宋志茹，劉秀盈，朱晶晶，劉靜靜，馮婭茹，王建勛，2

1北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京102488；2深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院

血液系統(tǒng)惡性腫瘤主要包括淋巴瘤、白血病以及多發(fā)性骨髓瘤等，其中多發(fā)性骨髓瘤是一種克隆性漿細胞為特征的惡性腫瘤[1]，目前其主要治療藥物是免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白酶體抑制劑、單抗類藥物以和糖皮質(zhì)激素[2]。以硼替佐米為代表的蛋白酶體抑制劑及來那度胺為代表的免疫調(diào)節(jié)劑治療已經(jīng)取得較好的效果，但仍無法減少不良反應(yīng)及抑制腫瘤復(fù)發(fā)[3]。免疫治療是近年腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點，嵌合型抗原受體基因修飾的T細胞(CAR-T細胞)屬于細胞免疫治療[4]，是將特異性抗體與相對應(yīng)的抗原結(jié)合和T淋巴細胞對靶細胞的細胞毒活性同時發(fā)揮作用的一種方法[5]。將這種經(jīng)體外基因修飾后的T細胞回輸患者體內(nèi)，能夠識別特定腫瘤細胞，且不受主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的限制[6-7]。CD38抗原是一種跨膜糖蛋白，是漿細胞表面重要的標志物[8]。CD38廣泛表達在多發(fā)性骨髓瘤、B細胞非霍奇金淋巴瘤、復(fù)發(fā)性急性淋巴細胞白血病等各種類型的血液瘤細胞上，是CAR-T細胞免疫療法的一個合適的靶點[9]。但長期腫瘤抗原及其他免疫抑制信號刺激使得CD38 CAR-T細胞功能逐漸衰減，發(fā)生T淋巴細胞耗竭，不能有效殺傷腫瘤細胞[10]。胸腺細胞選擇相關(guān)高遷移率群體盒(TOX)蛋白是一個重要的DNA結(jié)合因子[11]，通過修飾局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)多蛋白復(fù)合物的生成進而調(diào)控轉(zhuǎn)錄，在T淋巴細胞發(fā)育和分化中具有重要調(diào)節(jié)作用[12]。研究表明，TOX高表達加速了血液腫瘤患者中T淋巴細胞的耗竭；反之，當TOX表達下降時，T淋巴細胞耗竭的情況可顯著改善。2020年1月—2021年10月，本研究采用shRNA技術(shù)敲低TOX在重組CD38 CAR-T細胞中的表達，觀察其在體外抑制血液腫瘤細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人多發(fā)性骨髓瘤熒光素酶標記細胞RPMI-Luc和逆病毒包裝細胞系PG13購自美國ATCC細胞庫，人Burkitt′s淋巴瘤熒光素酶標記細胞Raji-Luc購自北京維通達生物技術(shù)有限公司。AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及PBS緩沖液購自美國Gibco公司，淋巴細胞分離液購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Fu Gene HD購自美國Promega公司，白細胞介素2(IL-2)、CD3單克隆抗體OKT-3購自北京義翹神州科技股份有限公司，DH-5α感受態(tài)、MluⅠ酶、T4連接酶、NotⅠ酶、熒光素酶報告基因檢測試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒購自北京蘭博利德科技有限公司，RNA提取試劑盒購自上海優(yōu)寧維公司，干擾素γ(IFN-γ)ELISA試劑盒購自北京百諾威生物公司，CD38-APC、MYC-PE、CD3-APC、PD-1-PE、CD69-PE抗體購自美國BD公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，Heracell 240i)，高速離心機(Thermo，75006590)，實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher，QuantStudio TM6 Flex)。

