劉雙，程東凱，于洪君，李寶山

權(quán)衡輔助生殖技術(shù)的好處和風(fēng)險(xiǎn)，在接受卵巢刺激IVF/胞質(zhì)內(nèi)精子注射（ICSI）的病人中，生下一個(gè)健康的孩子是最終目標(biāo)[1-2]。選擇性單胚胎移植（eSET）已被越來越多的人提倡[3-4]。玻璃化冷凍是一種成功的囊胚冷凍保存方法[5-6]。玻璃化前囊胚腔的人工收縮可提高玻璃化冷凍/復(fù)蘇囊胚的存活率[6]。隨著玻璃化和人工收縮的應(yīng)用，玻璃化冷凍/復(fù)蘇囊胚移植的活產(chǎn)率與新鮮囊胚移植的活產(chǎn)率相似。研究表明，單囊胚移植后的臨床妊娠和活產(chǎn)的發(fā)生率與雙囊胚移植相似，但高于單卵裂期胚胎移植[7]。此外，無論是新鮮周期單囊胚移植還是玻璃化冷凍/復(fù)蘇周期單囊胚，均可以降低多胎妊娠的發(fā)生，并且移植單個(gè)優(yōu)質(zhì)囊胚移植可以保證臨床妊娠率[8]。目前，常用的囊胚評分系統(tǒng)為Gardner評分系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，根據(jù)囊胚擴(kuò)張和孵化（EH）階段、內(nèi)細(xì)胞質(zhì)量（ICM）和滋養(yǎng)外胚層（TE）的形態(tài)學(xué)參數(shù)對囊胚進(jìn)行評級[9]。目前研究多側(cè)重于內(nèi)細(xì)胞質(zhì)量（ICM）和滋養(yǎng)外胚層（TE）形態(tài)對囊胚移植后的結(jié)局影響，而對于囊胚腔大小及孵化程度對臨床結(jié)局的影響研究較少[10-11]。本研究主要通過分析35歲以上女性單囊胚冷凍復(fù)蘇周期中囊胚腔大小及孵化程度對臨床結(jié)局的影響，以期為高齡女性囊胚移植提供一定的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2014年1月至2017年12月于沈陽東方醫(yī)療集團(tuán)菁華醫(yī)院進(jìn)行單囊胚冷凍復(fù)蘇移植周期共4 103個(gè)，根據(jù)囊胚腔大小和是否孵化將其分為4期囊胚共3 706個(gè)周期、5期囊胚共242個(gè)周期和6期囊胚共155個(gè)周期。隨后對年齡>35歲亞組單獨(dú)分析，分為4期囊胚共941個(gè)周期、5期囊胚共64個(gè)周期和6期囊胚共41個(gè)周期。所有囊胚均采用玻璃化冷凍和解凍方法。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法囊胚腔大小及孵化程度的評級：根據(jù)Gardner評分系統(tǒng)將囊胚分為6個(gè)時(shí)期。Ⅰ期：囊胚具有早期腔室，囊胚腔體積小于胚胎總體積的1/2；Ⅱ期：囊胚腔體積超過或等于胚胎總體積的1/2；Ⅲ期：囊胚腔占據(jù)了整個(gè)胚胎；Ⅳ期：囊胚腔擴(kuò)張，整個(gè)胚胎由囊胚腔占滿，胚胎擴(kuò)張，總體積變大，透明袋變??；Ⅴ期：囊胚正要孵出，有一部分囊胚從透明袋中孵出，但未完全脫離透明袋；Ⅵ期：完全孵出的囊胚，囊胚已經(jīng)完全脫離透明袋。

囊胚的玻璃化凍融和解凍：凍融：囊胚在Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS，Thermo，Carlsbad，CA，USA）+20%血清代用品（SSS；美國加州圣安娜爾灣科學(xué)公司）+20%乙二醇（Sigma，Saint Louis，MO，USA）放置45 s達(dá)到平衡。然后，將平衡后的囊胚移入由 40%EG，18%Ficoll（Sigma，Saint Louis，MO，USA）和0.3 M蔗糖（Sigma）溶解于DPBS補(bǔ)充20%SSS的玻璃化溶液中放置20 s。隨后將囊胚迅速裝入冷凍載桿，放入液氮中。

解凍：將載桿上的胚胎轉(zhuǎn)移到含0.5 M蔗糖（含20%SSS）的增溫液中3 min，然后轉(zhuǎn)移到含0.25 M蔗糖（含20%SSS）的增溫液中持續(xù)5 min。然后將胚胎在1029培養(yǎng)基中清洗3次，在倒置顯微鏡下觀察升溫1～2 h后胚胎解凍后的存活情況。

1.3 觀察指標(biāo)妊娠結(jié)局主要比較各組的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、多胎率和活產(chǎn)率。

出生結(jié)局主要比較新生兒男女比例、低出生體質(zhì)量率、出生缺陷發(fā)生率。

臨床妊娠：移植6～8周后陰道B超觀察到孕囊或流產(chǎn)物病理證實(shí)。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=妊娠周期流產(chǎn)的周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%?；町a(chǎn)率=活產(chǎn)分娩數(shù)/移植周期×100%。低出生體質(zhì)量率=出生體質(zhì)量在2 500 g以下數(shù)/活產(chǎn)分娩數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同囊胚腔大小及孵化程度對移植周期妊娠結(jié)局的比較三組移植妊娠結(jié)局各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同囊胚腔大小及孵化程度對移植妊娠結(jié)局的比較

2.2 不同囊胚腔大小及孵化程度對移植周期出生結(jié)局的比較三組移植后出生結(jié)局各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同囊胚腔大小及孵化程度對移植出生結(jié)局的比較

