金裕華，康 薇，鄭 進，胡長洪，鄒 濤*

(湖北理工學院 a.化學與化工學院，b.礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435003)

秸稈資源豐富，但大多尚未得到充分有效的利用。其主要成分是纖維素[1]，因而纖維素降解是秸稈利用的關鍵。目前，一般采用物理、化學和生物法處理秸稈，其中利用微生物降解纖維素具有成本低、綠色無污染、高效等優(yōu)點[2]。微生物對纖維素的降解主要是通過向胞外分泌纖維素酶來催化降解纖維素。細菌分泌的纖維素酶大多是胞內(nèi)酶，真菌分泌的纖維素酶大多是胞外酶。真菌、放線菌的纖維素酶分泌能力普遍高于細菌，但細菌繁殖快[3]。目前，微生物降解纖維素的關鍵在于篩選高效纖維素降解菌。食性昆蟲后腸是纖維素降解菌篩選的良好來源。本文從東亞飛蝗后腸中篩選出高效降解纖維素菌株，采用形態(tài)學對篩選的高效菌株進行初步鑒定，并將幾株高效菌進行復配，構(gòu)建纖維素降解復合菌系，通過纖維素降解率和產(chǎn)酶能力反映各復配體系纖維素降解效果，旨在為麥秸稈還田提供菌株材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品

供試昆蟲：東亞飛蝗成蟲，2019年4月購于淘寶，實驗前斷食1 d，排除腸道食物殘渣。

1.1.2培養(yǎng)基

液體富集培養(yǎng)基[4]：選擇羧甲基纖維素鈉作為唯一碳源，10 g/L CMC—Na，0.001 g/L FeSO4·7H2O，1.0 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，0.5 g/L NaNO3，0.02 g/L硫酸鏈霉素，pH=7.2。

CMC—Na培養(yǎng)基[5]：5 g/L CMC—Na，0.5 g/L MgSO4，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KCl，12 g/L瓊脂，其自然pH=5.5～6.0。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基參考文獻[6]配制，濾紙分解培養(yǎng)基和秸稈分解培養(yǎng)基參考文獻[3]配制，真菌培養(yǎng)基(馬丁式培養(yǎng)基)、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基參考《微生物學實驗教程》(周德慶、徐德強主編，3版，高等教育出版社)配制。

1.2 方法

1.2.1纖維素降解菌的初篩

參考文獻[7]中的方法解剖蝗蟲。將蝗蟲浸于70%的酒精中滅菌7～8 min使其死亡，移至超凈工作臺中已滅菌的培養(yǎng)皿里，剪去足與翅，用剪刀從背部肛門剪至胸部，用解剖針和鑷子取出消化道，將其置于事先滅菌的研缽中研磨。加入10 mL無菌水制成菌懸液，再取1 mL菌懸液按10倍濃度梯度依次稀釋至10-7。分別取稀釋100，1 000，10 000，100 000，1 000 000，10 000 000倍的菌懸液各0.2 mL于CMC—Na培養(yǎng)基平板上涂布均勻，靜置30 min，倒置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。將CMC—Na培養(yǎng)基平板上長勢良好的單菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min 搖床富集培養(yǎng) 7 d。對富集后的菌株進行劃線、傳代、純化，對純化后的菌株進行編號和保藏。

1.2.2纖維素降解菌的復篩

對CMC—Na分解能力的測定：挑取純化后的細菌和放線菌單菌落在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上點樣，于30 ℃避光培養(yǎng)15 d，觀察各菌株透明圈的大小。

對濾紙分解能力的測定：將純化后的細菌和放線菌進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，取5 mL菌懸液到濾紙分解培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，以濾紙的斷裂程度評價菌株對纖維素的降解效果。

1.2.3復合菌系的構(gòu)建及對小麥秸稈降解能力的測定

引入一株真菌(該真菌為研究小組之前竹林表土中篩選所得，還未鑒定)與蝗蟲腸道中篩選出的纖維素降解能力較強的放線菌和細菌構(gòu)建高效纖維素降解菌的復合菌系。將復合菌系和濾紙崩解實驗得到纖維素降解能力較強的菌株分別接入到以小麥秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)，重復3次實驗。10 d和20 d后，分別取秸稈，測量秸稈的降解率，并測定秸稈紅外光譜吸收圖。取出發(fā)酵7 d的未降解秸稈，烘干計算，測定菌株的實際降解能力；另于4，7，10，13，16，19 d后，分別去發(fā)酵液，測定濾紙纖維素酶活性和漆酶活性。

1.2.4菌株鑒定

利用瑞氏姬薩姆染色鑒定菌株形態(tài)，經(jīng)顯微鏡(1 000×)觀察。采用16SrDNA的PCR產(chǎn)物測序的方法進行分子鑒定。

1.2.5酶活的測定

纖維素全酶活測定方法參考文獻[8]，ABTS法測定漆酶酶活參考文獻[9]。

1.2.6紅外測定

為了解小麥秸稈的降解機理，采用PerkinElmer Spectrum Two紅外光譜分析菌株和復合菌株處理10 d和20 d的小麥秸稈。用小型粉碎機將秸稈打碎后過200目篩，取少量樣品粉末放入研缽中，加入溴化鉀研磨均勻后壓片，在PerkinElmer Spectrum Two紅外光譜儀上進行觀察，每個樣品重復檢測3次，吸收波長范圍為450～4 000 cm-1。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan檢驗，P<0.05，利用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選分離

