陰文奇，張傳明，何平元，王子建，周遠成，李盛辟

（1.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066；2.畜科生物工程有限公司，四川 成都 610299；3.畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都 610299）

豬偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病毒（PRV）所引起的多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。豬是該病的天然宿主和主要儲存宿主，各個年齡段的豬群均可感染［1-3］。該病在世界上分布廣泛，并有不斷蔓延擴大的趨勢。疫苗免疫是防控豬偽狂犬病最經濟、有效的方法。目前市場上流通的偽狂犬病疫苗有滅活疫苗和活疫苗。隨著PRV 的基因變異，以Batha-K61 株為首的疫苗毒株對我國豬偽狂犬病的預防能力降低。郭萬柱等［4］根據我國豬偽狂犬病疫情的流行情況，以野毒Fa 株為親本毒株構建了三基因（TK、gE、gI）缺失疫苗SA215 株，該疫苗株具有良好的穩(wěn)定性和安全性［5-6］。該活疫苗的有效期為2～8 ℃保存12 個月。為研究保存期延長對疫苗的影響，本試驗將保存期延長至21 個月后按照質量標準進行檢測，為臨床使用和后續(xù)產品開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料 6 批豬偽狂犬病活疫苗樣 品（批 號：試201906021、試201906022、試201906023、試 201906024、試 201906025、試201906026）由畜科生物工程有限公司生產，每批取樣150 瓶置-15 ℃保存，取150 瓶置2～8 ℃保存。Vero細胞，由畜禽生物制品四川省重點實驗室鑒定、保管和供應。DMEM 購自Gibco 公司。新生牛血清購自內蒙古金源康生物工程有限公司。21～28 日齡斷奶健康易感仔豬購自成都周邊散養(yǎng)戶。

1.2 不同保存期疫苗病毒含量的測定 在保存試驗前以及-15 ℃和2～8 ℃保存6、12、18、21 個月時分別取保存樣品用維持液將疫苗成品稀釋至1 頭份/mL，再作10 倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個稀釋度，每個稀釋度分別接種6孔板內培養(yǎng)形成的致密Vero 細胞單層1 孔，每孔0.1 mL，37 ℃吸附1 h。再于每孔加入DMEM 液（含甲基纖維素0.5%）2～3 mL，置二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3～4 日，吸去上清液，用1%結晶紫、福爾馬林染液染色20 min，棄染色液，計算蝕斑數，應≥105.0PFU/頭份。

1.3 常規(guī)檢測指標的測定 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 個月的疫苗，按照《中國獸藥典》（2015年版）附錄19進行無菌檢驗、附錄22進行支原體檢驗、附錄16 第2 法進行外源病毒檢驗、附錄11 進行剩余水分測定、附錄7 進行真空度檢驗。

1.4 鑒別檢驗 將疫苗稀釋成104.0PFU/mL，與PRV特異性血清（中和指數為700～1 000）等量混合，37 ℃中和1 h，同時設病毒對照，分別接種Vero細胞單層。置二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)3～5日，觀察細胞病變（CPE）。病毒對照組應出現細胞圓縮、融合形成空斑等細胞病變，中和組不能出現CPE。

1.5 安全性檢驗 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21個月的疫苗，給2頭20～22日齡健康易感仔豬（PRV 中和抗體效價≤1∶4）各肌肉注射2頭份，觀察7日并記錄。

1.6 效力檢驗 分別取-15 ℃和2～8 ℃保存12、18、21 個月的疫苗，給4 頭20～22 日齡健康易感仔豬（PRV 中和抗體效價≤1∶4）各肌肉注射1 頭份。28 日后，連同條件相同的4 頭對照豬，分別采血，分離血清，測定血清中和抗體滴度。

2 結果

2.1 6 批豬偽狂犬病活疫苗（SA215 株）不同保存期的病毒含量檢測結果 將6 批成品苗在-15 ℃下保存6、12、18、21 個月后分別檢測各批樣品的病毒含量，結果顯示：18 個月時病毒含量下降幅度在0.5～0.7 個滴度之間，21 個月時下降幅度在0.6～0.8 個滴度之間，但所有批次的病毒含量均遠高于105.0PFU/頭份的國家標準。詳見表1。

表1 6批成品苗在-15 ℃條件下放置不同時間后的病毒含量檢測

將6 批成品苗在2～8 ℃下保存6、12、18、21個月后分別檢測各批樣品的病毒含量，結果顯示：18 個月時病毒含量下降幅度在0.5～0.8 個滴度之間，21 個月時下降幅度在0.6～0.9 個滴度之間，但所有批次的病毒含量均遠高于105.0PFU/頭份的國家標準。詳見表2。

2.2 6 批成品苗在-15 ℃及2～8 ℃保存12 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存12 個月，然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示所有指標均符合質量標準要求。詳見表3和表4。

表3 6批成品苗于-15 ℃保存12個月時的檢測結果

表4 6批成品苗于2～8 ℃保存12個月時的檢測結果

2.3 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存18 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存18 個月，然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示：病毒含量均在105.7PFU/頭份以上，免疫抗體均在1∶30 以上，所有指標均符合質量標準。詳見表5和表6。

表5 6批成品苗于-15 ℃保存18個月時的檢測結果

表6 6批成品苗于2～8 ℃保存18個月時的檢測結果

2.4 6 批成品苗于-15 ℃及2～8 ℃保存21 個月時的檢測結果 將6 批成品苗分別置-15 ℃和2～8 ℃保存21 個月，然后進行性狀觀測、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗以及安全、效力、真空度和剩余水分的測定。結果顯示：病毒含量均在105.6PFU/頭份以上，免疫抗體均在1∶30 以上，所有指標均符合質量標準。詳見表7和表8。

表7 6批成品苗于-15 ℃保存21個月時的檢測結果

表8 6批成品苗于2～8 ℃保存21個月時的檢測結果

3 結論

臨床上使用的動物活疫苗均以凍干形式生產、保存，近年來隨著真空冷凍干燥技術的發(fā)展出現了耐熱保護劑活疫苗。常規(guī)疫苗通常在-15 ℃保存，而耐熱保護劑活疫苗則在2～8 ℃保存。本試驗使用的疫苗在取得新獸藥證書時確定的質量標準為2～8 ℃保存12 個月，為研究該疫苗在不同溫度條件下保存的穩(wěn)定性和有效期，本試驗以12 個月有效期為基礎，分別選擇三個批次的疫苗在-15 ℃和2～8 ℃保存，將保存期延長至21個月，并在保存后不同時間段取樣進行疫苗質量測定。試驗得出：6 批豬偽狂犬病活疫苗（SA215株）試制產品在-15 ℃和2～8 ℃下保存21 個月，病毒含量只有輕微下降（0.6～0.8 和0.6～0.9），每頭份病毒含量均在105.6PFU以上，遠高于國家質量標準（105.0PFU/頭份）；免疫抗體水平均高于1∶30；性狀、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、鑒別檢驗、安全性、效力、剩余水分、真空度等指標均符合質量標準，表明該疫苗在-15 ℃及2～8 ℃兩種溫度條件下保存21 個月仍然合格。本試驗結果為疫苗的臨床推廣以及后續(xù)新產品的開發(fā)提供了新的依據?！?/p>