。

③Western blot檢測(cè)PCNA的蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染48 h后，提取各組總蛋白，將蛋白等質(zhì)量上樣電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉0.5 h，加入相應(yīng)一抗，4℃過夜孵育，加入二抗孵育1.5 h，在凝膠成像儀中顯影，保存圖片并分析。

1.2.4 成骨分化檢測(cè) ①qRT-PCR檢測(cè)RUNX2、ALP的mRNA表達(dá)：轉(zhuǎn)染24 h后，加入成骨誘導(dǎo)液開始誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2～3 d更換1次誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)7 d后，提取各組總RNA，測(cè)定總RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，配制qRT-PCR的反應(yīng)液，對(duì)mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量。計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 siRNA序列和qRT-PCR引物序列Table 1 Sequences of siRNA and qRT-PCR primers

②Western blot檢測(cè)RUNX2的蛋白表達(dá)：誘導(dǎo)7 d后，提取各組總蛋白，Western blot檢測(cè)RUNX2的蛋白表達(dá)。

③茜素紅染色：14 d后，4%中性甲醛溶液室溫固定0.5 h，茜素紅室溫染色5 min，PBS洗3次，觀察染色效果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間的差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs體外培養(yǎng)與鑒定

原代細(xì)胞從組織塊周圍爬出，呈紡錘形，成簇生長（圖1a）；細(xì)胞傳代后狀態(tài)良好，呈長梭形，放射狀或旋渦狀簇集生長，逐漸融合成片（圖1b）。

Figure 1 Cultivation of PDLSCs圖1 PDLSCs的培養(yǎng)

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的細(xì)胞陰性表達(dá)CD34（0.72%）（圖2a）、CD45（1.08%）（圖2b），陽性 表達(dá)CD90（97.84%）（圖2c）、CD105（98.02%）（圖2d），與PDLSCs表型相符，說明細(xì)胞為間充質(zhì)來源。

Figure 2 Identification of PDLSCs by flow cytometry圖2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定PDLSCs

2.2 轉(zhuǎn)染后HDAC9的mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，通過qRT-PCR檢測(cè)HDAC9 mRNA表達(dá)，相較于siNC組，siHDAC9組PDLSCs中HDAC9 mRNA表達(dá)降低（t＝13.431，P＜0.01），表明沉默有效（圖3）。

Figure 3 Relative mRNA expression of HDAC9 after transfection圖3 轉(zhuǎn)染后HDAC9 mRNA表達(dá)

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，siHDAC9組PDLSCs增殖指數(shù)PI（S期+G2/M期細(xì)胞占比）（37.64±0.53）%大于siNC組（33.52±0.44）%（t＝-10.352，P＜0.01）（圖4）。

Figure 4 Cell cycle of PDLSCs after HDAC9 silencing圖4 HDAC9沉默后PDLSCs細(xì)胞周期

2.3.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，1 d時(shí)，2組PDLSCs的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2、3、4 d時(shí)，siHDAC9組PDLSCs的OD值高于siNC組（P＜0.05），siHDAC組PDLSCs增殖活性較強(qiáng)（圖5）。

Figure 5 Proliferation of PDLSCs after HDAC9 silencing圖5 HDAC9沉默后PDLSCs細(xì)胞增殖活性

2.3.3 Western blot檢測(cè)PCNA的蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測(cè)PCNA的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，siHDAC9組PCNA蛋白表達(dá)高于siNC組（t＝-13.267，P＜0.01）（圖6）。

Figure 6 Protein expression of PCNA after HDAC9 silencing圖6 HDAC9沉默后PCNA蛋白表達(dá)

2.4 成骨分化檢測(cè)

2.4.1 qRT-PCR檢測(cè)RUNX2、ALP的mRNA表達(dá) 成骨誘導(dǎo)7 d，qRT-PCR檢測(cè)RUNX2、ALP的mRNA表達(dá)，與siNC組比較，siHDAC9組RUNX2 mRNA表達(dá)上調(diào)（t＝-16.719，P＜0.01），ALPmRNA表達(dá)上調(diào)（t＝-4.152，P＜0.05）（圖7）。

2.4.2 Western blot檢測(cè)RUNX2的蛋白表達(dá) 成骨誘導(dǎo)7 d，Western blot檢測(cè)RUNX2的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，siHDAC9組高于siNC組（t＝-15.726，P＜0.01）（圖8）。

Figure 7 Relative mRNA expression of RUNX2 and ALPafter HDAC9 silencing圖7 HDAC9沉默后RUNX2、ALPmRNA相對(duì)表達(dá)量

Figure 8 Protein expression of RUNX2 after HDAC9 silencing圖8 HDAC9沉默后RUNX2的蛋白表達(dá)量

Figure 9 Alizarin red staining after HDAC9 silencing圖9 HDAC9沉默后茜素紅染色

2.4.3 茜素紅染色 成骨誘導(dǎo)14 d，茜素紅染色觀察，結(jié)果顯示，siHDAC9組的顯色程度高于siNC組，顯微鏡下可見siHDAC9組的礦化結(jié)節(jié)多于siNC組（圖9）。

3 討論

牙周炎的傳統(tǒng)治療方法雖能控制炎癥，阻斷或延緩疾病的進(jìn)展，但對(duì)缺損牙周組織的修復(fù)效果欠佳。因而，控制疾病的進(jìn)展、修復(fù)受損的牙周組織是牙周炎治療的難點(diǎn)，尋求穩(wěn)定而可靠的再生技術(shù)具有重要的意義［2］。牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）作為一種間充質(zhì)來源的干細(xì)胞，具有高度增殖和多向分化能力［10］，在修復(fù)與再生領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注［11］。Liu等［12］從小型豬拔除的牙齒中獲取自體PDLSCs并用于治療牙周缺損，發(fā)現(xiàn)PDLSCs能夠再生因牙周炎而受損的牙周組織。因此，干細(xì)胞療法能夠有效促進(jìn)受損組織的再生，這為牙周炎的治療提供了一種新的思路［13］。采取適宜的策略，對(duì)PDLSCs生物學(xué)特性進(jìn)行維系和改進(jìn)，對(duì)應(yīng)用其進(jìn)行損傷修復(fù)具有重要價(jià)值。

