周穎,滕靜,李曉丹,劉亮,肖軍霞
(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266109)
復(fù)凝聚反應(yīng)是指兩種帶相反電荷的生物大分子通過靜電吸引相互作用產(chǎn)生沉淀的一種自發(fā)現(xiàn)象[1-2],目前在食品領(lǐng)域研究最多的復(fù)凝聚體系是多糖/蛋白質(zhì)體系和多糖/多糖體系,已報(bào)道的有黃原膠/殼聚糖[3]、阿拉伯膠/殼聚糖(gum arabic/chitosan,GA/CTS)[4]、海藻酸鈉(sodium alginate,SAL)/殼聚糖[5-6]和 O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl chitosan,O-CMC)/GA等。王津等[7]分別對(duì)GA/CTS和GA/O-CMC復(fù)凝聚體系包埋5-氟尿嘧啶和殺蟲劑啶蟲脒的最佳工藝、微膠囊穩(wěn)定性和芯材釋放性能進(jìn)行了初步研究。Espinosa-Andrews等[8]對(duì)GA/CTS復(fù)凝聚體系在食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,確定了復(fù)凝聚相中兩種大分子的組成對(duì)復(fù)凝聚反應(yīng)的影響,并對(duì)復(fù)凝聚相的表面結(jié)構(gòu)和流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。孫燕婷等[9]確定了GA和CTS復(fù)凝聚反應(yīng)的最佳工藝,在一定條件下制備的GA/CTS復(fù)凝聚相具有較好的腸道靶向釋放性能,可以作為水包油型乳液的微囊化壁材。但目前尚未見到SAL對(duì)O-CMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)及復(fù)凝聚相性質(zhì)影響的研究。
本研究主要探討添加SAL對(duì)O-CMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)及復(fù)凝聚相性質(zhì)的影響,同時(shí)采用差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)和動(dòng)態(tài)流變儀等手段對(duì)制備的復(fù)凝聚相進(jìn)行表征,以確定添加SAL對(duì)復(fù)凝聚相功能性質(zhì)的影響。本研究對(duì)于開發(fā)新型功能的多糖/多糖復(fù)凝聚體系具有重要意義。
CTS(脫乙酰度 95.2%、黏度 500 mPa·s、食品級(jí)):濰坊海之源有限公司;SAL(CP)、GA(食品級(jí))、氫氧化鈉(AR):上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯乙酸(AR):天津巴斯夫有限公司;鹽酸、無水乙醇、異丙醇(AR):萊陽(yáng)市康德化工有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
UV-2000紫外可見分光光度計(jì):上海尤尼科儀器有限公司;Mar-90恒溫磁力攪拌器:上海亞榮生化儀器廠;SPS401F萬分之一分析天平:賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;DL-5-B低速大容量離心機(jī):上海安亭儀器設(shè)備廠;ZDG-0.25真空冷凍干燥機(jī):煙臺(tái)冰輪股份有限公司;NicoletIR200傅里葉變換紅外光譜儀:賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;200PC差示掃描量熱儀:德國(guó)耐施儀器公司;JSM-7500F掃描電子顯微鏡:日本電子株式會(huì)社;Delta320 pH計(jì):瑞士梅特勒托利多公司;MCR102動(dòng)態(tài)流變儀:奧地利安東帕有限公司。
1.3.1 復(fù)凝聚相的制備
根據(jù)Chen等[10]的方法制備O-CMC,通過滴定法確定其取代度為0.35。稱取不同質(zhì)量比的GA和SAL,將其分別溶于去離子水中定容至100 mL,然后等體積混合攪拌均勻,制成不同濃度的GA-SAL溶液,置于4℃冰箱中保存待用。將一定濃度的O-CMC溶液與GA-SAL溶液混合,調(diào)節(jié)pH值,于特定溫度下反應(yīng)1h,4 000r/min離心20 min得到O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相。
1.3.2 復(fù)凝聚反應(yīng)的檢測(cè)
1.3.2.1 濁度
復(fù)凝聚反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液倒入1 cm的比色皿中,迅速在600 nm處測(cè)定吸光度,以去離子水作為對(duì)照。
1.3.2.2 復(fù)凝聚相產(chǎn)率
待復(fù)凝聚反應(yīng)完成后,4 000 r/min離心20 min,收集復(fù)凝聚相,于50℃下干燥至恒重,按下式計(jì)算復(fù)凝聚相產(chǎn)率。
1.3.3 復(fù)凝聚反應(yīng)條件的優(yōu)化
1.3.3.1 pH值對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
