張巍，王希，李依娜，郭琳，張寶剛*

（1.中國地質(zhì)大學(xué)（北京）水資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100083；2.上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海 200233）

鉻（Cr）是地殼中含量最多的元素之一[1]，在環(huán)境中，三價鉻[Cr（Ⅲ）]和六價鉻[Cr（Ⅵ）]是其最主要且最穩(wěn)定的兩種存在形態(tài)[2]。Cr（Ⅲ）能夠作為營養(yǎng)補充劑，在動物和人體的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[3]。而Cr（Ⅵ）具有劇毒，能夠誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激，損傷DNA 與蛋白質(zhì)[4]。Cr（Ⅵ）與Cr（Ⅲ）遷移性、水溶性以及進入細胞能力的差異，使前者的毒性是后者的100倍以上[5]。Cr（Ⅵ）污染通常是由工業(yè)活動引發(fā)的[6?7]，主要是在染料合成、皮革鞣制、金屬電鍍、木材防腐等工業(yè)活動中產(chǎn)生[8?9]。降水期間鉻渣場發(fā)生的泄露和含鉻工業(yè)廢水不合理的排放導(dǎo)致Cr（Ⅵ）進入地表水體和地下水系統(tǒng)中[7，10]。

將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）是修復(fù)受Cr（Ⅵ）污染環(huán)境的關(guān)鍵途徑?；瘜W(xué)還原被認(rèn)為是徹底去除鉻污染的較為經(jīng)濟且穩(wěn)定的方法[11]。盡管已有多種還原劑被證實可以還原Cr（Ⅵ），然而其卻存在不同的缺點，例如動力學(xué)上反應(yīng)緩慢或還原劑具有毒性[12?13]。添加無機納米材料作為還原Cr（Ⅵ）的催化劑能夠提高反應(yīng)速率，形成不溶性鉻沉淀，避免Cr（Ⅲ）被有機物再次氧化[11]。催化劑在Cr（Ⅵ）的催化還原中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，常用的無機納米催化劑包括TiO2、Pd 和Fe等[14?17]。其中，由于鈀納米顆粒（Pd?NPs）對還原劑具有很強的親和力[18]，且材料容易實現(xiàn)穩(wěn)定化[19]，因此受到了越來越多的關(guān)注。

常用的制備Pd?NPs 的方法是化學(xué)合成，但該方法存在使用的化學(xué)試劑毒性較大或合成的Pd?NPs尺寸偏大等缺點[20]。近年來，微生物合成Pd?NPs 逐漸成為研究的熱點，其主要是利用特定微生物做催化劑，還原含鈀化合物，用以制備Pd?NPs。生物法合成納米材料被認(rèn)為是環(huán)境友好的方法，且制得的顆粒在形狀、尺寸及理化性質(zhì)等方面具有更優(yōu)越的性能，應(yīng)用前景更廣[21]。能催化還原的功能微生物是生物合成Pd?NPs 的核心，常用的功能微生物有硫酸鹽還原菌（Desulfovibrio等）和鐵還原菌（Shewanella等）[22?23]。發(fā)掘可制備Pd?NPs 的菌種資源尤為重要。最近，反硝化菌Thauera在環(huán)境中的應(yīng)用日益興起，其具有優(yōu)異的催化還原特性，異養(yǎng)、自養(yǎng)下均可生活，對環(huán)境條件要求較為寬泛，其脫氫酶和細胞色素能夠參與到氧化還原的電子傳輸過程中，被認(rèn)為是一種能夠用于環(huán)境修復(fù)的潛在菌種[24]。有研究證實，Thauera可用于修復(fù)土壤地下水中的多種有機物、硝酸鹽等污染[25]。但Thauera合成Pd?NPs 的潛力尚未評估，其合成的Pd?NPs還原固定Cr（Ⅵ）的能力也尚未揭示。

因此，為了研究反硝化菌Thauera合成Pd?NPs的可行性，并探究試驗條件對反硝化菌Thauera合成Pd?NPs 的影響規(guī)律，本研究使用材料分析技術(shù)表征所合成的Pd?NPs，并通過與化學(xué)方法合成的Pd（0）對比，評估Thauera合成Pd?NPs催化還原Cr（Ⅵ）的性能。

1 材料與方法

1.1 菌種及其培養(yǎng)

