王婉玲，楊 翠，高攀科，陳小雙，梁勇會，李敬東

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科，河南 衛(wèi)輝 453100)

非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin′s lymphoma，NHL)是一種起源于淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤，按細胞來源可以分為B細胞性、T細胞性和自然殺傷(natural killer，NK)/T細胞性，其中以B細胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin′s lymphoma，B-NHL)發(fā)病率較高[1-2]。目前，關于B-NHL的發(fā)病機制尚未十分明確，研究認為，細胞增殖和凋亡失衡與其發(fā)生、發(fā)展密切相關[3]。B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)是一種凋亡抑制基因，可抑制正在發(fā)生凋亡的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放，從而阻斷細胞凋亡。CD10是細胞表面的中性內(nèi)肽酶，可滅活多種生物活性肽，通過水解刺激B細胞分化的肽類物質(zhì)可下調(diào)B細胞的分化。細胞周期蛋白D1(cyclin D1)是一種重要的細胞周期調(diào)節(jié)因子。既往研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1基因過度表達可促進細胞增生并導致惡性轉(zhuǎn)化[4]?；诖?， 本研究旨在觀察B-NHL患者腫瘤組織中Bcl-2、CD10及cyclin D1的表達變化，探討其臨床意義，以期為B-NHL的臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年6月至2019年8月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的78例B-NHL患者為B-NHL組。其中男40例，女38例；年齡24～89(59.73±15.91)歲；病理類型：彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)51例，濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)16例，套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)11例。病例納入標準：(1)經(jīng)病理穿刺活檢確診為B-NHL[5]；(2)未合并其他惡性疾?。?3)臨床資料完整；(4)術前未進行化學治療、放射治療。病例排除標準：(1)合并慢性呼吸道疾病者；(2)合并意識障礙者；(3)合并腎炎、全身變態(tài)反應性病史；(4)妊娠期孕婦或哺乳期婦女。另選擇同期新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的50例淋巴組織反應性增生患者作為對照組，其中男31例，女19例；年齡23～87(58.26±14.08)歲。2組患者性別分布、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑鼠抗人Bcl-2、CD10、cyclin D1單克隆抗體購自北京中杉金橋生物工程有限公司；鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(Streptomyces avidin peroxidase linkage，S-P)免疫組織化學系列工作液試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色劑購自河北博海生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織標本取材及處理B-NHL組患者行細針穿刺，利用20 mL注射器、7號針頭多方向、多點穿刺腫瘤部位取腫瘤組織；對照組患者應用B-NHL組方法多點穿刺增生淋巴結取淋巴組織。組織取材后立即用10 g·L-1多聚甲醛固定，二甲苯透明；常規(guī)石蠟包埋，4.0 μm層厚連續(xù)切片。

1.3.2 免疫組織化學染色法檢測Bcl-2、CD10及cyclin D1表達根據(jù)S-P免疫組織化學染色法，將組織切片常規(guī)脫蠟至水化，然后浸泡在枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中，微波95 ℃加熱10 min進行抗原修復；滴加Bcl-2、CD10及cyclin D1一抗(稀釋濃度均為1100)，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，4 ℃冰箱中孵育過夜，DAB顯色，蘇木精復染，自來水反藍，透明、封片，光學顯微鏡下觀察；以Bcl-2、CD10及cyclin D1已知陽性表達的組織切片作陽性對照。根據(jù)著色細胞百分比、染色強度進行結果判斷[6]，著色細胞百分比評分：無著色細胞計0分，著色細胞<10%計1分， 10%～50%計2分，>50%計3分；染色強度評分：無染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。總積分=著色百分比評分×染色強度評分，總積分≥3分為陽性表達，陽性表達率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.3.3 一般資料收集收集B-NHL組患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、臨床分期和病理類型等臨床病歷資料，分析Bcl-2、CD10和cyclin D1陽性表達與B-NHL臨床病理特征的關系。

1.3.4 隨訪對B-NHL患者進行1 a電話隨訪，統(tǒng)計死亡病例。

1.4 統(tǒng)計學處理應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用多元logistic回歸分析B-NHL預后的影響因素；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組患者的Bcl-2、CD10及cyclin D1表達情況比較結果見圖1和表1。Bcl-2在細胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒，CD10在細胞膜內(nèi)呈棕黃色顆粒，cylin Dl在細胞核內(nèi)呈棕黃色顆粒。B-NHL組患者腫瘤組織中Bcl-2、CD10及cyclin D1陽性表達率分別為78.21%(61/78)、38.46%(30/78)、87.18%(68/78)；對照組患者反應性增生性淋巴組織中Bcl-2、CD10 及cyclin D1陽性表達率分別為36.00%(18/50)、100.00%(50/50)、0.00%(0/50)。B-NHL組患者腫瘤組織中Bcl-2、cyclin D1陽性表達率顯著高于對照組，CD10陽性表達率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=22.971、92.992、49.231，P<0.01)。

