陳梓云,彭夢俠

(嘉應學院 化學與環(huán)境學院,梅州 514015)

維生素B6是維生素B 片劑中重要的活性成分之一,具有促進細胞生長和分裂、調節(jié)人體新陳代謝、維持皮膚和肌肉健康、增強免疫的功能,可預防貧血,在人體的正常代謝中起著重要作用[1-2];并且維生素B6還可用于治療妊娠嘔吐、痤瘡、脂溢性皮炎[3-4]等多種疾病,因此維生素B6已成為人體補充維生素類產(chǎn)品中必不可少的物質。

市售的維生素B 產(chǎn)品分為藥物和保健品兩大類,其中藥物類維生素B 片被稱為復合維生素B片,保健品類維生素B 片被稱為B 族維生素片,均是補充維生素B6的常見產(chǎn)品,但這兩類維生素B產(chǎn)品中的維生素B6含量參差不齊。

目前測定維生素B6含量的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[5]、同步熒光法[6]、銀量法[7]、高速離子交換色譜法[8]、薄層掃描法[9]、偏最小二乘法結合同步熒光法[10]、紫外檢測器串聯(lián)熒光檢測器的高效液相色譜法[11]等。《中華人民共和國藥典》(2015 年版)中測定維生素B6含量的方法為HPLC,該方法靈敏度高,但操作復雜、耗時較長、成本高、溶劑用量大,難以完成大批量藥品、食品的監(jiān)測任務。近紅外光譜法(NIR)是一種簡便、準確、無損、無污染的快速分析檢測技術,在藥物分析領域應用廣泛[12-15]。

本工作以HPLC為參比方法,通過NIR 采集復合維生素B片和B族維生素片的近紅外光譜圖,結合偏最小二乘法(PLS)建立維生素B6的定量分析模型,利用模型可實現(xiàn)對維生素B6含量的快速預測。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 型高效液相色譜儀;AntarisⅡ型傅里葉變換近紅外光譜儀;KQ-25DB 型超聲波清洗器;SS-01型Super-Shak IR 振蕩機。

維生素B6標準儲備溶液:在避光條件下,稱取0.20 mg維生素B6標準品,用水溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成質量濃度為2.00 mg·L－1的維生素B6標準儲備溶液。

己烷磺酸鈉溶液:稱取1 g己烷磺酸鈉,用水溶解并定容至1 L容量瓶中,配制成質量濃度為1 g·L－1的己烷磺酸鈉溶液。

維生素B6標準品的純度不小于98.0%;己烷磺酸鈉的質量分數(shù)為99%;甲醇為優(yōu)級純;冰乙酸為分析純;試驗用水為超純水。

不同藥廠的13種藥物復合維生素B 片;不同廠家的10種保健品B族維生素片。

1.2 儀器工作條件

1)HPLC 條件 ShimpackVP-ODS C18烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(150 mm×4.6 mm,2μm);柱溫30 ℃;流量1.0 mL·min－1;進樣量10μL;流動相為體積比14∶6∶1的1 g·L－1的己烷磺酸鈉溶液-甲醇-冰乙酸的混合液,等度洗脫;檢測波長291 nm;測定時間14 min。

2)NIR 條件 掃描范圍4 000～10 000 cm－1;掃描次數(shù)64次;分辨率8 cm－1;優(yōu)化增益為1x;空氣為背景。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC測定樣品中維生素B6的含量

將同一類型的維生素B片研磨,稱取50 mg樣品粉末,用適量水溶解,在避光條件下超聲10 min,轉移至50 mL 容量瓶中,用水定容,按儀器工作條件進行測定。每個類型維生素B片取兩個樣本,計算測定值的平均值,以該平均值作為樣品中維生素B6的實測值。

1.3.2 樣品的近紅外光譜采集

取同一類型的維生素B片6～12片,研磨并以轉速4 000 r·min－1振蕩1 min,將樣品粉末分別裝入3個樣品杯中,采用積分球漫反射分析模塊采集其近紅外光譜圖,每個樣品采集5次,得到15張近紅外光譜圖。13 種藥物復合維生素B 片共測得195張近紅外光譜圖,10種保健品B族維生素片共測得150張近紅外光譜圖。