1.2 原代T淋巴細胞的提取 采集3例健康志愿者(男2例、女1例,知情同意)外周血，加入淋巴細胞分離液分離單個核細胞(PBMC)，重懸于含10% FBS、1%青—鏈霉素溶液的AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基。加入終濃度為100 ng/mL的OKT-3和100 U/mL的IL-2刺激T淋巴細胞活化增殖。每隔48 h用含100 U/mL IL-2的AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.3 TOX基因shRNA聯(lián)合抗CD38 CAR分子的構(gòu)建 親和力較強的CD38 CAR由本實驗室前期通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得，采用二代CAR結(jié)構(gòu)。首先將抗原識別片段CD38 ScFv、CD8鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)CD28與胞內(nèi)區(qū)CD3ζ串聯(lián)，并在ScFv區(qū)前加入MYC標簽，便于后續(xù)檢測。然后通過GPP Web Portal網(wǎng)址設(shè)計靶向TOX的shRNA序列，另設(shè)計一條不針對任何靶點的無意義RNA序列作為對照。在這些設(shè)計好的RNA序列之前串聯(lián)U6啟動子序列，完成shRNA靶向抑制TOX的CD38 CAR分子的構(gòu)建。對照組插入添加無意義RNA序列的抗CD38 CAR，命名為CD38 CAR；實驗組CAR命名為TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR。以上CAR分子構(gòu)建完成后，酶切并連接逆病毒載體包裝質(zhì)粒pMFG，命名為pMFG-MYC-CD38 CAR、pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38 CAR和pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38 CAR。

1.4 CAR-T細胞的制備與分組 將pMFG-MYC-CD38-CAR、pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38-CAR和pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38-CAR質(zhì)粒載體進行逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝。經(jīng)逆病毒載體滴度檢測，CD38 CAR、TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)PG13細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為77.4%、78.6%和83.7%，逆病毒載體滴度均>1 107 copies/mL，表明逆病毒載體滴度達到轉(zhuǎn)導(dǎo)要求，可進行后續(xù)T淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗。提取分離原代T淋巴細胞后培養(yǎng)48 h，將其分為CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組，分別轉(zhuǎn)導(dǎo)CD38 CAR、TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR，獲得CD38 CAR-T細胞、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T細胞和TOX-shRNA2-CD38 CAR-T細胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后，用流式細胞術(shù)通過MYC-PE抗體染色檢測抗原表達，計算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率=MYC-PE陽性細胞數(shù)/總活細胞數(shù)×100%。以轉(zhuǎn)導(dǎo)效率達到40%以上為成功標準。

1.5 CAR-T細胞TOX mRNA相對表達量檢測 采用RT-QPCR法。轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后，三組各取5×106個活細胞，提取RNA，凝膠電泳驗證其完整性，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR green進行RT-QPCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算TOX mRNA相對表達量。

1.6 CAR-T細胞增殖能力觀察 轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后，加入染色劑，使用細胞計數(shù)儀讀取三組細胞密度，之后每48 h計數(shù)并繼續(xù)傳代培養(yǎng)，維持細胞密度為5×105/mL，計算單次生長倍數(shù)(即本次計數(shù)時細胞密度與上次計數(shù)時的細胞終密度的比值)。單次生長倍數(shù)的乘積即生長倍數(shù)，其中第0天(提取PBMC當天)單次生長倍數(shù)、生長倍數(shù)均定為1。記錄0～10 d體外培養(yǎng)生長倍數(shù)的對數(shù)值，繪制增殖曲線。

1.7 CAR-T細胞與血液腫瘤細胞共培養(yǎng)后活化情況觀察 采用流式細胞術(shù)。取Raji-Luc、RPMI-Luc細胞，加入CD38-APC避光染色60 min，PBS沖洗，重懸在PBS中，上流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示Raji-Luc、RPMI-Luc細胞表面CD38表達效率分別為95.21%±0.80%和96.34%±3.76%，表明本實驗采用的血液腫瘤細胞表面高表達CD38，可作為抗CD38 CAR-T細胞的靶細胞。取三組CAR-T細胞，分別與等量血液腫瘤細胞共培養(yǎng)48 h，400 g離心5 min，收集細胞。PBS沖洗，加入CD3-APC、CD69-PE避光染色60 min，PBS緩沖液沖洗1遍，重懸在PBS中，上流式細胞儀檢測，讀取CAR-T細胞與血液腫瘤細胞共培養(yǎng)后細胞表面CD69的表達效率，以此反映CAR-T細胞活化情況。