表1 B-NHL患者腫瘤組織中Bcl-2、CD10及cyclin D1陽性表達與臨床病理特征關系的單因素分析

2.2 B-NHL患者腫瘤組織中Bcl-2、CD10及cyclin D1陽性表達與臨床病理特征的關系單因素分析結果見表1。B-NHL患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、臨床分期與Bcl-2、CD10及cyclin D1陽性表達均無關(P>0.05)；B-NHL患者的病理類型與CD10、cyclin D1陽性表達相關(P<0.05)，與Bcl-2陽性表達無關(P>0.05)。

2.3 B-NHL患者預后及死亡影響因素單因素分析結果見表2。隨訪1 a，B-NHL組患者死亡20例(25.64%)，生存58例(74.36%)。腫瘤臨床分期、病理類型、Bcl-2、CD10及cyclin D1表達與B-NHL患者死亡相關(P<0.05)，年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置與B-NHL患者死亡無關(P>0.05)。

表2 B-NHL患者死亡危險因素的單因素分析

2.4 B-NHL患者死亡影響因素的多因素分析結果見表3。多因素 logistic回歸分析顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、病理類型為DLBCL、Bcl-2陽性表達、cyclin D1陽性表達及CD10陰性表達是影響B(tài)-NHL患者死亡的獨立危險因素(P<0.01)。

表3 B-NHL患者死亡影響因素的多因素分析

3 討論

B-NHL在臨床上較為常見，且預后較差。目前B-NHL發(fā)生的分子機制尚未十分明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2及CD10、cyclin D1可能與B-NHL發(fā)生、發(fā)展及預后相關[7]。Bcl-2是抗細胞凋亡的重要因子，通過線粒體途徑抑制細胞的凋亡，使腫瘤細胞凋亡過程發(fā)生異常，為細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化提供機會[8]。ASHIZAWA等[9]通過對NHL患者的Bcl-2表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)Bcl-2在淋巴瘤組織中呈高表達，且在B-NHL組織中的陽性率顯著高于T-NHL組織，但Bcl-2表達與B-NHL患者的各臨床病理指標無明顯相關性。CD10又可稱為普通型急性淋巴細胞白血病抗原，在人體造血系統(tǒng)的診斷中具有應用價值[10-11]。cyclin D1是細胞周期相關癌基因，主要是通過抑制Rb蛋白活性，與細胞周期蛋白依賴激酶協(xié)同調(diào)控細胞周期，在細胞從G1期進入S期中起重要作用，其過度表達可促進細胞增生并可能導致惡性轉(zhuǎn)化[12-14]。MAURY等[15]研究報道，cyclin D1表達在肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中明顯增高。袁振亞等[16]研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1除在MCL組織中表達外，還表達于部分DLBCL組織中，提示在不同類型的B細胞淋巴瘤中cyclin D1表達存在一定差異。

本研究分別檢測了反應性增生淋巴組織與B-NHL組織中Bcl-2、CD10及cyclin D1的表達，結果顯示，B-NHL組織中Bcl-2、cyclin D1陽性表達率顯著高于反應性增生淋巴組織，CD10陽性表達率顯著低于反應性增生淋巴組織，與SUN 等[17]研究報道相符；提示Bcl-2、CD10及cyclin D1在B-NHL的發(fā)病中具有重要作用，其可作為B-NHL診斷的生物標志物。此外，本研究結果還顯示，B-NHL患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤位置、臨床分期與Bcl-2、CD10及cyclin D1陽性表達無關；B-NHL患者的病理類型與CD10、cyclin D1陽性表達相關，與Bcl-2陽性表達無關；提示CD10、cyclin D1可作為鑒別診斷不同病理類型B-NHL的重要指標之一。

近年來，在B-NHL中展開了Bcl-2、CD10及cyclin D1表達與預后相關性的研究，但研究結果仍存在一定爭議[18-19]。JIA等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2陽性表達高者預后較好。NGUYEN等[18]研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1的聚集可能是某些淋巴瘤惡性轉(zhuǎn)化的原因之一，并增加預后不良發(fā)生率。CHIRCOP等[21]研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者腫瘤組織中Bcl-2、CD10異常表達是導致患者預后差的重要因素。本研究單因素分析結果顯示，腫瘤臨床分期、病理類型及Bcl-2、CD10、cyclin D1表達與B-NHL患者死亡相關；多因素分析顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、病理類型為DLBCL、Bcl-2陽性表達、cyclin D1陽性表達及CD10陰性表達是影響B(tài)-NHL患者預后死亡的獨立危險因素；提示，Bcl-2、CD10及cyclin D1可作為B-NHL患者獨立的預后判定指標。

綜上所述，Bcl-2、CD10及cyclin D1在B-NHL組織中呈異常表達，參與了B-NHL發(fā)生、發(fā)展，可作為判斷B-NHL患者預后的參考指標，CD10、cyclin D1可作為鑒別診斷不同病理類型B-NHL的重要指標。