1.3.3 維生素B6的定量分析模型的建立

以HPLC為參比方法,以不同類型維生素B片為建模的訓練集樣品,每個樣品中,任取12張光譜圖作為訓練集樣本,余下3張光譜圖作為內(nèi)部驗證集樣本,采用TQ Analyst 9.0軟件中的PLS,用一階導數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式,各選擇3個波段(藥物復合維生素B 片4 700.46～5 125.86 cm－1,5 444.60～5 708.26 cm－1,5 754.69～6 159.52 cm－1;保健品B族維生素B片4 133.67～5 512.28 cm－1,5 944.17～ 6 495.08 cm－1,8 105.85～9 005.94 cm－1)對藥物復合維生素B 片和保健品B族維生素B 片分別進行建模,使用諾里斯導數(shù)濾噪,節(jié)段長度為5,段間間隙為5(藥物復合維生素B片)或6(保健品B族維生素B片),剔除可疑的光譜圖,再通過內(nèi)部驗證、交互驗證等方式優(yōu)化,從而建立不同類型維生素B 片中維生素B6的定量分析模型。

2 結果與討論

2.1 HPLC分析結果

在避光條件下,分別移取維生素B6標準儲備溶液0.1,0.2,0.5,0.7,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL于一組10 mL 棕色容量瓶中,用水稀釋,配制成質量濃度為0.02,0.04,0.10,0.14,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20 mg·L－1的維生素B6標準溶液系列。按照儀器工作條件進行測定,以維生素B6的質量濃度為橫坐標,其對應的色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,維生素B6的質量濃度在0.02～1.20 mg·L－1內(nèi)與其對應的峰面積呈線性關系,線性回歸方程為y＝2.144×104x＋408.5,相關系數(shù)為0.999 2。

按照試驗方法,對13種藥物復合維生素B 片和10 種保健品B 族維生素片進行測定。結果顯示,13種藥物復合維生素B片中維生素B6的質量分數(shù)為0.186 7%～0.282 7%;10種保健品B 族維生素片中維生素B6的質量分數(shù)為0.050 5%～2.044 3%。

2.2 不同樣品的近紅外光譜圖

按照試驗方法,使用積分球漫反射分析模塊采集13種藥物復合維生素B 片和10種保健品B 族維生素片的近紅外光譜圖,結果見圖1。

圖1 近紅外光譜圖Fig.1 Near infrared spectra

2.3 維生素B6 的定量分析模型

2.3.1 混合維生素B片

以10種藥物復合維生素B 片和8種保健品B族維生素片(兩者組成混合維生素B 片)為建模的訓練集樣品,共得到216個訓練集樣本和54個內(nèi)部驗證集樣本?；旌暇S生素B 片中維生素B6的定量分析模型(模型1)的最佳建模條件為:用一階導數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式;選擇4 204.26～4 958.60 cm－1,5 869.63～6 267.52 cm－1,7 709.93～8 921.09 cm－1等3個波段同時進行建模;使用諾里斯導數(shù)濾噪,節(jié)段長度為5,段間間隙為4。在此條件下,模型1的校正均值方差(RMSEC)為0.106 0,校正相關系數(shù)(Rc)為0.971 1,預測均值方差(RMSEP)為0.069 0,預測相關系數(shù)(Rp)為0.987 9,交叉驗證均值方差(RMSECV)為0.167 0,交叉驗證相關系數(shù)(Rcv)為0.927 6,性能指數(shù)為87.4。模型1中混合維生素B片樣本預測值與實測值的關系見圖2。

圖2 混合維生素B片樣本中維生素B6 的預測值與實測值(模型1)Fig.2 Predicted and measured values of vitamin B6 in mixed vitamin B tablet samples(model 1)

2.3.2 藥物復合維生素B片

以不同藥廠的10種藥物復合維生素B 片為建模的訓練集樣品,共得到120個訓練集樣本和30個內(nèi)部驗證集樣本。藥物復合維生素B 片中維生素B6的定量分析模型(模型2)的最佳建模條件為:用一階導數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式;選擇4 700.46～5 125.86 cm－1,5 444.60～5 708.26 cm－1,5 754.69～6 159.52 cm－1等3 個波段同時進行建模;使用諾里斯導數(shù)濾噪,節(jié)段長度為5,段間間隙為5。在此條件下,模型2的RMSEC為0.003 0,Rc為0.994 7,RMSEP 為0.002 9,Rp為0.995 4,RMSECV為0.005 2,Rcv為0.994 1,性能指數(shù)為92.8。模型2中藥物復合維生素B 片樣本的預測值與實測值的關系見圖3。

