柏晶晶，胡文彬，汪 麗，周 政，王立峰，趙正洪，何予卿

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070；2. 湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125； 3. 萬年縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，江西 上饒 335599； 4. 湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長沙 410125）

堊白是指在肉眼觀察下存在于稻米中白色不透明部分，按照分布位置可分為腹白、心白和背白。堊白形成會造成大米透明度降低，商品外觀變差，影響其市場價值；另外，堊白還能降低稻米硬度，造成稻米加工的商品率下降；雖然堊白粒率的增多能提高米飯蓬松度，但適口性下降十分明顯，米飯食味變差[1]，因此，堊白的遺傳研究對水稻新品種培育有著重要的指導(dǎo)意義。

堊白是一個調(diào)控機(jī)理十分復(fù)雜的性狀，雖然容易因環(huán)境而發(fā)生改變，但主要還是基因型所決定。目前已經(jīng)報道水稻堊白相關(guān)QTL或基因大約有80多個，第一個被克隆堊白基因是Chalk5[2]；還有一些由突變體克隆的堊白基因，如GOT1B、Os-SMK1、FucT、OsLTPL36、SSG4等[3-8]。Chalk5增加堊白粒率，尤其是增加水稻腹白的形成幾率；它通過編碼胚乳液泡焦磷酸合成酶V-PPase，使V-PPase轉(zhuǎn)運(yùn)液泡上的H+離子，從而影響液泡內(nèi)外pH值，使其動態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致水稻堊白產(chǎn)生，使水稻外觀和食味品質(zhì)受到影響。

Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，gpa4基因突變體中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在缺陷，使得囊泡定位的VPE1前體增加，細(xì)胞內(nèi)積累更多的57 kD谷蛋白前體，造成GluA和GluB含量增加，并在胚乳中形成松散的淀粉顆粒，從而導(dǎo)致gpa4突變體植株中儲藏蛋白合成缺陷。Li等[5]研究發(fā)現(xiàn)，OsSMK1-1基因純合突變體水稻種子呈現(xiàn)癟縮，胚乳呈現(xiàn)全堊白，其主要原因是因?yàn)镺sSMK1在線粒體基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，該基因能使水稻線粒體nad7在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生堿基突變，即第836位的胞嘧啶（C）突變?yōu)槟蜞奏ぃ║），進(jìn)而造成線粒體異常，最終導(dǎo)致水稻籽粒胚以及胚乳發(fā)育受到限制，形成癟縮、全堊白。SSG4編碼一個功能未知新蛋白，該蛋白能直接調(diào)控水稻胚乳中淀粉顆粒的大小。Matsushima等[8]比較ssg4基因突變體與對照組日本晴發(fā)現(xiàn)，突變體中的堊白率明顯提升，且胚乳中的淀粉顆粒顯著增大。

此外，還有許多影響水稻堊白的基因未被發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控機(jī)制尚不明確，需要研究人員進(jìn)一步去挖掘和研究。研究選用9311和農(nóng)香32兩個秈稻品種，雜交后得到F1代，再自交得到192株F2代，旨在運(yùn)用分子標(biāo)記進(jìn)行定位，找到水稻堊白相關(guān)的QTL，為以后基因的精細(xì)定位和克隆提供依據(jù)，也將為水稻品質(zhì)改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

以常規(guī)秈稻9311為母本，優(yōu)質(zhì)秈稻農(nóng)香32為父本，雜交后得到的F1代，然后自交獲得F2代作圖群體，共192個單株及其衍生F2∶3株系。

1.2 材料種植

2019年在武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田種植試驗(yàn)材料，將F2代種子種2個小區(qū)，每個小區(qū)共8行，每行種12株，共192株。2020年于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田種植182個株系，每個株系種植12株，每10行分為一個小區(qū)。水肥管理和病蟲害防治均參考當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)田間管理。

1.3 水稻堊白考察

將水稻用礱谷機(jī)去掉穎殼，去除綠色糙米，隨機(jī)抽取200粒左右，在堊白測定儀下進(jìn)行堊白的考察。按照堊白的位置不同，將其分為腹白、背白、心白和無堊白，考察并統(tǒng)計腹白、背白、心白和無堊白糙米數(shù)，計算各類堊白占取比例，計算公式：各類堊白粒率=（各類堊白米粒數(shù)/總的米粒數(shù)）×100%，并記錄數(shù)據(jù)。