以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源進行初篩，獲得細菌6株，放線菌1株，再通過剛果紅培養(yǎng)基和濾紙分解培養(yǎng)復篩。菌株剛果紅水解圈效果如圖1所示，培養(yǎng)7 d菌株對濾紙的降解效果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)1號菌和4號菌有明顯的水解圈，且其濾紙分解培養(yǎng)基中的大部分濾紙轉(zhuǎn)化為小碎片，說明這2株菌對纖維素和木質(zhì)素都有顯著降解作用，其表達的各種酶的協(xié)同作用較強。

(a) 1號菌 (b) 4號菌

(a) 1號菌 (b) 4號菌

2.2 高效降解纖維素菌株的鑒定

2.2.1菌落形態(tài)分析

菌株瑞氏姬薩姆染色效果(1 000×) 如圖3所示，菌落形態(tài)特征如圖4所示。1號菌菌落中間灰色，外圍白色，表面呈粉狀，初步鑒定為鏈霉菌，是革蘭氏陽性菌。4號菌為桿狀，菌落粘稠不易斷裂，在培養(yǎng)基上呈地衣狀，初步鑒定為黃桿菌，是革蘭氏陰性菌。

(a) 1號菌 (b) 4號菌

(a) 1號菌 (b) 4號菌

2.2.216SrDNA基因分析

對1號菌、4號菌的16SrDNA的PCR產(chǎn)物進行測序，與公共數(shù)據(jù)庫NCBI進行DNA序列同源性比較，并對其同源序列用MEGA6軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進化樹。1號菌和親緣菌株的系統(tǒng)進化樹如圖5所示，4號菌和親緣菌株的系統(tǒng)進化樹如圖6所示。

圖5 1號菌和親緣菌株的系統(tǒng)進化樹

圖6 4號菌和親緣菌株的系統(tǒng)進化樹

BLAST比對結(jié)果表明菌株1與Streptomycesgriseus有99%同源性，4號菌與Flavobacteriumjohnsoniae有99%同源性。結(jié)合微觀形態(tài)和菌落形態(tài)初步鑒定1號菌為鏈霉菌屬灰色鏈霉菌，4號菌為黃桿菌屬短黃桿菌。

2.3 復合菌株對小麥秸稈的降解能力

通過濾紙崩解實驗及水解圈實驗，綜合考慮，選擇纖維素降解效果好的放線菌1號菌和細菌4號菌，引入真菌7號菌構(gòu)建高效纖維素降解復合菌系。分別對1，4，7號和復合菌系進行小麥秸稈發(fā)酵，驗證復合菌系纖維素降解能力。不同菌系對小麥秸稈的降解率如圖7所示。

圖7 不同菌系對小麥秸稈的降解率

由圖7可知，1號菌的降解率為22%，4號菌的降解率為17%，復合菌的降解率高達35%。這說明復合菌體系中3株菌對秸稈分解起協(xié)同增效作用，此復合菌體系的構(gòu)建具有一定的應用研究價值。

3 復合菌系降解小麥秸稈的機理

3.1 小麥秸稈降解過程中的FTIR圖譜分析

1號菌降解小麥秸稈的FTIR圖譜如圖8所示，不同菌系降解小麥秸稈20 d后的FTIR圖譜如圖9所示。

圖8 1號菌降解小麥秸稈的FTIR圖譜

圖9 不同菌降解小麥秸稈20 d后的FTIR圖譜

綜合來說，小麥秸稈發(fā)酵時，4號菌和復合菌對纖維素的降解作用較好，對木質(zhì)素的分解效果甚微；1號菌和7號菌對纖維素、木質(zhì)素分解能力要比4號菌和復合菌系的好，且對木質(zhì)素的降解效果尤為顯著。小麥秸稈降解過程中，發(fā)生主要結(jié)構(gòu)變化的是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，具體為纖維素被分解后，蠟質(zhì)層表面逐漸脫落，木質(zhì)素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)得以裸露，苯環(huán)在纖維素降解菌的作用下裂解，使木質(zhì)素進一步降解。

3.2 小麥秸稈降解過程中酶活性變化

纖維素酶活和漆酶酶活隨時間的變化曲線分別如圖10、圖11所示。由圖10可知，4種菌發(fā)酵處理的纖維素酶活在第4～19 d內(nèi)的變化趨勢類似，基本呈下降趨勢，且變化不明顯，說明纖維素降解啟動較早，在4 d左右降解最活躍。此外，可發(fā)現(xiàn)1號菌發(fā)酵7 d后纖維素酶活性顯著高于其他處理；7號菌從13 d開始上升趨勢明顯，19 d時纖維素酶活性顯著高于其他處理。

圖10 纖維素酶活隨時間的變化曲線

圖11 漆酶酶活隨時間的變化曲線

由圖11可知，漆酶活性隨時間的變化趨勢各不相同，其中1號菌、4號菌和復合菌在第4 d時漆酶酶活與7號相比較高，且很快下降。7 d后，1號菌、7號菌和復合菌的漆酶活性明顯上升，而4號菌無明顯的上升趨勢。7號菌的漆酶酶活一直呈上升趨勢，且到第16 d超過1號菌的漆酶酶活，復合菌的漆酶活性在7 d后基本和7號菌持平，說明小麥秸稈木質(zhì)素的降解活動主要在16 d左右最活躍。

4 結(jié)論

從蝗蟲腸道中篩選出高效纖維素降解菌，并構(gòu)建高效纖維素降解復合菌系，復合菌對小麥秸稈的降解率最高可達35%。小麥秸稈降解過程中，各菌株先產(chǎn)生水解酶分解纖維素和半纖維素，此時纖維素酶活較高，當漆酶酶活逐漸升高時，秸稈蠟質(zhì)層表面逐漸脫落，木質(zhì)素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)得以裸露，苯環(huán)在纖維素降解菌的作用下裂解，使木質(zhì)素進一步降解。