1.8 血液腫瘤細胞刺激下CAR-T細胞體外增殖能力觀察 采用CFSE染色法。取Raji-Luc、RPMI-Luc細胞，加入含IL-2的AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基，稀釋至細胞密度4×104/100 μL，按100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板。取三組CAR-T細胞，加入CFSE熒光染料，37 ℃避光孵育30 min。將細胞按1×104/孔加入預(yù)設(shè)孔中，最終效靶比設(shè)為1∶4。培養(yǎng)24 h后，用CD3-APC抗體染色標記T淋巴細胞以區(qū)分效應(yīng)細胞和靶細胞。通過流式細胞術(shù)對比CFSE熒光信號強弱來衡量細胞增殖情況，CFSE標記的是CAR-T細胞，當CAR-T細胞增殖時CFSE信號會遞減，故CFSE信號越弱表示細胞增殖能力越強。

1.9 CAR-T細胞對血液腫瘤細胞殺傷能力觀察 采用熒光素酶化學(xué)發(fā)光法。分別制備Raji-Luc、RPMI-Luc細胞懸液，參照1.8中鋪板方法進行實驗鋪板。將CAR-T細胞與Raji-Luc、RPMI-Luc靶細胞分別以1∶2、1∶4、1∶8的效靶比與CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組細胞共培養(yǎng)，只加入Raji-Luc細胞或RPMI-Luc細胞的孔標記為最大釋放孔，加入培養(yǎng)基的孔作為空白孔。共培養(yǎng)6 h后，每孔加入100 μL熒光素酶底物，室溫避光培養(yǎng)5 min。設(shè)置化學(xué)發(fā)光模式，全白酶標板，震板時間5 s，同步超快光子計數(shù)的低噪音光電倍增管(PMT)設(shè)為500。殺傷效率的計算公式為：殺傷效率=1-(實驗孔細胞凋亡率-空白孔細胞凋亡率)/(最大釋放孔細胞凋亡率-空白孔細胞凋亡率)×100%。

1.10 血液腫瘤細胞刺激下CAR-T細胞IFN-γ釋放水平檢測 采用ELISA法將三組CAR-T細胞與Raji-Luc、RPMI-Luc細胞分別共培養(yǎng)6 h(效靶比為1∶2)，400 g離心5 min，取上清，使用ELISA試劑盒檢測IFN-γ水平。

1.11 CAR-T細胞耗竭情況觀察 采用流式細胞術(shù)。取CAR-T細胞懸液，400 g離心5 min，棄上清，收集細胞。PBS沖洗，同時加入CD3-APC、PD-1-PE抗體避光孵育60 min。PBS洗滌，棄上清并重懸于PBS，上流式細胞儀檢測CAR-T細胞表面PD-1的表達，通過PD-1表達量衡量CAR-T細胞耗竭情況。

2 結(jié)果

2.1 三組CAR-T細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測結(jié)果 CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為41.51%、41.28%、44.84%，均超過40%，表明CAR分子在T淋巴細胞表面成功表達。

2.2 三組CAR-T細胞TOX mRNA表達水平比較 CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組TOX mRNA的相對表達量分別為1、0.84±0.14、0.68±0.70。TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組TOX mRNA表達水平低于CD38 CAR-T組(P<0.05)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組TOX mRNA表達水平與CD38 CAR-T組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組的TOX mRNA的相對表達量降低30%以上，表明其RNA干擾效果較好。