菌種Thauera humireducens來自廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所，其分離于微生物燃料電池，能還原腐殖質(zhì)、三價鐵和硝酸鹽[26]。將T.humireducens接種到含胰蛋白胨（10 g·L?1）、酵母提取物（5 g·L?1）、氯化鈉（10 g·L?1）、pH為（7±0.1）的100 mL無菌液體培養(yǎng)基中，在（30±2）℃振蕩培養(yǎng)，通過光密度計數(shù)（OD=600 nm），在18 h時進入快速生長期，收集此階段的菌體進行后續(xù)試驗。

1.2 Pd?NPs的合成

取快速生長期的菌液40 mL 于50 mL 離心管中，在4 000 r·min?1下離心10 min，用去離子水沖洗下層沉淀3次后，接種到含100 mL人工模擬地下水的血清瓶中。模擬地下水配方如下[27]：氯化鈣（0.246 4 g·L?1，氯化鎂1.057 2 g·L?1，氯化鈉0.445 9 g·L?1，氯化鉀0.028 3 g·L?1，碳酸氫鈉0.808 2 g·L?1，氯化銨0.155 7 g·L?1，磷酸二氫鉀0.029 9 g·L?1，調(diào)節(jié)溶液pH 為（7±0.1），同時加入1.700 g·L?1HCOONa 與0.294 0 g·L?1Na2PdCl4，最后用丁基橡膠塞密封。同樣的條件下，制備不含菌液的混合液，用以得到非生物合成鈀材料。在（30±2）℃條件下，于150 r·min?1的恒溫振蕩箱中振蕩培養(yǎng)24 h，獲得生物合成的Pd?NPs，并對其形貌、成分、結(jié)構(gòu)等進行表征。隨后研究了試驗條件對T.humireducens合成Pd?NPs的影響，分別探究了Pd（Ⅱ）初始濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L?1），HCOONa 初始濃度（5、10、25、50 mmol·L?1），接種生物量（10、25、50、100 mL）和pH（3、5、7、9）的影響規(guī)律。同樣的條件下，不添加T.humireducens，獲得了化學(xué)合成的Pd（0）作為對照。標(biāo)準(zhǔn)酸（0.1 mol·L?1HCl）和堿（0.1 mol·L?1NaOH）用于調(diào)節(jié)pH。

1.3 Pd?NPs催化去除Cr（Ⅵ）

在100 mL 血清瓶中加入0.5 μL·mL?1HCOOH（88%），0.5 mg·mL?1T.humireducens合成的Pd?NPs和0.5 mmol·L?1以K2Cr2O7形態(tài)存在的Cr（Ⅵ），調(diào)節(jié)pH為（3.0±0.1），反應(yīng)周期為1.5 h，在不同時間點取樣并用0.22μm 濾膜過濾，監(jiān)測溶液吸光度與其中Cr（Ⅵ）濃度的變化，同時對比化學(xué)合成的Pd?NPs 催化還原Cr（Ⅵ）的能力。一個周期結(jié)束后，通過離心獲得反應(yīng)中生成的沉淀并回收Pd?NPs，利用材料分析手段表征生成的沉淀。在相同的條件下，使用回收的Pd?NPs繼續(xù)進行去除Cr（Ⅵ）的研究，如此循環(huán)3 個周期，用以評估T.humireducens合成的Pd?NPs 的穩(wěn)定性。同時，探究了pH（3、5、7、9）和初始Cr（Ⅵ）濃度（0.1、0.25、0.5、1.0 mmol·L?1）對Pd?NPs催化還原Cr（Ⅵ）的影響。

1.4 分析測試方法

溶液中Pd（Ⅱ）的測定采用分光光度法[28]，以溶液中Pd（Ⅱ）的減少反推Pd?NPs 的生成。使用紫外可見分光光度計（UV 8000S，Metash，中國）對溶液在250～450 nm 范圍內(nèi)進行全波長掃描，并用分光光度法測定Cr（Ⅵ）濃度。pH 用pH 計（PH?201，Hanna，意大利）測定。

透射電子顯微鏡（TEM）被用于觀察Pd?NPs 的形貌及尺寸，并用軟件Nano Measurer 分析TEM 圖像中的粒徑分布情況。成分使用能量散射X射線譜（EDS）進行評估。用銅靶輻射（波長為1.540 56 ?）的X射線衍射儀對材料進行X射線衍射（XRD）。應(yīng)用X射線光電子能譜（XPS）分析Pd?NPs中Pd和沉淀中Cr的化學(xué)價。

