郭子泰，高勝濤，馬 露，卜登攀,2*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院與世界農(nóng)用林業(yè)中心農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

熱應(yīng)激是高溫環(huán)境下動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。熱應(yīng)激會(huì)影響奶牛的生產(chǎn)性能，導(dǎo)致乳蛋白及產(chǎn)奶量下降，影響奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。通常使用THI來(lái)反映熱應(yīng)激的影響程度，目前認(rèn)為奶牛在THI超過(guò)72為離開(kāi)熱中性區(qū)，即開(kāi)始出現(xiàn)熱應(yīng)激。物理降溫可有效緩解熱應(yīng)激。較單獨(dú)使用通風(fēng)，通風(fēng)結(jié)合噴淋后奶牛的呼吸頻率、直腸溫度顯著下降。但噴淋用水加劇了牛場(chǎng)環(huán)境及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，調(diào)研表明夏季噴淋用水量約占總用水量的1/5。因此，使用更為經(jīng)濟(jì)有效的物理降溫措施對(duì)提升夏季奶牛生產(chǎn)性能有非常重要的意義。

Chen等研究發(fā)現(xiàn)縮短噴淋間隔或增加噴淋時(shí)間都能使奶牛的呼吸頻率及體溫降低，但不同噴淋降溫策略對(duì)奶牛具體生產(chǎn)性能的提升情況未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在分析2種噴淋頻率下奶牛生產(chǎn)性能的變化，并通過(guò)對(duì)比2種降溫策略下奶牛的瘤胃發(fā)酵、抗氧化及腸屏障功能等受指標(biāo)來(lái)研究不同噴淋策略對(duì)奶牛熱應(yīng)激的緩解效果，為進(jìn)一步優(yōu)化夏季牛舍物理降溫策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)開(kāi)展于2019年7月，選取20頭泌乳日齡（175±25）d，產(chǎn)奶量為（27.5±2.5）kg/d的經(jīng)產(chǎn)健康荷斯坦奶牛，飼養(yǎng)于一處半開(kāi)放牛舍內(nèi)（長(zhǎng)50 m、寬10 m）。采用強(qiáng)制通風(fēng)搭配噴淋的方式對(duì)奶牛進(jìn)行物理降溫，舍內(nèi)吊掛6臺(tái)風(fēng)機(jī)（轉(zhuǎn)速為550 r/min），具體安放位置為：臥床上方2臺(tái)，間隔20 m；采食槽上方4臺(tái)，間隔10 m。于采食槽上方2.5 m處每間隔2 m安裝灑水噴頭（流速為1.5 L/min），共20個(gè)，分別于采食區(qū)域及臥床區(qū)域懸掛溫濕度計(jì)用于記錄每日環(huán)境溫度及濕度。試驗(yàn)期35 d，包括7 d預(yù)試期和28 d正試期。試驗(yàn)期內(nèi)強(qiáng)制通風(fēng)不間斷進(jìn)行，噴淋為每日3 h，時(shí)間為11:30—13:30及15:00—16:00。噴淋策略為：正試期1～14 d采用3|6的方式，即每間隔6 min噴淋3 min；15～28 d采用1.5|3的方式，即每隔3 min噴淋1.5 min。

試驗(yàn)期間所有試驗(yàn)動(dòng)物自由飲水，每日早中晚飼喂3次（07:00、14:00和19:00）并擠奶3次（06:00、14:00和22:00）。飼料配制依照NRC（2001）奶牛營(yíng)養(yǎng)需要量的推薦值，精粗比為50:50，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平參見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集 正試期每天07:00、14:00和19:00記錄環(huán)境溫度（AT）和相對(duì)濕度（RH），THI計(jì)算參考Amundson等研 究，THI=0.8×AT+RH/ 100×（AT-14.4）+46.4。每日3次（07:00、14:00和19:00）記錄每頭牛的直腸溫度、呼吸頻率及皮膚溫度，其中直腸溫度使用獸用溫度計(jì)測(cè)得，皮膚溫度使用紅外線(xiàn)測(cè)溫儀檢測(cè)奶牛肩部溫度，呼吸頻率通過(guò)觀察1 min內(nèi)奶牛胸廓隆起次數(shù)計(jì)算所得；每日通過(guò)采食控制系統(tǒng)（UG8192，荷蘭InsenTec）記錄每頭牛采食量。

