邵 靚，李 春，梁璐琪，周莉媛，何慶雄，周哲學(xué)*

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省綿陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽(yáng) 621000）

非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病是我國(guó)當(dāng)前規(guī)模化豬場(chǎng)危害較為嚴(yán)重的疫病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2018 年8月我國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市確診第一起非洲豬瘟疫情，并于短時(shí)間內(nèi)蔓延至全國(guó)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性的打擊，該病目前尚無有效的治療方法和疫苗。2019年以來，非洲豬瘟病毒出現(xiàn)了多種變異株，與2018 年傳入的非洲豬瘟毒株相比，變異株的基因組序列、臨床癥狀、致病力等均發(fā)生了明顯變化，進(jìn)一步增加了防控難度?？谔阋呤俏：κ澜绺鲊?guó)養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的疫病之一，傳播速度快、傳播途徑廣，仔豬死亡率極高，疫區(qū)發(fā)病率可達(dá)100%［1］。豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病不僅引起種豬繁殖障礙，還會(huì)導(dǎo)致豬體免疫抑制，加重其他疫病的繼發(fā)感染，干擾疫苗免疫效果。為貫徹落實(shí)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020 年）》，近年來，四川省積極探索規(guī)模種豬場(chǎng)主要疫病的凈化工作，為摸清規(guī)模種豬場(chǎng)主要疫病種類和感染情況，掌握疫病流行特點(diǎn)和趨勢(shì)，評(píng)估凈化效果，本研究于2021 年上半年對(duì)成都、綿陽(yáng)、達(dá)州、眉山、遂寧5 個(gè)市的8 個(gè)規(guī)模種豬場(chǎng)進(jìn)行了非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病5種主要疫病的病原學(xué)檢測(cè)。

1 材料

1.1 主要儀器設(shè)備 組織勻漿儀購(gòu)自美國(guó)MP公司；核酸自動(dòng)提取儀購(gòu)自天隆生物科技有限公司；CFX96 熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

1.2 檢測(cè)試劑 磁珠法核酸提取試劑盒購(gòu)自天隆生物科技有限公司；非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司；口蹄疫病毒（A/O/Asia I）熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒，豬偽狂犬病毒（gE基因）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株與美洲株雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株與高致病性變異株雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征（類NADC-30 毒株）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自北京世紀(jì)元亨公司。

1.3 樣品 在成都、綿陽(yáng)、達(dá)州、眉山、遂寧等規(guī)模化程度高及整體生物安全水平好的地區(qū)，針對(duì)已開展動(dòng)物疫病凈化的規(guī)模種豬場(chǎng)進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。每個(gè)地區(qū)至少選擇1 個(gè)種豬場(chǎng)，共選擇了8個(gè)種豬場(chǎng)（綿陽(yáng)3個(gè)，達(dá)州2個(gè)，成都、眉山、遂寧各1 個(gè)），分別采集場(chǎng)內(nèi)發(fā)病死亡豬的肺、肝、脾、腎以及其他發(fā)生明顯病變的組織，每份組織大小不超過5 cm×5 cm×5 cm，單獨(dú)用小自封袋包裝并注明編號(hào)和組織名稱。同一頭豬的組織放在一個(gè)大自封袋內(nèi)，-20 ℃保存?zhèn)溆?。一頭豬的組織作為1頭份，共采集組織樣品294頭份。

2 方法

2.1 樣品前處理 將1 頭份樣品的每種類型組織用無菌剪刀分別剪取約0.05 g，混合后放入裂解管，加入1 mL滅菌PBS（pH 7.2）和陶瓷珠，使用組織勻漿儀勻漿1 min，取出后以8 000 r/min 離心2 min，取上清200 μL進(jìn)行總核酸提取。

2.2 核酸提取 使用磁珠法核酸提取試劑盒和核酸自動(dòng)提取儀進(jìn)行總核酸提取。提取程序按照說明書導(dǎo)入。提取完成后，總核酸置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 5種病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR/PCR檢測(cè) 使用各病毒對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR/PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)，操作步驟按照各試劑盒說明書進(jìn)行。豬藍(lán)耳病首次檢測(cè)采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒；分型檢測(cè)依次采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲株與美洲株雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經(jīng)典株與高致病性變異株雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征（類NADC-30 毒株）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。

2.4 結(jié)果判定 根據(jù)各試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定。陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤陽(yáng)性臨界值并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無Ct 值且無特定擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。樣品Ct值≤陽(yáng)性臨界值并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為陽(yáng)性；陽(yáng)性臨界值＜樣品Ct值＜陰性臨界值并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為可疑，需重新取樣提取總核酸，再次擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如結(jié)果為陽(yáng)性或仍是可疑，則判為陽(yáng)性；樣品Ct值≥陰性臨界值或未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線時(shí)，判為陰性。

