陸 丹，周雪婷，陳雨婷，魏 望，曹宇杰，薛 魁

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬邳州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇邳州 221300

感染性疾病是臨床常見疾病之一，嚴(yán)重危害人類健康。對(duì)于重癥感染患者，若病情未能得到及時(shí)控制，可導(dǎo)致多器官功能障礙、感染性休克甚至死亡，而早期應(yīng)用敏感抗菌藥物治療是控制病情的關(guān)鍵舉措[1]。除了規(guī)范抗菌藥物使用之外，病原菌的快速、有效鑒定顯得尤為重要，對(duì)患者的生存率和病死率有著重要影響[2]。目前，微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)臨床可疑感染標(biāo)本的病原菌檢測(cè)多基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、分離培養(yǎng)及生化反應(yīng)，操作煩瑣且周期較長(zhǎng)；基于分子的生物學(xué)技術(shù)不需要微生物的培養(yǎng)生長(zhǎng)，比傳統(tǒng)方法更具優(yōu)勢(shì)，但由于該技術(shù)對(duì)人員要求較高，且成本較高，難以在各種類型的實(shí)驗(yàn)室開展，大規(guī)模應(yīng)用可能受到限制[2]。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)，以其快速、高通量、高效率、低成本的特點(diǎn)，徹底改變了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的微生物鑒定方法，使臨床微生物學(xué)的鑒定發(fā)生了革命性變化[3]。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)為當(dāng)今市場(chǎng)諸多MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析系統(tǒng)之一，由鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)，因此，本研究旨在通過對(duì)本院臨床分離菌株進(jìn)行鑒定，以評(píng)價(jià)Autof MS 1000 質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)在微生物實(shí)驗(yàn)室的鑒定能力，為其能否在各實(shí)驗(yàn)室開展提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2020年9月至2021年5月分離自臨床的常見非重復(fù)菌株共190株。其中革蘭陽性需氧菌58株，革蘭陰性需氧菌93株，厭氧菌6株，酵母樣真菌33株。

1.2儀器與試劑 Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)及配套試劑購自鄭州安圖生物有限公司；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套鑒定卡購自法國生物梅里埃有限公司。

1.3質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌 ATCC 29213、腸球菌ATCC 29212、白色假絲酵母菌ATCC 14053均由鄭州安圖生物有限公司提供。

1.4方法

1.4.1VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定 對(duì)分離培養(yǎng)得到的純菌落進(jìn)行涂片及革蘭染色，根據(jù)菌落形態(tài)和染色結(jié)果選擇相應(yīng)的配套鑒定卡上機(jī)檢測(cè)，嚴(yán)格按照說明書規(guī)范操作?？尚哦?90% 的唯一鑒定結(jié)果為可接受結(jié)果。

1.4.2Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定 對(duì)分離培養(yǎng)得到的純菌落使用直涂法或甲酸涂布法上機(jī)檢測(cè)，嚴(yán)格按照說明書規(guī)范操作。質(zhì)譜鑒定結(jié)果以分?jǐn)?shù)表示，分?jǐn)?shù)為0.0～10.0分。得分區(qū)間為9.5～10.0分表示該結(jié)果種水平可信；得分區(qū)間為9.0～<9.5分表示該結(jié)果屬水平可信，種水平參考；得分區(qū)間為6.0～<9.0分表示該結(jié)果屬水平參考，需結(jié)合其他鑒定方法驗(yàn)證；得分區(qū)間為0.0～<6.0分表示該結(jié)果不可信。本研究Autof MS1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果可信水平>9.0分為可接受結(jié)果。