在正試期第7、14、21、28天收集尿液、糞便、牛奶、血液、瘤胃液和TMR日糧樣品。每個(gè)采樣日收集TMR日糧3次（07:00、14:00和19:00），將3份樣品混合均勻后于-20℃存放。每個(gè)采樣日收集糞便和尿液4次（02:00、08:00、14:00和20:00），具體操作為每個(gè)采樣點(diǎn)直接從奶牛直腸內(nèi)收集糞便，同時(shí)通過(guò)按摩收集尿液，收集后將4次采集的糞便及尿液分別混合均勻后重新取樣，-20℃保存，其中糞便分為2份，其中1份加入20 mL的6 mol/L HCl用于粗蛋白檢測(cè)。每個(gè)采樣日隨擠奶收集奶樣3次，之后以4:3:3的比例分別混合均勻后加入重鉻酸鉀防腐劑（0.6 mg/mL）于4℃保存。于每個(gè)采樣日晨飼前采集尾動(dòng)/靜脈血10 mL，靜置0.5 h后4℃，3 000 ×g離心15min后收集血清，同時(shí)使用除熱源添加肝素鈉采血管（廈門(mén)鱟試劑生物技術(shù)有限公司）采集尾動(dòng)/靜脈血10 mL，使用相同配置離心后收集血漿，用于LPS的檢測(cè)，血清及血漿樣品皆存放于-20℃。于每個(gè)采樣日晨飼前使用胃管式瘤胃液采樣器采集瘤胃液，采集后立刻使用電子pH計(jì)（pH-100A,上海力辰邦西儀器科技有限公司）檢測(cè)pH，之后經(jīng)4層紗布過(guò)濾收集，取其中10 mL瘤胃液用6mol/L HCl酸化用于測(cè)定氨態(tài)氮（NH-N），另分裝10 mL用于揮發(fā)性脂肪酸（VFA）及菌體蛋白（MCP）的測(cè)定，-20℃保存。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法 日糧樣品采集后置于強(qiáng)制對(duì)流烘箱UFE400（德國(guó)MEMMERT），65℃烘干48 h測(cè)定初水分，參照《飼料水分的測(cè)定方法》（GB/T 6435-2014）進(jìn)行測(cè)定，烘后樣品粉碎過(guò)40目篩，于-20℃保存，用于剩余飼料常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗灰分的測(cè)定》（GB/T 6438-2007）使用箱式電阻爐（SRJX-8-13，天津市泰斯特儀器有限公司）分析粗灰分。粗脂肪參照《飼料中粗脂肪的測(cè)定》（GB/T 6433-2006）使用脂肪分析儀（SoxtecTM AVANTI 2043,丹麥FOSS）進(jìn)行測(cè)定 。粗蛋白質(zhì)參照《飼料中粗脂肪的測(cè)定》（GB/T 6432-1994）使用全自動(dòng)凱氏定氮儀（FOSS KJELTEC 2300，丹麥FOSS）進(jìn)行測(cè)定。中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量測(cè)定參照Van Soest等的方法，稱(chēng)取樣品封裝于纖維測(cè)定專(zhuān)用濾袋（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供），使用全自動(dòng)纖維分析儀（A2000i，美國(guó)ANKOM）洗滌，洗滌過(guò)程中滴加2 滴淀粉酶。表觀消化率的計(jì)算使用TMR及糞便中的不可消化中性洗滌纖維（iNDF）作為標(biāo)記物，參考Lee等的研究，即養(yǎng)分的表觀消化率=[1-（A×F）/（A×F）]×100%，其中A和A分別是飼料與糞便樣品中iNDF含量；F和F是樣品中的養(yǎng)分含量。

尿液中的尿酸及肌酐使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定,，尿液中的尿囊素含量根據(jù)Borchers等的方法進(jìn)行測(cè)定。菌體蛋白產(chǎn)量依據(jù)Chen等的方法：