2 結(jié)果與討論

2.1 T.humireducens合成Pd?NPs

在24 h 的運行周期內(nèi)，觀測到溶液中Pd（Ⅱ）的還原效率逐漸升高，同時溶液的顏色由紅棕色逐漸變?yōu)闊o色透明（圖1），伴隨著溶液中出現(xiàn)肉眼可見的黑色顆粒。紫外光譜圖也顯示Pd（Ⅱ）吸光度峰隨著時間的推移而逐漸衰減（圖1），24 h 后，Pd（Ⅱ）得到了全部還原。說明T.humireducens能以Pd（Ⅱ）為電子受體，完成自身的新陳代謝活動，從而實現(xiàn)Pd（Ⅱ）的催化還原以制備Pd?NPs。T.humireducens可以將多種高價化合物如Fe（Ⅲ）、硝酸鹽作為電子受體[24]，而本研究是第一次證實其可以利用Pd（Ⅱ）作為電子受體，用以合成Pd?NPs。在利用生物法制備Pd?NPs中，T.humireducens展示了較高的合成速率（表1），顯著高于相同條件下Shewanella loihica催化制備Pd?NPs的速率，這主要是由于T.humireducens具有較強的環(huán)境適應(yīng)性，這也是利用T.humireducens制備Pd?NPs的優(yōu)勢。但實際上，地下水普遍受到硝酸鹽的污染，高濃度的硝酸鹽會與Pd（Ⅱ）競爭電子[29]，從而降低T.humireducens制備Pd?NPs的效率。

表1 生物法制備Pd?NPs的微生物名稱及相關(guān)參數(shù)Table 1 Microorganism species and related parameters used for biosynthesis of Pd?NPs

2.2 試驗條件的影響

Pd（Ⅱ）的還原速率隨著初始Pd（Ⅱ）濃度的增加而增加（圖2a），說明T.humireducens在高濃度Pd（Ⅱ）下可以更快的制備Pd?NPs，也說明Pd（Ⅱ）對細胞的毒害性較低[37]，高濃度Pd（Ⅱ）未對T.humireducens的代謝活性造成影響。在Pd（Ⅱ）初始濃度為0.5 mmol·L?1時，24 h 內(nèi)Pd（Ⅱ）的還原效率僅為29%，而在其他3個更高的Pd（Ⅱ）初始濃度水平下，溶液中的Pd（Ⅱ）在24 h 內(nèi)基本完全去除，Pd（Ⅱ）最大還原速率也從0.02 mmol·L?1·h?1增加到0.35 mmol·L?1·h?1。

Pd（Ⅱ）的還原速率隨著HCOONa 濃度的增加而加快（圖2b），說明高碳源濃度更利于T.humireducens合成Pd?NPs，這主要是由于高濃度的HCOONa 提供了更多的電子用于Pd（Ⅱ）的還原，并釋放了更多的能量支持T.humireducens的代謝。KOTTENHAHN等[38]在生物催化甲酸制氫的實驗中，同樣發(fā)現(xiàn)了高濃度甲酸鈉并未對反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)碳源濃度從5 mmol·L?1增加到10 mmol·L?1時，24 h內(nèi)Pd（Ⅱ）的還原效率從9%僅增長到25%，但當(dāng)進一步增加HCOO?Na濃度時，可實現(xiàn)Pd（Ⅱ）的完全去除，Pd（Ⅱ）的最大還原速率也從0.01 mmol·L?1·h?1增加到0.13 mmol·L?1·h?1。

隨著接種量的增加，Pd（Ⅱ）的還原速率不斷升高（圖2c）。當(dāng)微生物量為10 mL時，Pd（Ⅱ）的還原效率僅為12%，隨生物量提高，Pd（Ⅱ）的還原效率也逐漸提高，在50 mL 和100 mL 條件下均可實現(xiàn)Pd（Ⅱ）的全部去除。這同時也暗示T.humireducens催化還原Pd（Ⅱ）可能具有群體效益，即微生物量達到一定濃度時，才能觸發(fā)Pd（Ⅱ）還原反應(yīng)的進行。同時，較高的生物量被認(rèn)為有利于形成更小尺寸的Pd?NPs[39]。當(dāng)微生物量從10 mL增加到100 mL時，Pd（Ⅱ）的最大還原速率從0.02 mmol·L?1·h?1增加到0.14 mmol·L?1·h?1。