2.3 三組細胞增殖能力比較 CAR-T細胞在體外培養(yǎng)0～10 d的生長倍數(shù)對數(shù)值見表1，三組CAR-T細胞在體外均能穩(wěn)定增殖，三組CAR-T細胞生長倍數(shù)對數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 CAR-T細胞的體外增殖的生長倍數(shù)對數(shù)值

2.4 CAR-T細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后細胞表面CD69表達效率比較 與等量腫瘤細胞共培養(yǎng)后，三組細胞表面CD69表達效率均升高(P<0.01)，見表1。

表1 三組細胞在與腫瘤細胞共培養(yǎng)后表面CD69表達效率比較

2.5 CAR-T細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后增殖情況比較 與CAR-T單獨培養(yǎng)時相比，三組CAR-T細胞與Raji-Luc、RPMI-Luc細胞共培養(yǎng)后FITC信號左移，表明CAR-T細胞在腫瘤細胞的刺激下增殖加快，CAR-T細胞被腫瘤細胞激活。見圖2。

注：a為CAR-T與Raji-Luc共培養(yǎng)；b為CAR-T與RPMI-Luc共培養(yǎng)；c為CAR-T單獨培養(yǎng)。

2.6 三組細胞在不同效靶比時對腫瘤細胞的殺傷效率比較 三組細胞分別與Raji-Luc、RPMI-Luc細胞共培養(yǎng)后，在不同效靶比時，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組的殺傷效率均高于CD38 CAR-T組(P<0.05或<0.01)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2、表3。

2.7 三組細胞在血液腫瘤細胞刺激下IFN-γ釋放水平檢測 TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組IFN-γ釋放水平較CD38 CAR-T組升高(P<0.05)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表2 三組細胞在不同效靶比時對Raji-Luc細胞的殺傷效率比較

表3 三組細胞在不同效靶比時對RPMI-Luc細胞的殺傷效率比較

表4 三組細胞在Raji-Luc、RPMI-Luc細胞刺激下IFN-γ釋放水平比較

2.8 三組CAR-T細胞耗竭情況比較 CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組PD-1表達效率分別為32.55%±4.88%、26.45%±5.45%、16.50%±2.97%。與CD38 CAR-T組相比，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組PD-1表達無明顯變化(P>0.05)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組PD-1表達下降(P<0.05)。

3 討論

在過去的幾十年里，血液腫瘤常規(guī)治療以藥物治療為主，嚴重者需手術(shù)、放化療。但這些治療方法僅能抑制腫瘤細胞的生長，無法徹底殺死腫瘤細胞，因此多數(shù)血液腫瘤患者最終進展至復(fù)發(fā)難治階段甚至死亡。CAR-T細胞療法的原理是通過基因工程技術(shù)將抗原分子的抗體可變區(qū)基因序列與淋巴細胞免疫受體的胞內(nèi)區(qū)序列融合成嵌合分子，再利用病毒載體介導(dǎo)嵌合分子轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細胞，細胞表面即可表達融合蛋白，經(jīng)CAR分子修飾后的T淋巴細胞具備靶向抗腫瘤活性，且不受到MHC的限制。靶向腫瘤限制性抗原是CAR-T治療成功的關(guān)鍵，由于CD38可以在惡性B細胞瘤上長時間地表達，使其成為CAR-T細胞治療的一個研究靶點[13]。細胞毒性T淋巴細胞是對病毒感染和惡性腫瘤保護性免疫的重要介質(zhì)。然而，長期暴露在同種抗原下往往會削弱T淋巴細胞的效應(yīng)能力，限制其治療潛力，我們稱之為T淋巴細胞耗竭。CAR-T細胞回輸?shù)襟w內(nèi)后，必須擴增到一定數(shù)量并存活足夠長的時間才能有效殺傷腫瘤細胞，CAR-T細胞功能衰竭會降低CAR-T細胞對腫瘤的治療效果。臨床試驗表明，TOX與耗竭的T淋巴細胞高度相關(guān)，TOX通過上調(diào)腫瘤中的IC蛋白促進腫瘤內(nèi)T淋巴細胞耗竭，其可能是促進患者T淋巴細胞耗竭的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。因此調(diào)節(jié)耗竭T細胞TOX表達可能為提高血液腫瘤免疫治療效果提供新的策略[15]。