使用紅外分光光度法（全自動(dòng)乳成分分析儀MilkoScan Type 78110，丹麥FOSS）分析乳成分；血清中過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性,丙二醛（MDA）、內(nèi)皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）和-乳酸含量的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒；血漿中LPS濃度測(cè)定采用廈門(mén)鱟試劑生物技術(shù)有限公司試劑盒，具體操作方法如Mao等所述。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用SAS 9.4中MIXED模型進(jìn)行方差分析，最小二乘均數(shù)法做平均值比較。每日THI、周平均THI以及試驗(yàn)牛群平均DIM用作協(xié)變量，模型將處理作為固定效應(yīng)，試驗(yàn)牛為隨機(jī)效應(yīng)，每日測(cè)得指標(biāo)或每周收集指標(biāo)作為重復(fù)測(cè)量或是協(xié)變量。＜0.01為差異極顯著，＜0.05為差異顯著，0.05≤＜0.10為存在趨勢(shì)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境THI及奶牛直腸溫度、呼吸頻率 由表2可知，牛舍內(nèi)THI在1.5|3和3|6噴淋頻率之間沒(méi)有差異，與3|6相比，奶牛處于1.5|3時(shí)早中晚3次測(cè)得的呼吸頻率、直腸溫度及皮膚溫度均降低（＜0.01）。由表3可得，正試期內(nèi)每日3次測(cè)量THI皆高于72。

表2 不同噴淋頻率下奶牛直腸溫度、皮膚溫度和呼吸頻率以及環(huán)境THI

表3 不同噴淋頻率下每日舍內(nèi)早上、下午及晚上環(huán)境THI

2.2 不同噴淋頻率對(duì)DMI、乳品質(zhì)和奶產(chǎn)量的影響 由表4可知，1.5|3噴淋時(shí)奶牛DMI高于3|6噴淋（＜0.01），奶牛日均產(chǎn)奶量、乳蛋白、乳糖含量差異不顯著。與處于3|6噴淋頻率下相比，奶牛在接受1.5|3噴淋時(shí)夜間產(chǎn)奶量、乳脂肪提高（＜0.05），體細(xì)胞數(shù)有降低的趨勢(shì)（0.05≤＜0.10）。

表4 不同噴淋頻率下奶牛的產(chǎn)奶性能

2.3 不同噴淋頻率對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵及表觀消化率的影響由表5可知，相對(duì)于處在3|6噴淋頻率下，奶牛接受1.5|3噴淋時(shí)瘤胃液LPS含量極顯著增加（＜0.01）?？倱]發(fā)性脂肪酸、乙酸、丁酸、戊酸含量降低（＜0.05），丙酸含量降低（＜0.01）。pH、氨態(tài)氮、菌體蛋白、異丁酸、異戊酸含量以及異丙比差異不顯著。由表6可知，在兩種噴淋頻率下奶牛的NDF、ADF、粗蛋白及有機(jī)質(zhì)的表觀消化率差異不顯著。

表5 不同噴淋下奶牛的瘤胃發(fā)酵情況

表6 不同噴淋頻率對(duì)奶牛表觀消化率情況

2.4 不同噴淋頻率對(duì)奶?？寡趸阅芗澳c屏障指標(biāo)的影響 由表7可知，與3|6的噴淋頻率相比，處于1.5|3噴淋下的奶牛血液中CAT、SOD的酶活性極顯著增加（＜0.01），LPS含量（＜0.01）及NO含量（＜0.05）降低，-乳酸含量有降低趨勢(shì)（0.05≤＜0.10），GSH-Px的酶活性、MDA、ET-1含量差異不顯著。

表7 不同噴淋頻率下奶牛血液腸道屏障及抗氧化相關(guān)指標(biāo)情況

3 討 論

奶牛進(jìn)入熱應(yīng)激時(shí)生產(chǎn)性能出現(xiàn)明顯下降，且表現(xiàn)出呼吸急促，體溫過(guò)高等癥狀。高產(chǎn)奶牛在環(huán)境THI超過(guò)68后每日產(chǎn)奶量下降2.2 kg。本研究中，試驗(yàn)期內(nèi)環(huán)境日均THI及每日早中晚3次計(jì)算值均超過(guò)72，表明試驗(yàn)?zāi)膛Ｌ幱跓釕?yīng)激狀態(tài)；舍內(nèi)環(huán)境溫濕度未受物理降溫措施的影響，這與Berman等的研究結(jié)果相符，說(shuō)明強(qiáng)制通風(fēng)結(jié)合噴淋降溫是通過(guò)改善熱舒適性發(fā)揮作用而不是直接降低環(huán)境溫度。