RNA干擾現(xiàn)象是一種基因轉(zhuǎn)錄后沉默的現(xiàn)象，其中siRNA可作為介導(dǎo)子降解相應(yīng)的mRNA，從而阻遏基因的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)利用此現(xiàn)象設(shè)計(jì)特異性siRNA用于沉默相應(yīng)基因的表達(dá)，與其他基因敲除方法相比，其不僅操作較為簡便，價(jià)格實(shí)惠，且具有高度的特異性［14］。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是利用脂質(zhì)體攜帶目的分子通過膜融合或直接穿膜的方式將目的分子轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中的方法，與病毒轉(zhuǎn)染法、電穿孔轉(zhuǎn)染法等其他轉(zhuǎn)染方法相比，其具有易于操作、重復(fù)性高、對(duì)細(xì)胞損害小等優(yōu)點(diǎn)［15］。本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建HDAC9的siRNA并用Lipofectamine 2000將其轉(zhuǎn)染至PDLSCs中，然后通過qRT-PCR檢查干擾效果，發(fā)現(xiàn)siRNA聯(lián)合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染能夠有效降低HDAC9的表達(dá)，可為相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定良好的基礎(chǔ)。

PDLSCs的增殖與成骨分化潛力對(duì)其骨量維持和修復(fù)功能的發(fā)揮至關(guān)重要［3，16］。在諸多生理病理過程中，一系列的相關(guān)因子參與其中，可通過調(diào)控某些關(guān)鍵因子，維系和改進(jìn)PDLSCs的增殖與成骨分化潛力。表觀遺傳在疾病的進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸中扮演著重要的角色［17］。包括HDAC9在內(nèi)的HDACs作為表觀遺傳中蛋白乙酰化水平的重要調(diào)控因子，可參與諸多細(xì)胞的生物學(xué)過程。本實(shí)驗(yàn)選取能夠在核質(zhì)間穿梭的Ⅱ類HDACs HDAC9探討其對(duì)基于PDLSCs的損傷修復(fù)的影響。

Rastogi等［18-19］研究發(fā)現(xiàn)，miR-377的表達(dá)下調(diào)可使HDAC9的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展；而使用siRNA下調(diào)HDAC9的表達(dá)，則可導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞阻滯，抑制細(xì)胞的增殖，抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。然而有趣的是，Luo等［20］采用一定濃度的HDAC抑制劑刺激牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）后，發(fā)現(xiàn)HDAC9等HDACs的表達(dá)被抑制，組蛋白H3和H4的乙酰化水平升高，而DPSCs增殖能力上調(diào)，提示HDAC9表達(dá)的下調(diào)對(duì)DPSCs的增殖或起到一定的促進(jìn)作用。在對(duì)細(xì)胞成骨分化的調(diào)控方面，HDAC9似乎也表現(xiàn)出不同的作用。Chen等［21］研究發(fā)現(xiàn)，HDAC9的高表達(dá)可促進(jìn)RUNX2對(duì)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)，增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨分化能力；HDAC9的下調(diào)則可使MSCs的成骨分化失衡，進(jìn)而誘發(fā)骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生。而Zhang等［22］的研究則顯示，HDAC9沉默可能通過改變細(xì)胞自噬水平等方式，致使小鼠MSCs的礦化結(jié)節(jié)形成增多，RUNX2、ALP的表達(dá)上調(diào)，HDAC9的沉默對(duì)小鼠骨缺損的骨量恢復(fù)發(fā)揮了積極作用。此外，劉凡［23］的研究顯示，HDAC抑制劑可通過NF-κB通路和Wnt通路增強(qiáng)脂多糖刺激下牙齦干細(xì)胞（gingival stem cells，GSCs）的成骨分化能力。以上研究表明，HDAC9可參與細(xì)胞的增殖和成骨分化過程，但最終導(dǎo)致的影響不盡相同。有學(xué)者分析認(rèn)為，HDAC9對(duì)細(xì)胞增殖和成骨分化的不同作用可能與細(xì)胞來源和種類的差異、不同作用信號(hào)之間的差異等因素有關(guān)［24］。HDAC9對(duì)PDLSCs的增殖和成骨分化的影響尚不清楚。

本研究通過多種生物學(xué)方法檢測(cè)顯示，沉默PDLSCs可使PDLSCs的增殖能力增強(qiáng)，同時(shí)亦可使PDLSCs中礦化結(jié)節(jié)等的產(chǎn)生增多，促進(jìn)PDLSCs的成骨分化，提示HDAC9或可對(duì)PDLSCs的增殖和成骨分化發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。這為通過細(xì)胞移植或自體細(xì)胞干預(yù)等方式將PDLSCs應(yīng)用于牙周疾患的治療提供了新的視角和策略，未來或可針對(duì)此設(shè)計(jì)藥物，提高PDLSCs的損傷修復(fù)能力。

同時(shí)，本研究也為進(jìn)一步探究相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，但HDAC9調(diào)控PDLSCs的增殖與成骨分化的作用靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路，以及在紛繁復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是否存在何種相互作用尚不明確，有待未來深入研究，相關(guān)問題的闡明將會(huì)為HDAC9在基于PDLSCs的牙周疾患防治中的精確應(yīng)用指明方向。