1.4 分子標(biāo)記檢測

取單株葉片，利用CTAB法[9]抽提DNA，使用多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果；記錄基因型，并以A、B、H表示。

1.5 遺傳連鎖圖譜繪制

結(jié)合基因型和表型，利用R語言中的OneMap構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；通過WinQTLCart 2.5軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法得到QTL定位信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體表型考察

對群體的表型進(jìn)行考察分析，發(fā)現(xiàn)2019年武漢種植的9311/農(nóng)香32 F2單株腹白粒率均值為1.89%，范圍在0.00%~7.41%；背白粒率均值為0.61%，范圍在0.00%~11.76%；心白粒率均值為4.99%，范圍在0.00%~18.93%；堊白粒率均值為7.57%，范圍在0.00%~27.45%；對2020年武漢種植的9311/農(nóng)香32 F3株系表型考察，發(fā)現(xiàn) F3群體的腹白粒率均值為3.53%，范圍在0.00%~23.68%；背白粒率均值為0.12%，范圍在0.00%~2.63%；心白粒率均值為4.85%，范圍在0.00%~16.94%；堊白粒率均值為8.44%，范圍在0.00%~33.55%；由圖1可以得到，堊白相關(guān)表型均呈現(xiàn)偏分布趨勢。

圖1 9311/農(nóng)香32群體表型分布（A：心白率；B：腹白率；C：背白率；D：堊白率）

2.2 遺傳圖譜的繪制

在雙親間篩選到107對多態(tài)性良好引物對用于鑒定9311/農(nóng)香32 F2群體的192個株系的基因型，利用軟件繪制其遺傳圖距為1192 cM的遺傳圖譜。結(jié)果如圖2所示。根據(jù)遺傳連鎖圖譜以及2019和2020年2 a 的9311/農(nóng)香32 F2群體表型數(shù)據(jù)分析，初步定位到16個QTL，其中與腹白粒率相關(guān)QTL 5個，與心白粒率的相關(guān)QTL 5個，與背白粒率相關(guān)QTL 1個，與堊白粒率相關(guān)QTL 5個。

圖2 9311/農(nóng)香32 F2群體遺傳連鎖圖譜及QTL在染色體上的分布

2.3 水稻堊白粒率的QTL定位與分析

由表1可知，水稻堊白粒率的QTL主要存在于第2、3、4、7、8號染色體上。在第2條染色體上同年檢測到2個QTL，將其命名為qCR2.1和qCR2.2，2個QTL的LOD值分別為4.56和3.62，解釋遺傳變異率分別為9.72%和8.75%，加性效應(yīng)分別為2.61和2.38。在第3條染色體上檢測到1個與堊白粒率相關(guān)的QTL，將其命名為qCR3，其LOD值為2.51，解釋遺傳變異率為7.74%，加性效應(yīng)為1.87。將第4條染色體上定位到的QTL命名為qCR4，其LOD值為3.09，解釋遺傳變異率為9.08%，加性效應(yīng)為-1.26。將第7條染色體上定位到的QTL命名為qCR7，其LOD值為5.38，解釋遺傳變異率為5.47%，加性效應(yīng)為-2.77。在第8條染色體上2 a均檢測到同一個QTL，將其命名為qCR8，2 a的LOD值分別為2.57和4.47，解釋遺傳變異率分別為6.57%和2.23%，加性效應(yīng)分別為-1.87和-2.22。

表1 9311/農(nóng)香32 F2和F2∶3群體初步定位到的QTL

2.4 水稻腹白的QTL定位與分析

水稻腹白粒率的QTL主要存在于第1、2、11號染色體上。在第1條染色體上檢測到一個與腹白粒率相關(guān)QTL，將其命名為qWBR1，其LOD值為3.87，解釋遺傳變異率為3.69%，加性效應(yīng)為-1.22。在第2條染色體上同年檢測到2個QTL，將其命名為qWBR2.1和qWBR2.2，2個QTL的LOD值分別為3.08和7.07，解釋遺傳變異率分別為7.21%和22.47%，加性效應(yīng)分別為1.37和2.13。在第11條染色體上2 a均檢測到同一個QTL，將其命名為qWBR8，2 a的LOD值分別為3.64和2.60，解釋遺傳變異率分別為0.31%和4.60%，加性效應(yīng)分別為-1.71和1.28。