噴淋降溫能否緩解奶牛因熱應(yīng)激帶來(lái)的產(chǎn)奶量降低在先前的研究報(bào)道中存在分歧。Domingos等在擠奶前噴淋1次、5次以及9次，結(jié)果表明9次噴淋組的夜間產(chǎn)奶量相較對(duì)照組（不進(jìn)行噴淋）顯著提升，而早晨擠奶的產(chǎn)奶量沒(méi)有差異。本研究中，在噴淋間隔更短時(shí)（1.5|3）奶牛夜間產(chǎn)奶量存在顯著增加，與Domingos等的結(jié)果一致。由于早晨及下午產(chǎn)奶量差異不顯著，不同噴淋頻率對(duì)日均產(chǎn)奶量的提升效果沒(méi)有顯著影響，這與Brouk等的結(jié)論相符。熱應(yīng)激可改變奶牛的采食行為，Eslamizad等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激下奶牛采食飼料頻率增加，但每頓持續(xù)時(shí)間及采食量均下降，故熱應(yīng)激下奶?？赡芨淖儾墒巢呗砸詼p少自身產(chǎn)熱。本試驗(yàn)中，1.5|3噴淋策略下奶牛的DMI顯著提升，兩階段奶牛產(chǎn)奶量差異不顯著，表明提升的DMI未用于乳蛋白合成。Bu等研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激下奶牛肝臟和乳腺組織對(duì)乳蛋白前體物分配利用存在協(xié)同機(jī)制，故施加物理降溫時(shí)，環(huán)境溫濕度未改變，奶牛仍處于熱中性區(qū)外，提升的DMI吸收后養(yǎng)分更多為其他組織利用，而未被乳腺上皮細(xì)胞攝入?yún)⑴c泌乳過(guò)程。綜合考慮，以較短噴淋間隔降溫時(shí)奶牛夜間產(chǎn)奶量有顯著提升，但不同噴淋間隔可能并未影響熱應(yīng)激直接對(duì)奶牛體內(nèi)養(yǎng)分的代謝的改變，而僅是協(xié)助熱增耗的散失，其帶來(lái)的DMI的恢復(fù)可能更多為乳腺外其他器官所利用。

熱應(yīng)激導(dǎo)致乳品質(zhì)下降，其通過(guò)引起DMI下降以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重分配使乳蛋白合成下降，然而目前相關(guān)研究尚未報(bào)道經(jīng)過(guò)降溫緩解后熱應(yīng)激奶牛乳成分的變化。本研究中，熱應(yīng)激奶牛在2種噴淋頻率下的乳蛋白含量無(wú)顯著差異，表明在處于1.5|3噴淋頻率時(shí)奶牛提升的DMI部分并未用于乳蛋白合成，與之前的討論結(jié)果相符，很可能與熱應(yīng)激下奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重分配相關(guān)。此外，1.5|3噴淋策略下奶牛乳脂率較3|6時(shí)顯著降低，泌乳過(guò)程中脂肪酸通過(guò)從頭合成或直接從血液中攝取的方式獲得，其中前者受到前體物-羥基丁酸的供應(yīng)的限制，而-羥基丁酸在奶牛體內(nèi)通過(guò)瘤胃上皮吸收的丁酸及乙酸合成得到，這表明乳脂含量應(yīng)與瘤胃吸收的乙酸及丁酸的量有關(guān)。因此，在使用較短噴淋間隔（1.5|3）降溫時(shí)乳脂率的降低可能與奶牛此時(shí)的瘤胃液乙酸、丁酸濃度下降相關(guān)聯(lián)。