將1%的O-CMC溶液與5%的GA-SAL溶液(其中GA與SAL的質(zhì)量比為99∶1)等體積混合,使混合液的總固形物濃度達(dá)到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調(diào)節(jié)混合液的pH值至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 和 6.5,25 ℃下反應(yīng) 1 h,測(cè)定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。
1.3.3.2 溫度對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
將1%的O-CMC溶液與5%的GA-SAL溶液(其中GA與SAL的質(zhì)量比為99∶1)等體積混合,使混合液的總固形物濃度達(dá)到3%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調(diào)節(jié)混合液的pH值至3.0,分別置于4、25、35、45、55 ℃下反應(yīng) 1 h,測(cè)定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。
1.3.3.3 O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比對(duì)兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
將1%的O-CMC溶液分別與1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%的GA-SAL混合溶液(其中GA與SAL的質(zhì)量比為99∶1)等體積混合,此時(shí)O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比分別為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 和 1∶5。用 0.1 mol/L 的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.0,25℃下反應(yīng)1 h,測(cè)定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。
1.3.3.4 SAL含量對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
將一定量的SAL與GA分別溶于去離子水后混合使其總濃度達(dá)到4%,GA與SAL的質(zhì)量比分別為99∶1、74∶1、49∶1 和 24∶1。將上述 GA-SAL 溶液與 1%O-CMC溶液等體積混合,使混合液總固形物濃度達(dá)到2.5%。用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.0,25℃下反應(yīng)1 h,測(cè)定反應(yīng)體系的濁度和復(fù)凝聚相產(chǎn)率。
1.3.4 復(fù)凝聚相的表征
將1%的O-CMC溶液與4%的GA-SAL混合溶液(其中GA與SAL的質(zhì)量比為74∶1)等體積混合。采用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液分別調(diào)節(jié)混合液的pH值至 3.0、4.5、6.0,25℃下反應(yīng) 1 h,4 000 r/min 離心20 min,收集復(fù)凝聚相進(jìn)行表征。
1.3.4.1 DSC分析
對(duì) O-CMC、GA、SAL及 O-CMC/GA-SAL 復(fù)凝聚相凍干粉進(jìn)行DSC分析。取5 mg樣品,分別加入到DSC樣品盒中,以空白盒為參照,試樣在氮?dú)獗Wo(hù)下,以5℃/min的速率從30℃加熱到300℃,通過計(jì)算機(jī)記錄加熱過程中的差熱曲線。
1.3.4.2 SEM分析
對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相凍干樣品進(jìn)行SEM分析。掃描電鏡樣品制備方法:在樣品臺(tái)上貼一層雙面膠,分別將不同條件下的復(fù)凝聚相放置于樣品臺(tái)上,然后在樣品上噴金供SEM觀察,電壓為2kV。
1.3.4.3 流變學(xué)特性
對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。將樣品置于校正好的動(dòng)態(tài)流變儀平臺(tái)上,在(30±0.2)℃下,用錐板(1°)對(duì)樣品在黏彈性范圍內(nèi)進(jìn)行頻率掃描和觸變測(cè)試,板間距離d=0.1 mm。
每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Statistics 17.0.1)進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析,當(dāng)p<0.05時(shí)差異顯著。
2.1.1 pH值對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
pH值會(huì)影響聚電解質(zhì)之間的電荷平衡,是影響復(fù)凝聚反應(yīng)的一個(gè)重要因素。pH值對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響見圖1。
