李嬌,圣聰,李濤,喻晗晞,李絢,趙弘巍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/生物互作與作物健康重點實驗室,江蘇 南京 210095)

由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是威脅水稻生產(chǎn)的最嚴(yán)重的病害之一[1]。濫用和不規(guī)范施用化學(xué)藥劑對稻瘟病進行防治,嚴(yán)重影響環(huán)境和糧食安全。培育具有持久抗性的水稻新品種成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。除了傳統(tǒng)的育種手段,通過分子生物技術(shù)重組水稻抗病遺傳資源具有極大的發(fā)展前景。近年來,越來越多的科學(xué)家從植物與病原菌的互作方面著手,試圖從分子水平對稻瘟病的抗病機制進行解析,通過基因表達和沉默技術(shù)等手段研究水稻抗病機制。

乙醇酸氧化酶(GLO)是光呼吸中的關(guān)鍵酶,催化乙醇酸氧化成乙醛酸,產(chǎn)生等物質(zhì)的量的過氧化氫(H2O2)[2]。細胞內(nèi)H2O2是重要的活性氧(ROS)組分,還是氧化還原信號的主要傳遞物,在各種生物過程中起著重要作用[3-5]。作為植物中的信號分子,活性氧在植物抗病免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6-8]。過氧化物酶體中的H2O2主要由乙醇酸氧化酶(GLO)催化的乙醇酸氧化反應(yīng)貢獻[2]。因此,GLO的生理功能通常被認為與H2O2信號傳導(dǎo)有關(guān)[9-10]。GLO在植物應(yīng)對非生物脅迫中能發(fā)揮一定作用,如高溫、強光、干旱等[11-14]。此外,GLO還涉及植物對病原生物的抗性,如煙草、擬南芥中GLO基因的沉默會導(dǎo)致其抗病性減弱[13,15-17],但是水稻GLO是否在抗稻瘟病中起作用還未見報道。

水稻基因組編碼4個GLO基因,分別是OsGLO1(Os03g0786100)、OsGLO3(Os04g0623500)、OsGLO4(Os07g0152900)和OsGLO5(Os07g0616500)。Zhang等[18]報道OsGLO1和OsGLO4主要在水稻葉片中表達,而OsGLO3和OsGLO5主要在根中表達。GLO1和GLO4是水稻中GLO活性的主要貢獻者,并且它們的表達緊密協(xié)調(diào)。本課題組前期通過研究水稻原生質(zhì)體過表達和沉默試驗,發(fā)現(xiàn)OsGLO1可以激活水稻的早期防衛(wèi)反應(yīng),并調(diào)控水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)的相關(guān)防衛(wèi)基因的表達水平[19]。

植物激素涉及植物生長發(fā)育的各個方面,并且植物可以通過調(diào)控激素信號傳導(dǎo)途徑來應(yīng)對生物和非生物脅迫[20-22]。特別是在應(yīng)對病原菌侵入時,植物激素發(fā)揮重要作用。不同類型的病原體可能需要植物激活不同的信號傳導(dǎo)途徑,包括SA、JA和乙烯信號傳導(dǎo)等。其中,SA和JA是特征明確的“防御激素”[23]。SA和JA廣泛分布于植物類群中,在植物抗病免疫防御中都發(fā)揮重要作用[24-25]。本研究旨在探討OsGLO1在水稻對稻瘟病抗性調(diào)控過程中的作用機制,為培育抗稻瘟病的種質(zhì)資源提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以水稻(Oryzasativa)品種‘ZH11’(野生型)以及OsGLO1過表達(OsGLO1-OE)和基因沉默(cas9-glo1)的轉(zhuǎn)基因水稻為材料,在28 ℃恒溫箱催芽5 d,將已發(fā)芽的種子植入土壤中,在25 ℃、光/暗培養(yǎng)時間為12 h/12 h的溫室中生長4周。