1.4.3鑒定結(jié)果分析 以實(shí)驗(yàn)室已有的VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果為參比結(jié)果，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)和VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致的菌株、Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)或VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)未鑒定出或鑒定結(jié)果不可信的菌株首先應(yīng)用上述兩種方法重復(fù)鑒定，結(jié)果仍不可接受的送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA測(cè)序或真菌ITS區(qū)測(cè)序，以測(cè)序結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株分布及鑒定結(jié)果 本研究共納入190株菌株，分別分離自痰液、血液、尿液、腦脊液、胸腔積液、腹水、傷口分泌物、膿液等標(biāo)本，覆蓋本院80%～90%常見病原菌。其中革蘭陽性需氧菌58株，包括葡萄球菌屬30株，鏈球菌屬15株，腸球菌屬7株，棒桿菌屬3株，諾卡菌屬2株，芽孢桿菌屬1株；革蘭陰性需氧菌93株，包括腸桿菌科細(xì)菌50株，非發(fā)酵菌及其他少見革蘭陰性需氧菌43株；厭氧菌6株；酵母樣真菌33株。在190株分離株中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)可將180株(94.7%)鑒定至種，分?jǐn)?shù)均>9.0分；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)可將179株(94.2%)鑒定至種，可信度均>90%。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)與VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)相比，在種水平上一致的有166株(87.4%)，在屬水平上一致的有20株(10.5%)，完全不一致或未鑒定出結(jié)果的有4株(2.1%)。其中58株革蘭陽性需氧菌中，種水平鑒定一致的有51株(87.9%)，屬水平鑒定一致的有5株(8.6%)，2株VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)未鑒定出(3.4%)；93株革蘭陰性需氧菌中，種水平鑒定一致的有80株(86.0%)，屬水平鑒定一致的有12株(12.9%)，1株Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)與VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)均未鑒定出(1.1%)；6株厭氧菌中，種水平鑒定一致的有4株(66.7%)，屬水平鑒定一致的有2株(33.3%)；33株酵母樣真菌中，種水平鑒定一致的有31株(93.9%)，屬水平鑒定一致的有1株(3.0%)，1株VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)未鑒定出(3.0%)。

2.2結(jié)果不一致分析 本次分析的190株菌株中，共有24株(12.6%)鑒定結(jié)果在種水平上不一致。其中20株(10.5%)在屬水平上一致，3株(1.6%)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)未鑒定出，1株(0.5%)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)均未鑒定出。見表1。以測(cè)序結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)的準(zhǔn)確率為70.8%(17/24)，VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的準(zhǔn)確率為45.8%(11/24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩種系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致或無鑒定結(jié)果的比較分析

續(xù)表1 兩種系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致或無鑒定結(jié)果的比較分析

2.3鑒定總準(zhǔn)確率分析 190株菌株中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定總準(zhǔn)確率[93.2%(177/190)]略高于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定總準(zhǔn)確率[90.0%(171/190)]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)革蘭陽性需氧菌鑒定準(zhǔn)確率為94.8%(55/58)，略高于革蘭陰性需氧菌鑒定準(zhǔn)確率(89.2%，83/93)；厭氧菌鑒定準(zhǔn)確率為100.0%(6/6)；酵母樣真菌鑒定準(zhǔn)確率為100.0%(33/33)。見表2。

表2 兩個(gè)系統(tǒng)對(duì)臨床分離病原菌鑒定準(zhǔn)確率的比較分析[%(n/n)]

3 討 論

目前臨床病原菌的鑒定主要依靠傳統(tǒng)的表型鑒定及分子生物學(xué)鑒定。傳統(tǒng)的表型鑒定包括細(xì)菌的分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)及生理生化反應(yīng)等，操作煩瑣，周期較長(zhǎng)且靈敏度及特異度低。此外，有些細(xì)菌較難培養(yǎng)，容易造成病原菌的漏檢或誤檢，影響臨床治療。近年來，分子生物學(xué)的快速發(fā)展極大縮短了鑒定周期，其快速、特異度高、靈敏度高及準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢(shì)為臨床感染性疾病的診治提供新的思路。分子生物學(xué)鑒定包括基于核酸水平的檢測(cè)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、基因芯片、DNA測(cè)序等，以及蛋白水平的檢測(cè)，如MALDI-TOF MS技術(shù)[5-6]。MALDI-TOF MS技術(shù)能通過鑒別微生物不同質(zhì)量蛋白獲得蛋白指紋圖譜，通過與數(shù)據(jù)庫信息比對(duì)，篩選并確定相應(yīng)圖譜，進(jìn)而得到鑒定結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)菌種、屬的鑒定，快速、準(zhǔn)確且成本低，被認(rèn)為是基因測(cè)序的可替代方法[7]。