隨著pH的逐漸升高，Pd（Ⅱ）的還原速率先升高、后降低（圖2d）。強酸性條件（pH=3.0）與堿性條件（pH=9.0）下，Pd（Ⅱ）還原受到顯著抑制，主要是由于此環(huán)境不利于T.humireducens的生長。在中性條件下，24 h 的運行周期可實現(xiàn)Pd（Ⅱ）的全部還原，說明pH形成的環(huán)境條件對T.humireducens合成Pd?NPs有顯著影響。在弱酸性條件下（pH=5.0）Pd（Ⅱ）的還原速率比中性條件下（pH=7.0）更快，Pd（Ⅱ）完全被還原為Pd（0），這主要與氫化酶偏向于在偏酸性條件下產(chǎn)氫有關(guān)[40]，而產(chǎn)生的氫氣也可以促進Pd（Ⅱ）的有效還原[41]。

2.3 Pd?NPs的物化表征

TEM 圖像顯示在T.humireducens細胞上均勻分布著光滑的球形顆粒物（圖3a），微生物細胞作為載體，為Pd?NPs 提供了大量附著點，避免了顆粒的聚集，增強了材料的穩(wěn)定性[42]。顆粒物的尺寸具有窄分布區(qū)間（1～14 nm），并集中分布在2～6 nm（圖3b）。EDS 分析顯示Pd 是這些顆粒物的主要成分（圖3c），從而證實了T.humireducens可催化合成Pd?NPs。與已有研究相比，本研究采用HCOONa作為電子供體的體系，所合成的Pd?NPs 尺寸較小，且反應(yīng)速率較快（表1），顯示出使用T.humireducens合成Pd?NPs 的優(yōu)越性。XRD 圖譜展示了Pd?NPs 的立方結(jié)構(gòu)，在2 θ=40.233°、46.805°、68.288°、82.183°、86.703°處觀測到（111）、（200）、（220）、（311）、（222）晶面標(biāo)志的特征衍射峰（圖3d），其中，以（111）晶面占主導(dǎo)。通過謝樂公式對最主要衍射峰進行計算，可以獲得合成的Pd?NPs亞晶尺寸[43]，得到在（111）晶面觀察到的Pd?NPs納米材料尺寸為2.6 nm，這與圖3b 中所給出的粒徑分布基本吻合，證明了T.humireducens合成的Pd?NPs尺寸較為均勻。高分辨率的TEM 圖顯示了合成的Pd?NPs 在（111）晶面的晶格條紋（圖3e）。在XRD 圖譜中計算所得（111）晶面間距dhkl為2.239 7?，晶格常數(shù)為3.879?，發(fā)生了輕微的晶格收縮。而WANG等[23]發(fā)現(xiàn)的是晶格膨脹，這可能是由于所合成的Pd?NPs中摻入了雜質(zhì)[44]。此外，晶格收縮也提高了Pd?NPs對H 的催化活性[45]。XPS圖譜顯示Pd（0）的3d核心能級譜有335.5 eV和341.2 eV兩個峰（圖3f），分別對應(yīng)5/2和3/2自旋軌道[46]；XPS中觀察到的少量Pd（Ⅱ）可能是由于測樣過程中造成的表面氧化形成了PdO[47]。

2.4 Pd?NPs催化還原鉻的性能

在 添加 了T.humireducens合 成Pd?NPs 的 體系中，隨著反應(yīng)進行，含Cr（Ⅵ）溶液由黃色逐漸變?yōu)闊o色透明。在0、10、20、30、60、90 min 對Cr（Ⅵ）濃度進行監(jiān)測。紫外光譜圖結(jié)果顯示，350 nm 處觀察到最大吸收峰（圖4a），這是的特征峰[48?49]，此峰值隨著運行時間延長而逐步衰減，指示了Cr（Ⅵ）的逐步去除。在90 min的運行周期內(nèi)，Pd?NPs對Cr（Ⅵ）的還原效率達到了95%。反應(yīng)滿足一級動力學(xué)方程（r2=0.969）且反應(yīng)速率在0～20 min 增加，20～90 min 減小，這可能與其作用機理相關(guān)。過量的HCOOH 逐漸占滿Pd?NPs 表面而被選擇性分解為H2與CO2，且分解速率不斷提高，直到HCOOH 占滿催化劑的表面，而吸附在Pd?NPs 上的H2再與Cr（Ⅵ）發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)速率隨著Cr（Ⅵ）濃度的降低而降低。化學(xué)合成的Pd（0）對Cr（Ⅵ）的還原效率僅為27%（圖4b）。這證明由T.humireducens合成的Pd?NPs 具備高的催化活性，這可能是源于其極小的顆粒尺寸。此結(jié)果展示了T.humireducens合成的Pd?NPs優(yōu)越的催化除鉻性能。地下水中通常不含Pd（Ⅱ），故需額外添加，以實現(xiàn)微生物合成Pd?NPs，從而用于Cr（Ⅵ）污染地下水的修復(fù)。經(jīng)驗證明，雖然T.humireducens 也可直接還原Cr（Ⅵ），但效率非常低，也難以耐受高濃度的Cr（Ⅵ），這進一步體現(xiàn)了使用T.humireducens 制備的Pd?NPs催化去除Cr（Ⅵ）的優(yōu)勢。