1.2 水稻基因組提取

將0.5 g水稻葉片在液氮中研磨成粉末,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,加入500 μL CTAB提取液,搖勻,置于65 ℃水浴鍋中15 min,在室內(nèi)稍微冷卻后,加入500 μL苯酚、氯仿、異丙醇(體積比為25∶24∶1)混合液,渦旋振蕩20 s,靜置5 min,在室溫、12 000g離心10 min。吸取上清液于新的1.5 mL EP管中,加入等體積的異丙醇,上下顛倒混勻后,置于-20 ℃冰箱中沉淀3 h以上。將沉淀后的樣品4 ℃、12 000g離心 15 min。棄上清液,加入1 mL 75%乙醇溶液,渦旋振蕩20 s,4 ℃、12 000g離心5 min。重復(fù)此操作2次。棄上清液,放入超凈臺或者通風(fēng)櫥中吹15 min左右,沉淀變?yōu)橥该鳡顟B(tài)即可。最后加入適量的雙蒸水溶解DNA,測定濃度后保存于-70 ℃冰箱備用。

1.3 PCR擴增

PCR擴增反應(yīng)程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 15 s,55 ℃15 s,72 ℃ 30～60 s,34個循環(huán);72 ℃ 5 min。cas9-glo1的上游擴增引物為5′-TTTGGTATCGCCTTCATGTTTCAGAC-3′,下游擴增引物為5′-CCTCGTAACTGGG-TCGTTCATGCTCTT-3′。

1.4 病原菌培養(yǎng)和葉片接種

將稻瘟病菌株Guy11和GZ1(eGFP-tagged Zhong-1,該菌株在原始菌株Zhong-1中加入GFP標(biāo)簽)接種于稻稈培養(yǎng)基(SDC),于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。3 d后將在平板上生長的菌絲刮除,然后轉(zhuǎn)至室內(nèi)組織培養(yǎng)架上,黑光燈光照培養(yǎng)3 d,誘導(dǎo)孢子形成并收集孢子。在5葉期的水稻葉片表面用10 μL的移液器吸頭制造戳傷(傷口間距約為1.3 cm),然后根據(jù)Kong等[26]的方法將分生孢子濃度調(diào)整為5×105mL-1,加入明膠并使其最終濃度為4 g·L-1,混勻后在每個傷口部位滴加10 μL孢子懸浮液。于25 ℃恒溫箱遮光過夜后,置于25 ℃光照培養(yǎng)箱(光/暗時間為12 h/12 h)繼續(xù)培養(yǎng)。接種5 d后對病害進行拍照,并通過定量PCR比較MoPot2的DNA水平來測定真菌的增殖情況[27]。

1.5 活性氧檢測和顯微鏡分析

使用DAB染色觀察稻瘟病菌接種的葉片和葉鞘中H2O2的產(chǎn)生位置和積累量[28]。用Guy11孢子懸浮液(2×105mL-1)對5葉期水稻植株的葉片進行浸泡侵染(10 mL離心管中加入7～8 mL孢子懸浮液,每管放入3段6 cm左右的葉片),于25 ℃恒溫箱遮光過夜,再在25 ℃光照培養(yǎng)箱(光/暗時間為12 h/12 h)培養(yǎng),48 h后使用DAB染色液(pH3.0)對H2O2染色(染色時間大于8 h,于25 ℃培養(yǎng)室避光),然后倒棄DAB,加入漂洗液(乙醇、乙酸、甘油的體積比為3∶1∶1),90～95 ℃水浴15 min脫色,用雙蒸水清洗葉片后,制成玻片在顯微鏡下觀察,采用倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axio observe 3)捕獲圖像。

1.6 植物葉片中的H2O2含量測定

分別剪取Guy11侵染5 d的水稻葉片和未侵染的葉片,在液氮中充分研磨,加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下機械勻漿,10 000g離心10 min,取上清液待測。用南京建成生物工程研究所的H2O2試劑盒測定H2O2含量。

1.7 GZ1菌株的葉鞘侵染

通過葉鞘注射接種稻瘟病菌GZ1以觀察稻瘟病的侵染過程。參照文獻[28]的方法,將稻瘟病菌株GZ1的孢子懸浮液濃度調(diào)至1×105mL-1,用注射器(1 mL)將孢子懸浮液從分蘗期水稻上剝離葉鞘的一端注入,靜置于潤濕的濾紙上,于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)。48 h后切除葉鞘的表皮層,在倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axio observe 3)下觀察,并對病菌的侵染過程拍照和分析。每個品種的病菌侵染統(tǒng)計均超過100個分生孢子。