圖1 pH值對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of pH on the complex coacervation of O-CMC/GASAL
由圖1可知,pH值對(duì)O-CMC與GA-SAL之間的復(fù)凝聚反應(yīng)有重要影響。復(fù)凝聚相產(chǎn)率隨著pH值的增加呈先升高后降低的趨勢(shì),在pH值為3.0時(shí)達(dá)到最大值57.30%,說明在此pH值下O-CMC與GA-SAL的復(fù)凝聚反應(yīng)程度最大。這一結(jié)果及變化規(guī)律與OCMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)體系一致,即在pH3.0時(shí)兩者之間的復(fù)凝聚反應(yīng)最強(qiáng)[11],反應(yīng)體系中添加一定量的SAL對(duì)O-CMC/GA的最適復(fù)凝聚反應(yīng)pH值沒有影響。由圖1可知,反應(yīng)體系的濁度在pH5.0達(dá)到最大值,但在pH3.0較小,這與復(fù)凝聚相產(chǎn)率的結(jié)果不一致。這可能是由于在pH3.0時(shí)復(fù)凝聚反應(yīng)非常充分,所形成的復(fù)凝聚相聚焦程度高、粒徑大,導(dǎo)致它們?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)并沉淀,從而使測(cè)得的上清濁度偏低。另外,從圖1還可以看出,O-CMC、GA及SAL在試驗(yàn)所選擇的濃度下于600 nm下均無光吸收,因此在隨后的研究中均不再測(cè)定這3種聚電解質(zhì)的吸光度。
2.1.2 溫度對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
除了靜電吸引之外,聚電解質(zhì)之間的氫鍵和疏水性相互作用在復(fù)凝聚相的形成中也起著重要作用。高溫有利于疏水性相互作用,而低溫則可以促進(jìn)氫鍵相互作用[12]。溫度對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響見圖2。
圖2 溫度對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of temperature on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL
由圖2可知,溫度對(duì)O-CMC/GA-SAL之間的復(fù)凝聚反應(yīng)有重要影響,4℃下復(fù)凝聚相的產(chǎn)率最高,為63.2%;此后隨著反應(yīng)溫度的升高,復(fù)凝聚相產(chǎn)率隨之下降。反應(yīng)體系的濁度則在25℃時(shí)最高,此后隨著反應(yīng)溫度的降低或升高均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。結(jié)果表明低溫有利于O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的發(fā)生,說明氫鍵可能在復(fù)凝聚相的形成中起到了重要作用。由于25℃時(shí)產(chǎn)率僅比4℃下低5.8%,且25℃下進(jìn)行復(fù)凝聚反應(yīng)簡(jiǎn)單易行,因此選擇25℃為復(fù)凝聚反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)研究。
2.1.3 O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比對(duì)兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
聚電解質(zhì)之間的配比對(duì)于溶液中的靜電平衡有重要影響,因此就pH3.0下O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比對(duì)兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響進(jìn)行研究,結(jié)果見圖3。
圖3 O-CMC/GA-SAL質(zhì)量比對(duì)兩者復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of biopolymer ratio on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL
由圖3可知,O-CMC/GA-SAL質(zhì)量比對(duì)兩者的復(fù)凝聚反應(yīng)有重要影響,過大或過小均不利于復(fù)凝聚反應(yīng)的發(fā)生。隨著兩者混合比例的增加,復(fù)凝聚相產(chǎn)率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì),當(dāng)兩者質(zhì)量比為1∶4時(shí)復(fù)凝聚產(chǎn)率最大,達(dá)到了71.8%;而反應(yīng)體系的濁度在兩者質(zhì)量比為1∶2時(shí)達(dá)到最大,在1∶4時(shí)較小,其原因可能為當(dāng)O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比為1∶3和1∶4時(shí),反應(yīng)體系復(fù)凝聚相的聚集程度最大,迅速形成沉淀,導(dǎo)致測(cè)定的濁度降低;當(dāng)兩者的混合比例隨之增加或降低時(shí),由于復(fù)凝聚相聚集程度降低,大部分復(fù)合物呈懸浮狀態(tài),雖然復(fù)凝聚相的產(chǎn)率有所降低,但是測(cè)得的濁度仍然較高。當(dāng)兩者的質(zhì)量比為1∶1時(shí),由于復(fù)凝聚相產(chǎn)率過低,兩者的相互作用程度較弱,形成的復(fù)凝聚相較少,導(dǎo)致濁度最低。因此選擇O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比為1∶4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
