王 慧，劉伯承，楊 俊，杜麗飛,2，彭苗苗,2，劉俊琦，王紅兵

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131；2.湖南鑫廣安農(nóng)牧股份有限公司，湖南長沙410129）

乳房炎是造成奶牛業(yè)損失最多的全球性奶牛疾病，常導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降。引起奶牛乳房炎的因素復(fù)雜多樣，其中病原菌感染尤為普遍，目前報道的已有80余種，其中鏈球菌是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌之一。以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和化膿鏈球菌等最為常見[1]。據(jù)報道，鏈球菌所致的奶牛乳房炎臨床癥狀不明顯，容易被忽視，從而造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。同時，隨著抗生素的普遍使用甚至濫用，造成藥物治療無效。因此，定期進(jìn)行病原菌的分離鑒定及耐藥分析極其重要。實驗研究了奶牛隱性乳房炎中鏈球菌的分布及耐藥性，為該牛場在治療奶牛乳房炎時選擇藥物及后期的防控工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（自配）、綿陽血瓊脂平皿（購自長沙市寶生盾生物科技有限公司）；

1.1.2 實 驗 試 劑：藥 敏 紙 片、mark2000、PCR Master Mix、GelRed核酸染料、電泳液、瓊脂糖，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，均購自長沙市寶生盾生物科技有限公司；16s RNA通用引物，由華大基因合成。

1.1.3 病料來源：試驗所用菌株來自湖南地區(qū)某奶牛場，采集疑似隱性乳房炎的患牛乳汁并分離到的8株鏈球菌。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳房炎判斷標(biāo)準(zhǔn)：牛乳體細(xì)胞數(shù)（SCC）推薦分級標(biāo)準(zhǔn)參照國際乳業(yè)聯(lián)合會（IDF）的規(guī)定，其中SCC＜50萬個/mL為健康奶牛；100萬個/mL＞SCC＞50萬個/mL為隱性乳房炎；SCC＞100萬個/mL為臨床型乳房炎[2]。

1.2.2 鏈球菌的分離純化：將送檢乳樣無菌接種于綿羊血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察是否有菌落生長并挑取可疑單個菌落進(jìn)行傳代純化，純化后再將單個菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，獲得純菌株增菌液。

1.2.3 鏈球菌的PCR測序鑒定：對所純化細(xì)菌用16s RNA（27F/1492R）通用引物進(jìn)行擴(kuò)增,序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴(kuò)增片段長度為1500bp左右。挑取純培養(yǎng)后的細(xì)菌于滅菌純水中混勻，于100℃水浴10分鐘，再置于冰塊10分鐘以上，然后離心取上清液即為病原菌的基因組作為PCR模板，進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，進(jìn)行基因測序后Blast比對。

1.2.4 鏈球菌的藥物敏感性試驗：采用K-B紙片擴(kuò)散法，對分離出的主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗，按照CLSI推薦的肉湯稀釋法及標(biāo)準(zhǔn)[3]判斷其耐藥性。選用的藥物有氨芐西林、頭孢拉定、阿奇霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素、鏈霉素、恩諾沙星。

1.2.5 鏈球菌耐藥基因檢測：取1.5ML增菌液，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取細(xì)菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。耐藥基因引物序列及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[4]，共檢測了10種鏈球菌耐藥基因（大環(huán)內(nèi)酯類：ermA；ermB；mefA；氨基糖苷類：Aph3’；四環(huán)素類：tetL；tetK；tetM；tetO；喹諾酮類：gyrA；ParC）。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 實驗結(jié)果

2.1 鏈球菌的分離鑒定結(jié)果

于2020年接收該牛場的5次送樣共計52份樣品中分離出8株鏈球菌，編號為：1、5、7、13-1、6-2、4-2、20、23，基因測序鑒定顯示乳房鏈球菌4株（5、7、6-2、4-2）、停乳鏈球菌2株（20、23）、A群鏈球菌2株（1、13-1）。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，本次分離到的8株鏈球菌整體耐藥率不高，每株細(xì)菌均能篩選出3種以上的敏感藥物。從整體上看對鏈霉素、慶大霉素、諾氟沙星耐藥率最高，鏈霉素耐藥率100%；慶大霉素耐藥率87.5%，諾氟沙星耐藥率62.5%；對氨芐西林、頭孢拉定、萬古霉素耐耐藥率為0，對阿奇霉素、四環(huán)素耐藥率為37.5。具體結(jié)果見表1。