1.8 RNA 提取及熒光定量 PCR

收集不同處理條件下的3葉期葉片,在液氮保護下進行研磨,使用TRIzol試劑(Invitrogen)進行RNA提取。cDNA的合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)。使用熒光定量PCR方法檢測防衛(wèi)相關(guān)基因(OsEDS1、OsICS1、OsPAD4、OsPR1a、OsMYC2、OsPBZ1、OsCOL1b和Mopot2)的表達量。引物信息見表1。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理,用SPSS 22.0軟件進行差異顯著性檢驗,采用Duncan’s方法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsGLO1轉(zhuǎn)基因水稻的驗證

以ZH11和OsGLO1-OE的cDNA為模板,通過實時熒光定量PCR對OsGLO1的表達量進行檢測和分析。結(jié)果表明,OsGLO1-OE中OsGLO1的表達量比ZH11高7倍左右(圖1-A),說明OsGLO1基因過表達水稻構(gòu)建成功。分別提取ZH11和cas9-glo1水稻植株的DNA進行PCR擴增,再進行Sanger測序和序列比對分析。與ZH11相比,cas9-glo1的基因序列中插入了1個“T”堿基(圖1-B),說明OsGLO1基因沉默水稻構(gòu)建成功。熒光定量PCR和PCR擴增結(jié)果確定了轉(zhuǎn)基因植物的正確性,為下一步試驗奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖1 OsGLO1過表達和沉默構(gòu)建Fig.1 Construction of OsGLO1 over-expression and silencing rice A. OsGLO1在ZH11和OsGLO1-OE中的相對表達量;B. ZH11和cas9-glo1的序列比對分析,箭頭指示插入位點(n=3)。不同字母表示不同處理在0.05水平差異顯著。A. The relative expression level of OsGLO1 in ZH11 and OsGLO1-OE;B. Sequence alignment analysis of ZH11 and cas9-glo1,the arrow indicates the insertion site(n=3). Different letters above the bars indicate significant differences at the 0.05 level among treatment.

2.2 OsGLO1對水稻稻瘟病抗性的影響

使用稻瘟病菌株Guy11孢子懸浮液分別侵染ZH11、cas9-glo1和OsGLO1-OE植株的離體葉片。侵染 5 d 后觀察,發(fā)現(xiàn)ZH11水稻呈明顯發(fā)病癥狀,病斑呈梭型,中心呈深褐色,病斑上、下端呈枯黃色并向上、下端延伸。與ZH11相比,cas9-glo1的病斑面積明顯增大,中心的深褐色區(qū)域明顯大于野生型,上、下兩端的枯黃色延伸更為明顯;OsGLO1-OE的葉片病斑面積和中心深褐色區(qū)域以及向上、下兩端的延伸程度都明顯弱于野生型(圖2-A)。定量PCR測定結(jié)果顯示,在OsGLO1過表達水稻葉片中的真菌生物量顯著少于其在ZH11水稻中的生物量,而cas9-glo1葉片中的真菌生物量則顯著增多(圖2-B)。這些結(jié)果證實,OsGLO1過表達增強了水稻對稻瘟病的抗性,并抑制稻瘟病菌生長;而OsGLO1沉默抑制了水稻對稻瘟病的抗性,使真菌在葉片組織內(nèi)增殖更多。

圖2 OsGLO1對水稻稻瘟病抗性的影響Fig.2 Effects of OsGLO1 on rice resistance to the blast disease A. Guy11孢子懸浮液侵染離體水稻葉片5 d后的抗病性表型;B. 接種葉片的相對真菌生長量的定量分析。A. Guy11 spore suspension infects the detached rice leaves,disease symptom was recorded 5 days after infection;B. Quantitative analysis of the relative fungal growth on the inoculated leaves.