目前法國生物梅里埃等多家公司的質(zhì)譜系統(tǒng)已常規(guī)用于實(shí)驗(yàn)室病原菌的檢測(cè)。近年來，國產(chǎn)Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)在臨床工作中的優(yōu)勢(shì)也逐漸顯現(xiàn)出來，本研究旨在通過對(duì)本院常見臨床病原菌的鑒定來評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的鑒定能力。

本研究結(jié)果顯示，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定總準(zhǔn)確率略高于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定總準(zhǔn)確率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)革蘭陽性需氧菌鑒定準(zhǔn)確率略高于革蘭陰性需氧菌鑒定準(zhǔn)確率；24株種水平不一致或未鑒定出結(jié)果的菌株中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確率為70.8%，高于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定的準(zhǔn)確率(45.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

58株革蘭陽性需氧菌中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確率略高于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)葡萄球菌屬、腸球菌屬的鑒定準(zhǔn)確率為100.0%，對(duì)肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌及口腔鏈球菌的鑒定能力相對(duì)較差，但因標(biāo)本量少，更多研究將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)驗(yàn)證。之前相關(guān)研究表明，鏈球菌屬鑒定準(zhǔn)確率低的原因可能是細(xì)菌之間親緣關(guān)系較近、同源性較高進(jìn)而導(dǎo)致蛋白峰差異不明顯的緣故[8]。因此在臨床工作中，應(yīng)結(jié)合其他輔助方法如奧普托欣敏感試驗(yàn)做出正確判斷。2株諾卡菌屬VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)均未鑒定出結(jié)果，而Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)則100.0%鑒定，說明Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)一些臨床罕見菌的準(zhǔn)確鑒定優(yōu)勢(shì)明顯。

93株革蘭陰性需氧菌中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確率略高于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)陰溝腸桿菌復(fù)合群及鮑曼不動(dòng)桿菌不能正確鑒定至種，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)將陰溝腸桿菌鑒定為陰溝/阿氏腸桿菌和霍氏腸桿菌，將鮑曼不動(dòng)桿菌鑒定為醋酸鈣不動(dòng)桿菌和醫(yī)院不動(dòng)桿菌。分析原因可能為細(xì)菌親緣關(guān)系近，蛋白高度相似，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)不能準(zhǔn)確區(qū)分至種或亞種，必要時(shí)需輔以其他試驗(yàn)確認(rèn)，如通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增dnaJ基因可將陰溝腸桿菌復(fù)合群鑒定至種[9]。對(duì)于1株沙門菌，VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)均只能鑒定至屬，需輔以血清凝集試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定至種或亞種。以上均是導(dǎo)致革蘭陰性需氧菌的鑒定準(zhǔn)確率低于革蘭陽性需氧菌的原因。對(duì)于其他腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵菌及臨床少見革蘭陰性桿菌，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)均能正確鑒定。特別是本次鑒定的馬耳他布魯菌，作為一種潛在的生物恐怖病原菌，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室獲得性感染，對(duì)人具有極強(qiáng)的致病力，因此，早期鑒定對(duì)于生物安全防護(hù)、規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)和VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)均未鑒定出鹵代二氫鹽單胞菌，經(jīng)分析與數(shù)據(jù)庫不完整、Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)中不存在其標(biāo)準(zhǔn)圖譜有關(guān)，需要廠家及時(shí)擴(kuò)展更新。但值得注意的是，數(shù)據(jù)庫中已知典型微生物的數(shù)量只占全球多樣性的一小部分，因此在嚴(yán)格意義上現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫永遠(yuǎn)不可能是完整的。在臨床微生物學(xué)中，雖然對(duì)與人體相關(guān)微生物的認(rèn)識(shí)已經(jīng)達(dá)到了很高的水平，但由于存在地區(qū)差異性及來源多樣性等問題，仍然需要不斷研究和完善[10]。