收集反應(yīng)體系生成的沉淀，并用XPS 分析顯示，Cr（Ⅲ）的2p 核心能級譜在586.9 eV 和577.4 eV有兩個峰，分別對應(yīng)1/2 和3/2 自旋軌道[50]，Cr（Ⅲ）是沉淀的主要成分（圖4c）。說明T.humireducens合成的Pd?NPs 催化Cr（Ⅵ）成功轉(zhuǎn)化為Cr（Ⅲ），反應(yīng)后溶液的pH 上升至6.3，在此環(huán)境中，Cr（Ⅲ）可自發(fā)沉淀[51]，Cr（OH）3占據(jù)主導(dǎo)[52]，從而實現(xiàn)鉻污染地下水的有效凈化。

循環(huán)使用3 個周期后，T.humireducens合成的Pd?NPs 仍保持較高的催化活性（圖4d），Cr（Ⅵ）的去除率從第一個循環(huán)周期的97%下降到第三個循環(huán)周期的84%，展示了T.humireducens合成的Pd?NPs 穩(wěn)定的催化性能。催化劑活性的下降可能是由于在循環(huán)過程中損失了小且輕質(zhì)的Pd?NPs。

pH 與初始Cr（Ⅵ）濃度對Pd?NPs 的影響如圖5 所示。酸性環(huán)境有利于Cr（Ⅵ）的去除（圖5a）。在pH3 的環(huán)境下，Cr（Ⅵ）還原效率最大，隨著溶液pH 升高，Cr（Ⅵ）還原效率逐漸下降。在pH7 和9 的環(huán)境下，溶液中Cr（Ⅵ）濃度沒有明顯變化。隨著Cr（Ⅵ）初始濃度的升高，Cr（Ⅵ）還原效率逐漸降低（圖5b）。當(dāng)Cr（Ⅵ）初始濃度為0.1 mmol·L?1和0.25 mmol·L?1時，Cr（Ⅵ）被完全去除。然而，當(dāng)進一步增大Cr（Ⅵ）濃度至0.5 mmol·L?1和1.0 mmol·L?1時，Cr（Ⅵ）的還原效率分別下降到了94%和84%。有研究表明，當(dāng)甲酸含量一定時，可還原的Cr（Ⅵ）的量是固定的，且較高濃度的Cr（Ⅵ）在反應(yīng)中可更快地消耗氫離子，加速了溶液pH 的升高，進一步抑制了反應(yīng)的進行[53]。同時，較高的pH 也影響了Pd?NPs 的表面電位，使得催化劑對甲酸或Cr（Ⅵ）的吸附能力下降，從而對反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用[54]。

3 結(jié)論

（1）首次證明了T.humireducens能夠在24 h 內(nèi)快速制得尺寸集中分布在2～6 nm、分散性良好的Pd?NPs。

（2）增加Pd（Ⅱ）、HCOONa 初始濃度及微生物接種量，或弱酸性環(huán)境條件均能加快T.humireducens產(chǎn)出Pd?NPs的速率。

（3）0.5 mg·mL?1T.humireducens合成的Pd?NPs能在1.5 h 內(nèi)還原95%的Cr（Ⅵ），相比于化學(xué)合成的Pd（0）具有極高的催化性能，可用于鉻污染地下水的有效修復(fù)。

（4）T.humireducens合成的Pd?NPs催化性能較為穩(wěn)定，在循環(huán)使用3個周期后仍保持較高的除鉻性能。