2.5 水稻心白粒率的QTL定位與分析

水稻心白粒率的QTL主要存在于第2、3、7、8號染色體上。在第2條染色體上檢測到一個與腹白粒率相關(guān)的QTL，將其命名為qWCR2，其LOD值為2.85，解釋遺傳變異率為5.37%，加性效應(yīng)為1.16。將第3條染色體上定位到的QTL命名為qWCR3，其LOD值為3.02，解釋遺傳變異率為6.55%，加性效應(yīng)為1.52。將第7條染色體上定位到的QTL命名為qWCR7，其LOD值為5.11，解釋遺傳變異率為7.65%，加性效應(yīng)為-1.71。存在于第8條染色體的QTL 2 a內(nèi)均被檢測到，將其命名為qWCR8，其 LOD值分別為3.31和5.70，解釋粒長表型遺傳變異率分別為8.46%和2.89%，加性效應(yīng)分別為-1.65和-1.64。

2.6 水稻背白粒率的QTL定位與分析

水稻背白粒率的QTL主要存在于第1號染色體上。在第1條染色體上檢測到一個背白粒率的QTL，將其命名為qBR2，其LOD值為2.70，解釋遺傳變異率為9.31%，加性效應(yīng)為0.45。

綜合以上結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在第1號染色體上的RM128-RM297的位置同時檢測到影響腹白粒率以及背白粒率相關(guān)性狀的QTL；在第2號染色體上的B2.4-B2.8的位置同時檢測到影響心白粒率、腹白粒率以及堊白粒率相關(guān)性狀的QTL，在RM106-B2.9的位置同時檢測到影響腹白粒率和堊白粒率QTL；在第3號染色體上的B3.26-B3.29的位置同時檢測到影響心白粒率堊白粒率相關(guān)性狀的QTL；在B7.8-B7.13位置上同時檢測到影響心白粒率和堊白粒率QTL；在第8號染色體上的B8.3-RM25的位置同時檢測到影響心白粒率以及堊白粒率的QTL。

3 討論與小結(jié)

堊白是水稻籽粒外觀品質(zhì)的一個重要性狀，堊白的存在嚴(yán)重影響水稻的外觀，另外水稻籽粒中堊白還會導(dǎo)致大米的食用口感變差，加工商品率降低，從而降低稻米的經(jīng)濟(jì)價值。李成荃等[10]和劉宜柏等[11]研究中發(fā)現(xiàn)，堊白與粒形存在負(fù)相關(guān)，即：稻米的粒長越小，粒寬越大，稻米中存在的堊白越多。在研究中發(fā)現(xiàn)，存在于第3號染色體的B3.26和B3.29標(biāo)記間的qWCR3同時調(diào)控水稻籽粒的粒長以及堊白率，這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本相符。

堊白的產(chǎn)生是因?yàn)樗九呷橹信帕胁灰?guī)則淀粉顆粒以及蛋白質(zhì)中存在的縫隙，導(dǎo)致水稻籽粒存在光折射而產(chǎn)生白色不規(guī)則部分，這可能是水稻在灌漿期時，填補(bǔ)籽粒時因?yàn)楣酀{物質(zhì)不夠?qū)е伦蚜ｉg填補(bǔ)不均勻，也有可能是因?yàn)樗咎幱诠酀{期填充物質(zhì)時分配不均勻?qū)е碌摹Ｔ谠撗芯恐?，堊白的主要類型是心白和腹白，且增效位點(diǎn)均來自親本9311；兩年重復(fù)驗(yàn)證到調(diào)控堊白率的qCR8以及調(diào)控心白率的qWCR8定位在同一區(qū)間，猜測可能是一個QTL同時調(diào)控堊白率和心白率。由于目前獲得的堊白基因極少，該研究中被定位與堊白相關(guān)的QTL能為后續(xù)的研究提供重要數(shù)據(jù)支持。