2.1.4 SAL含量對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響
GA-SAL復(fù)合物中SAL含量對(duì)復(fù)凝聚反應(yīng)的影響見圖4。
圖4 SAL含量對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of SAL content on the complex coacervation of O-CMC/GA-SAL
由圖4可知,隨著GA-SAL復(fù)合物中SAL所占比例的降低,復(fù)凝聚相產(chǎn)率呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)且在質(zhì)量比為74∶1時(shí)達(dá)到最大;當(dāng)質(zhì)量比為99∶1時(shí)復(fù)凝聚相產(chǎn)率不再顯著變化。這是由于復(fù)凝聚反應(yīng)的最適pH值為3.0,該pH值低于SAL中古羅糖醛酸和甘露糖醛酸的解離常數(shù)(3.20和3.38)[13],因此SAL攜帶的負(fù)電荷含量較少甚至不帶電荷而無法參與復(fù)凝聚反應(yīng),導(dǎo)致復(fù)凝聚相產(chǎn)率隨著SAL含量的增加而降低。添加不同量SAL時(shí)所得復(fù)凝聚相的濁度無顯著性差異。當(dāng)GA與SAL復(fù)合物的質(zhì)量為99∶1時(shí),復(fù)凝聚相產(chǎn)率最高為70.4%??紤]到GA與SAL質(zhì)量比為99∶1和74∶1時(shí)復(fù)凝聚相產(chǎn)率的差異不顯著,采用質(zhì)量比74∶1進(jìn)行后續(xù)研究。
2.2.1 DSC分析
O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的DSC分析結(jié)果如圖5所示。
圖5 不同pH值下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的DSC圖譜Fig.5 DSC patterns of O-CMC/GA-SAL complex coacervates separated in different pH
由圖5可知,所有的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相均出現(xiàn)了兩個(gè)吸熱峰和一個(gè)放熱峰。第一個(gè)吸熱峰可歸因于水分的蒸發(fā),第二個(gè)吸熱峰是由于破壞基團(tuán)之間的靜電相互作用和復(fù)凝聚相的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)需要吸收能量引起的[14-15],而放熱峰是由于O-CMC分解所致[16]。
O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相峰值溫度見表1。
表1 O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相峰值溫度Table 1 Peak temperatures of O-CMC/GA-SAL coacervats in DSC thermogram
由表1可知,O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相第一吸熱峰溫度隨著pH值增大而降低,這可能是由于復(fù)凝聚相在制備過程中,隨著pH值的升高,羧基和水分子的氫鍵作用力隨之降低,使得第一吸熱峰溫度隨著pH值增加而降低。O-CMC、GA、SAL均沒有出現(xiàn)第二吸熱峰,但是三者發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)后在220℃左右均出現(xiàn)了吸熱峰,該吸熱峰是由于靜電相互作用被破壞所致,因此DSC分析證實(shí)了三者之間發(fā)生了復(fù)凝聚反應(yīng)。pH6.0時(shí)所得復(fù)凝聚相的放熱峰溫度(276.96℃)明顯高于其它兩個(gè)pH值,說明O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的熱穩(wěn)定性隨著pH值的增加而提高。
2.2.2 SEM分析
當(dāng)SAL含量占聚陰離子總量的1/75時(shí),在pH3.0、4.5、6.0條件下制備所得O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的微觀結(jié)構(gòu)分別如圖6所示。
圖6 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的掃描電鏡圖Fig.6 SEM micrographs of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0,pH4.5 and pH6.0