奶牛處于熱應(yīng)激時(shí)其瘤胃液總VFA、各組分含量以及乙丙比增加。此外還表現(xiàn)出表觀消化率提升，這與奶牛處于熱應(yīng)激時(shí)DMI下降有關(guān)。熱應(yīng)激還會(huì)破壞腸道屏障完整性，Hall等研究表明熱應(yīng)激下豬和小鼠腸屏障受損，表現(xiàn)為腸道內(nèi)微生物代謝產(chǎn)物L(fēng)PS及-乳酸在血液中濃度增加。而組織中LPS增加可誘導(dǎo)iNOS的表達(dá)，從而引起血液中NO的異常增加。故可通過(guò)奶牛表觀消化率、瘤胃發(fā)酵情況以及血液中反映腸屏障功能的相關(guān)指標(biāo)推斷奶牛所受熱應(yīng)激嚴(yán)重程度。本研究發(fā)發(fā)現(xiàn)1.5|3噴淋頻率下奶牛表現(xiàn)較低的養(yǎng)分表觀消化率及瘤胃液中VFA含量下降，且血液中LPS、NO及-乳酸含量下降，提示此降溫策略下奶牛熱應(yīng)激癥狀較3|6噴淋時(shí)減輕。但1.5|3噴淋時(shí)奶牛瘤胃液中LPS濃度極顯著提升，說(shuō)明不同噴淋降溫可能并未對(duì)奶牛瘤胃異常代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)生影響。

熱應(yīng)激可通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體活性氧過(guò)度產(chǎn)生導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激?；钚匝酰≧eactive Oxygen Species，ROS）作為呼吸代謝產(chǎn)物在機(jī)體調(diào)節(jié)中具有兩面性，ROS參與協(xié)助機(jī)體免疫，個(gè)別類(lèi)型如過(guò)氧化氫（HO）可作為第二信使參與信息交換，而高濃度的ROS引起代謝功能障礙甚至可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。動(dòng)物體內(nèi)存在酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)以防止氧化損傷，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生ROS速度過(guò)快，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)失衡時(shí)，即產(chǎn)生氧化應(yīng)激。機(jī)體氧化應(yīng)激下過(guò)量的ROS造成細(xì)胞線(xiàn)粒體DNA（mtDNA）的氧化損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，影響奶牛健康，而乳腺細(xì)胞的凋亡直接影響奶牛泌乳。通常使用測(cè)定活性氧消除酶、抗氧化物及相關(guān)過(guò)氧化產(chǎn)物含量可定量評(píng)價(jià)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，借以推斷奶牛遭受熱應(yīng)激損害程度?；钚匝跸赴℅SH-Px、SOD和CAT等，其中SOD可催化超氧化物自由基歧化為分子氧及HO、CAT和GSH-Px可將組織中過(guò)量的HO分解為水，此外GSH-Px還可將脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的醇類(lèi)化合物。而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物，其在血液中的含量可間接反映組織細(xì)胞的損傷。本研究中，處于3|6噴淋頻率下的奶牛血液中CAT和SOD酶活性均低于處于1.5|3噴淋頻率時(shí)，表明使用較長(zhǎng)噴淋間隔時(shí)奶牛組織氧化應(yīng)激更嚴(yán)重，提示奶?？赡茉馐芨嗟臒釕?yīng)激損傷。2種噴淋策略下血液中MDA含量及GSH-Px酶活性表明奶牛的脂質(zhì)氧化水平相近。

綜合得出，在同等溫?zé)岘h(huán)境下，采用較短間隔的噴淋策略更大程度降低奶牛呼吸頻率及直腸、皮膚溫度，且通過(guò)瘤胃發(fā)酵，表觀消化、腸道屏障及組織氧化應(yīng)激水平等多方面驗(yàn)證，此噴淋間隔下奶牛熱應(yīng)激癥狀表現(xiàn)更輕微，而在DMI增加后熱應(yīng)激奶牛日均產(chǎn)奶量以及乳蛋白含量沒(méi)有變化，僅有夜間產(chǎn)奶量出現(xiàn)差異，提示物理噴淋產(chǎn)生的降溫可能主要通過(guò)協(xié)助散發(fā)代謝熱發(fā)揮效果，沒(méi)有改善熱應(yīng)激直接造成的養(yǎng)分代謝變化的能力。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噴淋降溫可能僅存在減少奶牛代謝熱的效果，而不能直接改善熱應(yīng)激奶牛體內(nèi)養(yǎng)分的代謝進(jìn)而促進(jìn)生產(chǎn)性能的提升。在相同噴淋時(shí)間及用水量下，使用較短噴淋間隔進(jìn)行物理降溫對(duì)熱應(yīng)激緩解更有效。