圖3 藥物復合維生素B片樣本中維生素B6 的預測值與實測值(模型2)Fig.3 Predicted and measured values of vitamin B6 in compound vitamin B tablet samples for drug(model 2)

2.3.3 保健品B族維生素片

以不同廠家的8種保健品B 族維生素片為建模的訓練集樣品,共得到96個訓練集樣本和24個內(nèi)部驗證集樣本。保健品B 族維生素片中B6的定量分析模型(模型3)的最佳建模條件為:用一階導數(shù)光譜數(shù)據(jù)形式;選擇4 133.67～5 512.28 cm－1,5 944.17～6 495.08 cm－1,8 105.85～9 005.94 cm－1

等3個波段同時進行建模;使用諾里斯導數(shù)濾噪,節(jié)段長度為5,段間間隙為6。在此條件下,模型3的RMSEC 為0.031 4,Rc為0.998 7,RMSEP 為0.035 8,Rp為0.998 7,RMSECV 為0.038 8,Rcv為0.998 1,性能指數(shù)為93.5。模型3中保健品B族維生素片樣本的預測值與實測值的關系見圖4。

圖4 保健品B族維生素片樣本中維生素B6 的預測值與實測值(模型3)Fig.4 Predicted and measured values of vitamin B6 in vitamin B complex tablet samples for health products(model 3)

通過比較模型1～3 的相關模型參數(shù),可以發(fā)現(xiàn),模型1的RMSEC、RMSEP、RMSECV 均偏大,而Rc、Rp、Rcv及性能指數(shù)均偏小。這可能是由于復合維生素B片為復方制劑,主要含有維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣等成分,輔料為淀粉、糊精、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂等,不同藥廠生產(chǎn)的藥物復合維生素B片的組成成分基本一致;而保健品B族維生素片的主要成分除了含有維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酰胺、泛酸鈣外,通常還含有甲鈷胺、葉酸、微晶纖維素,輔料為淀粉、糊精、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、香精、礦物質等,不同廠家生產(chǎn)的保健品B族維生素片組成成分各有不同。由于不同類型維生素B片的成分存在較大差異,采用混合維生素B片進行建模時,兩者會互相干擾,導致模型預測的準確性較差,因此采用單一類型的維生素B片進行建模,可更準確地分析其中維生素B6的含量。

3 模型的外部驗證

對模型2和模型3進行外部驗證,進一步確定所建模型的準確性。以未參與建模的3種藥物復合維生素B 片為外部驗證集,對模型2 進行外部驗證,得到維生素B6含量的預測值;以未參與建模的2種保健品B 族維生素片為外部驗證集,對模型3進行外部驗證,得到維生素B6含量的預測值。具體結果見表1。

表1 外部驗證結果Tab.1 External validation results

結果顯示:模型2對藥物復合維生素B片中維生素B6的預測值與實測值的絕對誤差為－0.004 4%～0.008 0%,相對誤 差為－1.7%～3.3%;模型3對保健品B 族維生素片中維生素B6的預測值與實測值的絕對誤差為－0.007 1%～0.049 7%,相對誤差為－1.9%～5.0%,表明單一類型維生素B片的模型對維生素B6含量的預測準確度較高,可用于藥物復合維生素B片和保健品B族維生素片中維生素B6含量的快速分析。

本工作以HPLC 為參比方法,采用NIR 結合PLS,分別建立了藥物復合維生素B 片和保健品B族維生素片中維生素B6的定量分析模型。在實際應用中,首先采集待測樣品的近紅外光譜圖,然后根據(jù)維生素B 片產(chǎn)品的類型分別導入相應的模型進行分析。該方法無需使用大量的溶劑和對照品,并且不需要對樣品進行復雜的前處理,操作簡單、環(huán)保高效、準確度高,可快速預測不同類型維生素B 片中維生素B6的含量。