由圖6可知,在3個(gè)pH值下制備的O-CMC/GASAL復(fù)凝聚相均具有明顯的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),且隨著復(fù)凝聚反應(yīng)pH值的上升,O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密度有所增加,且孔穴的孔徑逐漸減小。通過與未添加SAL的O-CMC/GA復(fù)凝聚相相比[17],添加SAL后復(fù)凝聚相的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加規(guī)則,孔徑分布更加均勻,說明此時(shí)的復(fù)凝聚相更適合用于敏感成分的包埋。
2.2.3 流變學(xué)特性
2.2.3.1 O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的觸變特性
O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的觸變特性見圖7。
圖7 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的觸變特性Fig.7 Thixotropic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates prepared at pH3.0,pH4.5 and pH6.0
由圖7可知,在不同pH值條件下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相均為假塑性流體[18],即隨著剪切速率的增加,黏度迅速降低,說明復(fù)凝聚相具有剪切變稀特性;當(dāng)剪切應(yīng)力撤銷時(shí),復(fù)凝聚相的結(jié)構(gòu)重新排列,下行線始終低于上行線,黏度僅部分恢復(fù)[19]。說明復(fù)凝聚相在受到外力時(shí),復(fù)凝聚相的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重新排列,形成了新結(jié)構(gòu),并且新結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性低于之前的結(jié)構(gòu)。
反應(yīng)pH值對(duì)復(fù)凝聚相的觸變特性具有一定影響。pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的起始黏度明顯大于pH3.0下制備的復(fù)凝聚相,這可能是由于O-CMC和GA之間的復(fù)凝聚反應(yīng)逐漸增強(qiáng)所致。當(dāng)pH4.5及pH6.0條件下所得的復(fù)凝聚相的黏度在剪切力逐漸降低時(shí)均極低,在剪切力的作用下其結(jié)構(gòu)被破壞,當(dāng)外力撤銷時(shí)無法恢復(fù)到初始黏度。
2.2.3.2 O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的黏彈性
在不同pH值下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的黏彈特性見圖8。
圖8 在pH3.0、pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的黏彈特性Fig.8 Viscoelastic properties of O-CMC/GA-SAL coacervates separated in pH3.0,pH4.5 and pH6.0
由圖8可知,O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相在剪切頻率逐漸增加的過程中儲(chǔ)能模量始終大于損失模量,表現(xiàn)出類似固體彈性行為[20]。不同pH值下形成的復(fù)凝聚相黏彈性有所差異。在剪切頻率增加過程中,在pH4.5和pH6.0下制備的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的儲(chǔ)能模量和損失模量明顯大于pH3.0下制備的復(fù)凝聚相。這表明可以通過調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值來獲得具有特定黏彈性的O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相。
通過探討SAL對(duì)O-CMC/GA復(fù)凝聚反應(yīng)及復(fù)凝聚相性質(zhì)的影響,以確定添加SAL對(duì)復(fù)凝聚相功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明,與O-CMC/GA體系相比,添加SAL對(duì)其最適反應(yīng)條件無顯著影響,即最適反應(yīng)條件為pH3.0、O-CMC與GA-SAL質(zhì)量比1∶4、反應(yīng)溫度25℃、反應(yīng)時(shí)間1 h。SAL的含量對(duì)O-CMC/GA-SAL復(fù)凝聚相的微觀結(jié)構(gòu)有一定影響,隨著SAL含量的增加,復(fù)凝聚相的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密;含SAL的O-CMC/GA復(fù)凝聚相均為假塑性流體,且主要表現(xiàn)出固體彈性性質(zhì),這對(duì)于開發(fā)多糖/多糖復(fù)凝聚體系新功能具有重要意義。