2.3 >35歲亞組不同囊胚腔大小及孵化程度對移植周期妊娠結(jié)局的比較>35歲亞組中，各期分組之間平均年齡無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。4期囊胚臨床妊娠率和活產(chǎn)率高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 >35歲亞組不同囊胚腔大小及孵化程度對移植周期妊娠結(jié)局的比較

2.4 >35歲亞組不同囊胚腔大小及孵化程度對移植周期出生結(jié)局的比較>35歲亞組中，4期囊胚的低出生體質(zhì)量率明顯低于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 >35歲亞組不同囊胚腔大小及孵化程度對移植出生結(jié)局的比較

3 討論

既往報(bào)道顯示囊胚腔擴(kuò)張對臨床結(jié)果有著重要的意義[7]。Goto等研究了1 488個(gè)單次冷凍囊胚轉(zhuǎn)移周期，發(fā)現(xiàn)囊胚等級（主要由擴(kuò)張等級決定）顯著影響妊娠結(jié)局，在相同的囊胚擴(kuò)張內(nèi)，內(nèi)細(xì)胞質(zhì)量和滋養(yǎng)外胚層均不影響妊娠結(jié)局[7]。Thompson和Ahlstrom等報(bào)道，在一個(gè)新鮮周期單個(gè)囊胚移植周期的多變量邏輯模型中，胚泡擴(kuò)張階段顯著并獨(dú)立地預(yù)測了活產(chǎn)率[8-9]。Ahlstrom等在對解凍后的形態(tài)特征與玻璃化冷凍/解凍的囊胚轉(zhuǎn)移周期后的活產(chǎn)之間的相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張程度是活產(chǎn)率的最佳預(yù)測指標(biāo)[9]。本文研究結(jié)果顯示，不分年齡段中，單囊胚冷凍復(fù)蘇周期中囊胚腔大小及孵化程度對臨床結(jié)局的影響差別不大，4期囊胚的臨床妊娠率略高于5期囊胚和6期囊胚，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，4期囊胚的活產(chǎn)率與5期囊胚和6期囊胚之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與既往的研究報(bào)道有不同，這可能與種族、生活環(huán)境、用藥方案等因素有關(guān)。

在我們的研究中，囊胚的冷凍時(shí)期均在4期以上，并且囊胚腔復(fù)蘇后膨脹的程度幾乎與玻璃化前的擴(kuò)張程度相同。本研究中所有囊胚冷凍前均給與了人工皺縮，玻璃化前的人工收縮提高了囊胚擴(kuò)張和孵化的存活率，降低了存活囊胚再擴(kuò)張的平均時(shí)間。之所以可能出現(xiàn)這種結(jié)果，是因?yàn)榫哂懈斓刂匦屡蛎浀呐吲菥哂懈斓匕l(fā)育動(dòng)力學(xué)，而Na+/K+-ATPase（泵）負(fù)責(zé)胚泡的重新膨脹[10]。囊胚的發(fā)育速度和囊胚腔的發(fā)育階段與囊胚植入的成功與否有關(guān)。先前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在玻璃化前沒有人工收縮的情況下，擴(kuò)張/孵化的囊胚的存活率和活產(chǎn)率低于早期囊胚[11]。然而，擴(kuò)大程度越大的囊胚，應(yīng)用人工囊胚腔收縮，存活率和妊娠率越高。囊胚腔的擴(kuò)張程度可能是重要的，因?yàn)榧?xì)胞分裂數(shù)量的增加導(dǎo)致小細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞連接質(zhì)量的增加，囊胚腔的增大。擴(kuò)張程度越高的囊胚細(xì)胞越小。由于囊胚表面體積比較大，細(xì)胞較小，這些囊胚更容易被冷凍保護(hù)劑滲透，從而免受滲透脅迫和損傷[12-17]。因此，擴(kuò)張程度越高的囊胚對玻璃化和低溫保護(hù)劑毒性的耐受性越好。在新鮮和玻璃化冷凍/復(fù)蘇中，囊胚腔由于液體的流入而擴(kuò)張，而滋養(yǎng)層細(xì)胞的緊密連接阻止了液體的泄漏。此外，擴(kuò)大的囊胚更可能有輪廓更好的細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示在35歲以上女性單囊胚冷凍復(fù)蘇周期中，4期囊胚移植后的臨床妊娠率和活產(chǎn)率高于5期和6期，并且子代低出生體質(zhì)量率也低于其他兩組。可能是因?yàn)樵谝浦策^程中，沒有透明帶的保護(hù)，孵化的胚胎在移植過程中很容易受到創(chuàng)傷。在移植過程中胚泡暴露的高壓可能會(huì)破壞滋養(yǎng)外胚層，導(dǎo)致囊胚腔液泄漏，而透明帶的存在則會(huì)保護(hù)囊胚，不被高壓破壞，因此4期囊胚活產(chǎn)率較高。本身高齡女性中由于卵子質(zhì)量下降等因素增加了子代低出生體質(zhì)量率的發(fā)生。此外高齡女性體內(nèi)應(yīng)激水平更高，缺少透明帶保護(hù)的胚胎耐受應(yīng)激的能力較差，胎兒發(fā)育遲緩，可能是造成4期囊胚子代低出生體質(zhì)量率較低的原因。

綜上所述，35歲以上女性單囊胚冷凍復(fù)蘇周期中，4期囊胚移植后的妊娠結(jié)局及出生結(jié)局更佳。在平常工作中，應(yīng)當(dāng)選擇在囊胚擴(kuò)張到4期的時(shí)候冷凍，以期在后續(xù)的移植中獲得更好的活產(chǎn)率。本文35歲以上病人比較時(shí)，5期、6期囊胚移植例數(shù)較少，后續(xù)應(yīng)積攢更多的樣本量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。