3 結(jié)果

3.1 5種病毒的病原檢測(cè)結(jié)果 所有檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照均成立。

從表1 可知，294 頭份樣品中，非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病病原檢測(cè)結(jié)果均為陰性，豬藍(lán)耳病檢出14 頭份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為4.76%（14/294）。豬藍(lán)耳病陽(yáng)性組織樣品分布于3個(gè)種豬場(chǎng)（眉山1 個(gè)、綿陽(yáng)2 個(gè)），3 個(gè)場(chǎng)豬藍(lán)耳病陽(yáng)性率分別為12.5%、10%、19.35%。

表1 規(guī)模種豬場(chǎng)5種主要疫病的病原檢測(cè)結(jié)果

3.2 豬藍(lán)耳病分型檢測(cè)結(jié)果 將14頭份豬藍(lán)耳病陽(yáng)性組織樣品采用熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行進(jìn)一步分型鑒定，結(jié)果顯示：綿陽(yáng)2個(gè)場(chǎng)的9頭份陽(yáng)性均為美洲型經(jīng)典株；眉山1 個(gè)場(chǎng)的5 頭份陽(yáng)性樣品中，3 頭份為類NADC-30 毒株，2 頭份為美洲型經(jīng)典株與類NADC-30 毒株混合感染的毒株。以上結(jié)果表明，四川省目前流行的豬藍(lán)耳病毒株以美洲型經(jīng)典株與類NADC-30 毒株為主，且個(gè)別地區(qū)存在上述兩種毒株混合感染的情況。

4 討論與建議

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)逐漸實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?、集約化。近年來，從對(duì)全國(guó)重點(diǎn)原種豬場(chǎng)主要疫病的監(jiān)測(cè)情況來看，當(dāng)前我國(guó)種豬場(chǎng)呈現(xiàn)病原混合感染多、疫病流行日益嚴(yán)重和復(fù)雜的趨勢(shì)，尤其是2018 年以來非洲豬瘟的傳入，進(jìn)一步加劇了疫病防控的嚴(yán)峻形勢(shì)。凈化種豬動(dòng)物疫病，降低病原傳播風(fēng)險(xiǎn)，有利于生豬產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展，對(duì)解決種業(yè)發(fā)展（種豬業(yè)）“卡脖子”關(guān)鍵技術(shù)難題具有重大意義。我國(guó)口蹄疫防控參照OIE 推薦的“口蹄疫漸進(jìn)性控制計(jì)劃（PCPFMD）”路線圖實(shí)施，按照“因地制宜、分區(qū)防治、分型控制”的管理原則，大力推進(jìn)口蹄疫綜合防制策略。依據(jù)PCP-FMD 的評(píng)估規(guī)定，我國(guó)目前處于PCP 的第3 階段，即實(shí)行根除流行的控制措施、減少病毒循環(huán)［2］。當(dāng)前，全國(guó)原種豬場(chǎng)豬偽狂犬病的凈化已初見成效，但是部分場(chǎng)個(gè)體陽(yáng)性率仍較高，短期內(nèi)凈化還存在一定難度。大多數(shù)原種豬場(chǎng)的豬瘟已得到了有效控制甚至達(dá)到了免疫凈化，但要進(jìn)一步提升防控效果，并在全部種豬場(chǎng)實(shí)現(xiàn)豬瘟凈化，仍面臨著政策、經(jīng)濟(jì)、技術(shù)等層面的諸多制約因素。原種豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病在2015～2016 年出現(xiàn)反彈，與類NADC-30 毒株的傳入時(shí)間相吻合，使得豬藍(lán)耳病的防控形勢(shì)更趨復(fù)雜［3］。

本研究對(duì)四川省內(nèi)5個(gè)市的8個(gè)規(guī)模種豬場(chǎng)開展了非洲豬瘟、口蹄疫、豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病5 種主要疫病的病原學(xué)檢測(cè)，為全省科學(xué)開展種豬疫病的防控與凈化提供了技術(shù)支撐。從檢測(cè)結(jié)果來看，四川省規(guī)模種豬場(chǎng)主要疫病凈化工作取得了初步成效，但個(gè)別地區(qū)還存在豬藍(lán)耳病感染，建議各地在已有凈化工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善落實(shí)種豬疫病防控措施，加大政策與技術(shù)支持力度，從種豬源頭控制動(dòng)物疫病?！?/p>