表1 鏈球菌的藥敏試驗結(jié)果 （抑菌圈：mm）

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果

對分離的8株鏈球菌10種耐藥基因檢測顯示，大環(huán)內(nèi)酯類ermB基因和喹諾酮類的gyrA和ParC檢出率最高，其次是四環(huán)素類tetL，tetK基因；氨基糖苷類mefA，其他4種耐藥基因均未檢出。其中編號為13-1和6-2的A群鏈球菌攜帶耐藥基因最多，其次為編號20、23的停乳鏈球菌和編號1的乳房鏈球菌。攜帶耐藥基因最少的是編號為5、7、4-2的乳房鏈球菌。

表2 8株鏈球菌的耐藥情況統(tǒng)計

3 討論

本次試驗主要分離到乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和A群鏈球菌，乳房鏈球菌分離率最高，并沒有分離到無乳鏈球菌，說明該場的常在乳房炎病原菌為乳房鏈球菌，與國內(nèi)的其他報道無相關(guān)性[5-7]，說明奶牛乳房炎病原微生物復(fù)雜多樣，不同牛場分離菌株存在差異性，并不能參照其他報道進(jìn)行預(yù)防與治療，所以檢測本場常在病原菌種類，明確病原菌的耐藥性顯得極其重要。

抗生素等抗菌藥仍是獸用抗炎藥物的主要選擇，在治療疾病方面起著重要的作用，無論是人類還是動物，甚至植物在預(yù)防和治療各種細(xì)菌性感染疾病均離不開抗生素，然而對抗生素的過度依賴，加上濫用，對生命已經(jīng)造成了一些不可逆轉(zhuǎn)的危害。據(jù)統(tǒng)計，我國每年抗生素總產(chǎn)量大約為21萬噸，國內(nèi)消費量約18萬噸，其中用于畜牧及飼料行業(yè)的抗生素就高達(dá)9.7萬噸，約占54%[8]，由于抗生素的大量使用，我國已成為全世界耐藥性最嚴(yán)重的國家。在奶牛乳房炎的防治過程中大量依賴抗生素，也不同程度增加了細(xì)菌耐藥性，某些抗菌藥物幾乎沒有作用，給奶牛乳房炎的治療加大了難度。本試驗中分離的8株細(xì)菌均有不同程度的耐藥，其中對鏈霉素已經(jīng)100%耐藥，慶大霉素和阿奇霉素的耐藥率也分別達(dá)87.5%和62.5%。因此建議該場需減少這幾類抗生素的使用，而選擇敏感性強(qiáng)的氨芐西林、頭孢拉定或者萬古霉素等相應(yīng)類抗生素。

在對8株鏈球菌進(jìn)行耐藥基因檢測時發(fā)現(xiàn)，8株鏈球菌均不同程度的攜帶有耐藥基因，其中A群鏈球菌攜帶耐藥基因最多，其次是停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。共計檢測出6種不同類型的耐藥基因，分別為gyrA（87.5%）、ParC（75.0%）、ermB（75.0%）、tetL（25.0%）、tetK（12.5%）、mefA（12.5%）?？梢钥闯霰敬畏蛛x出的鏈球菌攜帶喹諾酮類耐藥基因gyrA（87.5%）最高，其次是喹諾酮類耐藥基因ParC（75.0%）和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB（75.0%），氨基糖苷類耐藥基因Aph3’并未檢出，這與藥敏試驗結(jié)果并沒有很高的符合率，藥敏試驗中分離鏈球菌對氨基糖苷類的慶大霉素和鏈霉素均有較強(qiáng)的抗藥性，也可能是攜帶了其他氨基糖苷類的耐藥基因所致。而喹諾酮類的耐藥基因除了編號4-1未檢出外，其他菌株均有攜帶，但對諾氟沙星的抗藥性卻為達(dá)到100%。說明細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生是一個非常復(fù)雜的過程，耐藥基因的檢測只能作為其中一環(huán)參考因素來考慮。

目前在治療奶牛乳房炎方面仍未研究出能完全替代抗生素的藥物，抗生素仍是治療奶牛乳房炎的首要選擇，因此如何合理的選則抗菌藥、完善抗菌藥的使用策略來減少細(xì)菌耐藥性德產(chǎn)生是臨床上亟待解決的問題，最簡單的方式就是藥敏試驗來篩選該養(yǎng)殖場常在致病菌的敏感藥物，避免過度使用無效抗生素。同時加大細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究，以期減少耐藥菌的產(chǎn)生。 □