厭氧菌因其生長(zhǎng)緩慢、生長(zhǎng)條件苛刻等因而在臨床鑒定中相對(duì)困難。本研究中Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)將6株厭氧菌均正確鑒定至種，其準(zhǔn)確率明顯高于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，且顯著減少了標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間，優(yōu)勢(shì)明顯。由于納入菌株數(shù)量少不足以評(píng)價(jià)，需在后期實(shí)驗(yàn)中加大標(biāo)本量繼續(xù)予以評(píng)估。但已有研究表明，在鑒定已知138株脆弱擬桿菌的分析評(píng)價(jià)中，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)相比其他一些鑒定系統(tǒng)在種水平上有更高的準(zhǔn)確率[11]。

近期，有研究表明，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)其鑒定能力異常突出，鑒定準(zhǔn)確率明顯優(yōu)于VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)，尤其對(duì)于一些罕見的酵母樣真菌[12]。本研究結(jié)果顯示，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)33株酵母樣真菌的鑒定準(zhǔn)確率高于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確率，對(duì)于少見菌如平常假絲酵母菌、皮瘤毛孢子菌亦能正確鑒定，雖然納入菌株數(shù)量有限，仍需進(jìn)一步研究，但Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)酵母樣真菌的鑒定價(jià)值初步體現(xiàn)。

本研究顯示，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)與VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的鑒定結(jié)果較為一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)鑒定時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、成本較低，特別對(duì)臨床罕見菌鑒定效果尤為突出，明顯優(yōu)于VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，這與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道結(jié)果一致。同時(shí)，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)具有中國本土化的菌株蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，更適合中國用戶，適合在國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

MALDI-TOF MS技術(shù)是近年來迅速興起的新型微生物鑒定技術(shù)，及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒定病原菌能夠減少周轉(zhuǎn)時(shí)間、快速提供細(xì)菌學(xué)診斷，早期合理地進(jìn)行干預(yù)治療，有利于減少細(xì)菌耐藥、控制病情、改善預(yù)后[15-16]。對(duì)于一些致病性強(qiáng)的病原菌，MALDI-TOF MS技術(shù)能夠在不到1 h之內(nèi)知曉結(jié)果，對(duì)于生物安全防范至關(guān)重要。盡管MALDI-TOF MS技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，但因?yàn)榧夹g(shù)的局限性，仍存在不足之處。首先，質(zhì)譜技術(shù)對(duì)檢測(cè)藥物敏感性試驗(yàn)的方法尚未應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)[17]，鑒定結(jié)果上報(bào)臨床后，需根據(jù)當(dāng)?shù)氐募?xì)菌耐藥數(shù)據(jù)初步選擇抗菌藥物，最后藥敏結(jié)果仍依賴傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)。但鑒于其較高的種屬符合率，可作為初級(jí)報(bào)告上報(bào)臨床，滿足臨床早期診斷的需求[18]。其次，細(xì)菌的正確鑒定很大程度上取決于數(shù)據(jù)庫的完整性，需要不斷地?cái)U(kuò)展和更新。此外，質(zhì)譜技術(shù)目前只能鑒定單一菌落，關(guān)于混合感染情況下的質(zhì)譜鑒定有待進(jìn)一步研究。最后，一些鑒定前因素也影響質(zhì)譜鑒定結(jié)果，如培養(yǎng)基成分、多次傳代培養(yǎng)、培養(yǎng)溫度、黏液型菌落、涂布菌量的多少等[8]。因此，規(guī)范操作、排除客觀因素的影響對(duì)于病原菌的正確鑒定至關(guān)重要。

總之，MALDI-TOF MS技術(shù)是現(xiàn)代微生物學(xué)上的巨大變革，Autof MS 1000質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)作為國產(chǎn)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足臨床對(duì)微生物鑒定的需求，建議在實(shí)驗(yàn)室推廣使用。但由于本研究室質(zhì)譜技術(shù)開展時(shí)間相對(duì)較短，故而納入研究菌株數(shù)量有限，后期將加大標(biāo)本量繼續(xù)驗(yàn)證?？紤]到每種方法都有其局限性，因此，多種檢測(cè)方法的聯(lián)合應(yīng)用可為臨床快速、可靠的診斷提供依據(jù)。