2.3 OsGLO1對稻瘟病菌生長的影響

使用GZ1菌株侵染水稻葉鞘,再在熒光倒置顯微鏡下觀察和分析稻瘟病菌對葉鞘細胞的侵染情況(圖3-A)。侵染48 h后,在ZH11、cas9-glo1和OsGLO1-OE水稻葉鞘中都可以觀察到GZ1侵染性菌絲,但GZ1的菌絲在OsGLO1-OE水稻葉鞘中的積累程度明顯弱于ZH11株,而在cas9-glo1水稻葉鞘中的積累程度明顯高于ZH11株。進一步統(tǒng)計結(jié)果表明,GZ1侵染48 h后,在ZH11葉鞘中約25%的稻瘟病菌絲擴展到第3個細胞及以上,約16%的菌絲開始侵入鄰近細胞,約48%已經(jīng)開始侵入第1個細胞,約10%稻瘟病菌僅僅形成附著胞。與ZH11相比,cas9-glo1中約66%的稻瘟病菌絲擴展到第3個細胞及以上,約21%的菌絲開始侵入鄰近細胞,約11%的菌絲開始進入第1個細胞,只有約5%稻瘟病菌停留在附著胞階段。在OsGLO1-OE 葉鞘中,約10%和8%的菌絲分別進入第3個和第2個細胞,侵染第1個細胞的比例高達67%,還有高達15%的僅僅形成了附著胞(圖3-B)。上述結(jié)果表明,與野生型比較,GZ1在cas9-glo1中的侵染情況明顯加重,而在OsGLO1-OE中的侵染明顯減弱,進一步證明OsGLO1正調(diào)控水稻對稻瘟病的抗病性。

圖3 OsGLO1對稻瘟病菌生長的影響Fig.3 Effects of OsGLO1 on Magnaporthe oryzae development A. 倒置熒光顯微鏡下稻瘟病菌株GZ1侵染葉鞘細胞后48 h的生長情況;B. 對GZ1接種葉鞘48 h后的侵染情況進行定量分析。每個品種的病菌侵染均超過100個分生孢子。A. Hyphae development of the rice blast strain GZ1 in leaf sheath cells under an inverted fluorescence microscope at 48 h;B. Quantitative analysis of the infestation of GZ1 leaf sheath 48 h after inoculation. The fungal infection rate was calculated by using more than 100 conidia.

2.4 OsGLO1對稻瘟病菌侵染后水稻H2O2積累的影響

用Guy11分別侵染水稻離體葉片和葉鞘后,再進行DAB染色,觀察稻瘟病菌誘導(dǎo)的活性氧積累情況。侵染48 h后觀察,發(fā)現(xiàn)ZH11葉片中附著胞周圍無活性氧積累。與ZH11相比,OsGLO1-OE葉片中附著胞周圍活性氧積累顯著增加,而在cas9-glo1中無顯著變化(圖4-A)。Guy11侵染后的ZH11葉鞘細胞中,菌絲周圍有少量活性氧積累。與ZH11相比,cas9-glo1葉鞘細胞中菌絲周圍的活性氧積累減少,而OsGLO1-OE中的活性氧顯著增加(圖4-B)。進一步對Guy11侵染后葉片的H2O2含量進行檢測,發(fā)現(xiàn)與ZH11相比,OsGLO1-OE 葉片中的H2O2含量顯著增加,而cas9-glo1的H2O2含量顯著降低。與對照(未侵染的水稻葉片)相比,ZH11和OsGLO1-OE的H2O2含量都顯著增加,而cas9-glo1中的H2O2含量無顯著變化(圖4-C)。這表明OsGLO1過表達植株能通過誘導(dǎo)早期防衛(wèi)信號ROS的積累來增強對稻瘟病的免疫反應(yīng)。

圖4 OsGLO1對稻瘟病菌侵染后的水稻H2O2積累的影響Fig.4 Effects of OsGLO1 on the reactive oxygen species accumulation in rice after M.oryzae infected A. 葉片浸泡侵染48 h后DAB染色結(jié)果(AP代表稻瘟病菌附著胞);B. 葉鞘注射侵染48 h后DAB染色結(jié)果(IH代表侵入型菌絲);C. 水稻葉片中H2O2含量的測定。A. DAB staining after 48 h of leaf immersion and infection(AP stands for appressorium of Magnaporthe oryzae);B. DAB staining after 48 h of leaf sheath infection(IH stands for invasive hyphae);C. Determination of H2O2 content in rice leaves.