本研究通過RNA干擾技術(shù)，在實驗室前期構(gòu)建的CD38 CAR-T細胞的基礎(chǔ)上，設(shè)計TOX基因shRNA聯(lián)合抗CD38 CAR分子，包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并成功轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代T淋巴細胞，成功構(gòu)建TOX-shRNA-CD38 CAR-T細胞。實驗發(fā)現(xiàn)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組相比TOX mRNA表達水平下降，這表明shRNA2序列靶向性更強；三組細胞培養(yǎng)0～10 d的生長倍數(shù)對數(shù)值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明三組細胞體外均能穩(wěn)定增殖；本研究采用Raji-Luc和RPMI-Luc兩種高表達CD38的細胞系作為靶細胞，在相同的體外培養(yǎng)條件下，三組細胞在分別與兩種靶細胞共培養(yǎng)時比三組細胞單獨培養(yǎng)時其表面CD69的表達均更高，細胞表面糖蛋白CD69是T細胞活化的另一個標記，因此我們得知在對應(yīng)靶抗原刺激下，三組 CAR-T細胞均被激活；從CFSE結(jié)果來看，三組CAR-T細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后FITC信號均左移，表明CAR-T細胞在腫瘤細胞的刺激下增殖加快。隨后我們用這三組細胞以效靶比1∶2、1∶4、1∶8分別作用于Raji-Luc和RPMI-Luc細胞，觀察其殺傷效率，結(jié)果顯示TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組殺傷效率強于CD38 CAR-T組。T細胞耗竭或功能障礙表現(xiàn)為減少細胞因子和效應(yīng)分子的表達，上調(diào)抑制性受體PD-1的表達[16]，而T細胞與腫瘤細胞發(fā)生反應(yīng)會釋放細胞因子IFN-γ，檢測IFN-γ也可從側(cè)面反映T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。三組細胞殺傷Raji-Luc、RPMI-Luc細胞后，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組IFN-γ釋放水平較CD38 CAR-T組升高，且TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組與不同靶細胞共培養(yǎng)時IFN-γ釋放量均高于2 000 pg/mL，這說明TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組細胞被靶抗原激活后產(chǎn)生大量IFN-γ細胞因子。同時我們發(fā)現(xiàn)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組相比PD-1表達水平降低，即TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組細胞耗竭因子水平更低。這提示抑制CAR-T細胞TOX表達可以提高其增殖能力和殺傷腫瘤的能力，起到減緩T細胞耗竭的作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了抑制TOX基因聯(lián)合抗CD38 CAR-T細胞，即TOX-shRNA-CD38 CAR-T細胞，其能有效抑制TOX表達，經(jīng)靶抗原激活后增殖能力及抗腫瘤能力顯著增強，且TOX-shRNA-CD38 CAR-T細胞的耗竭也得到改善。T淋巴細胞的效應(yīng)能力是影響CAR-T細胞治療效果的關(guān)鍵問題之一，基于構(gòu)建的TOX shRNA系統(tǒng)聯(lián)合CD38 CAR-T的良好效果不需要與小分子免疫檢查點抑制劑同時使用，也可達到增強CAR-T細胞活性，在一定程度上提高治療效果，免去了對于小分子藥物與重組CAR-T細胞聯(lián)用時劑量的摸索，使得增強CAR-T細胞抗腫瘤能力以及減緩衰竭的方法更加高效便捷，未來TOX基因shRNA聯(lián)合CAR-T的實驗方案在血液腫瘤和實體腫瘤的治療方面具有良好的應(yīng)用前景。