2.5 OsGLO1對水稻防衛(wèi)相關(guān)基因表達的影響

從圖5可知:相較于ZH11,在OsGLO1-OE水稻株系中,SA信號途徑的防衛(wèi)基因OsPR1a、OsEDS1、OsPAD4和OsICS1的表達量顯著增加,尤其是OsPR1a的上調(diào)達4倍以上;而在cas9-glo1中,OsPAD4、OsICS1的表達量沒有顯著變化,OsPR1a和OsEDS1的表達量顯著下調(diào),分別約為ZH11的52%和6%。上述結(jié)果表明OsGLO1正向調(diào)控OsPR1a和OsEDS1的表達。與ZH11相比,OsGLO1-OE、cas9-glo1中JA信號通路的相關(guān)防衛(wèi)基因OsPBZ1表達水平顯著降低,OsCOL1b、OsMYC2的表達水平無明顯變化(圖5-B)。上述結(jié)果說明OsGLO1對稻瘟病抗性的調(diào)控作用可能與JA信號途徑無關(guān),主要是通過激活SA信號通路正調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性。

圖5 SA(A)和JA(B)信號途徑防衛(wèi)相關(guān)基因的表達Fig.5 Expression of SA(A)and JA(B)signal pathway defense-related genes

3 討論

本課題組前期研究結(jié)果表明,OsGLO1在水稻原生質(zhì)體中具有激活早期防衛(wèi)反應(yīng)、調(diào)控抗病基因表達等功能[19]。OsGLO1可能是親和型稻瘟病菌的攻擊對象,其表達在侵染早期就受到特異性抑制,顯示了其在稻瘟病抗性中的重要作用。GLO在番茄、煙草、甜瓜、擬南芥等植物的抗病反應(yīng)中都發(fā)揮作用[15-16,29],但是在水稻抗稻瘟病中作用報道甚少。通過使用OsGLO1過表達和基因沉默轉(zhuǎn)基因材料,本研究考察了OsGLO1的抗病表型和依賴的信號通路,結(jié)果表明OsGLO1是水稻抗稻瘟病的正向調(diào)控因子。水稻可以通過OsGLO1調(diào)控活性氧的積累和SA信號通路防衛(wèi)基因(如OsPR1a和OsEDS1)的表達水平,增強水稻對稻瘟病菌的抗性,抑制病菌生長和菌絲擴展。

光呼吸是某些植物細胞在高光照和高氧低二氧化碳情況下發(fā)生的一個生化過程,是在長期進化過程中為了適應(yīng)環(huán)境變化,提高抗逆性而形成的一條代謝途徑[30]。近期的研究表明,水稻光合作用中的光捕獲復(fù)合體Ⅱ(light-harvesting complex Ⅱ)可以通過磷酸化修飾開啟水稻對稻瘟病的抗性[31],建立光合作用與抗病性的聯(lián)系。本研究結(jié)果進一步顯示OsGLO1可以誘導(dǎo)PTI(病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的免疫反應(yīng))和ETI(效應(yīng)子誘導(dǎo)的免疫反應(yīng))的多個元件,將光呼吸與水稻對稻瘟病的抗性聯(lián)系起來。這些結(jié)果啟示,研究水稻基礎(chǔ)生理過程或能量代謝對于了解稻瘟病抗性機制具有重要意義,是今后育種和品種改良需要關(guān)注的生物過程。

SA信號途徑在水稻抵抗稻瘟病的過程中發(fā)揮重要作用。水稻的本底水平SA含量高于擬南芥等植物,SA是否在水稻抗病性中起作用存在爭議[32]。然而,在SA相關(guān)防衛(wèi)基因的表達量增高[33]、SA產(chǎn)生或代謝相關(guān)基因表達增加[34]、介導(dǎo)SA信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子過表達[35]等條件下,都伴隨著稻瘟病抗性的增加,表明SA對研究稻瘟病抗性具有重要價值。本研究中OsGLO1過表達植株通過提高SA信號途徑中的OsPR1a和OsEDS1等基因的表達水平而增強水稻抗稻瘟病的能力,但與JA信號通路基本無關(guān)。OsGLO1促進SA信號通路的機制還有待進一步探究。

致謝:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)彭新湘課題組提供了水稻材料,四川農(nóng)業(yè)大學(xué)王文明課題組提供了稻瘟病菌種(eGFP-tagged Zhong-1),謹致謝意。