薛曉婕，李飛容，孫秋萍

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)檢驗科，湖北黃石435000；2腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室；3武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院;4鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)

食管癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)、病死率高等特點[1]。目前食管癌的治療方式包括手術(shù)、放療和化療，而傳統(tǒng)抗腫瘤藥物如順鉑等因選擇性差易引起較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如何減少化療藥物不良反應(yīng)是目前亟待解決的難題[2-3]。薄芝糖肽(GCGP)是從靈芝屬薄樹芝的干燥菌絲體粉末中提取而成，具有護(hù)肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及輔助抗腫瘤等多種作用。研究顯示，其對機(jī)體非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫等均有促進(jìn)作用，同時具有抗氧化、清除氧自由基的作用，且成分穩(wěn)定，不良反應(yīng)少[4]。鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的主要組織學(xué)類型，目前關(guān)于GCGP聯(lián)合順鉑對食管鱗狀細(xì)胞癌的抑制作用及其機(jī)制的相關(guān)研究較少。促分裂原活化的蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是將胞外信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)最重要的信號通路，在調(diào)控細(xì)胞增殖分化、血管生成和代謝等功能中起關(guān)鍵作用。2019年10月—2021年4月，我們通過體外培養(yǎng)食管鱗狀細(xì)胞癌Eca-109細(xì)胞，觀察GCGP聯(lián)合順鉑對其增殖和凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制與MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路的關(guān)系，旨在為臨床治療食管癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 Eca-109細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞所。GCGP注射液(北京賽升藥業(yè)股份有限公司)，順鉑(美國Sigma-Aldrich公司)，胎牛血清、RPMI1640完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，青霉素—鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(北京索來寶科技有限公司)，四氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，MAPK/ERK信號通路調(diào)控蛋白胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(IGFBP-4)、妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)、ERK及PI3K/Akt信號通路調(diào)控蛋白尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)、Akt一抗(美國Sigma公司)，β-actin二抗、細(xì)胞裂解液、PVDF膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo)，F(xiàn)ITC和PI(美國Sigma公司)，GAPDH(美國Santa Cruz公司)。CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)；酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司),倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)，SDS-PAGE電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取Eca-109細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素—鏈霉素混合液的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.3 GCGP與順鉑最佳作用濃度及最佳作用時間的篩選 采用MTT法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入胰酶進(jìn)行消化，用DMEM培養(yǎng)液配置成單細(xì)胞懸液，按3×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，分別加入50、100、200 mg/L GCGP溶液2 mL，再加入100 ng/mL順鉑2 mL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔分別加入5 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μL DMSO溶液，振蕩培養(yǎng)10 min。上酶標(biāo)儀，于波長490 nm處檢測光密度(OD)值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。結(jié)果顯示，GCGP和順鉑對Eca-109細(xì)胞均具有毒性作用，100 mg/L GCGP作用48 h時的IC50為54.9%；以100 mg/L GCGP聯(lián)合100 ng/mL順鉑作用48 h時的IC50為44.1%。因此選擇100 mg/L GCGP聯(lián)合100 ng/mL順鉑作用48 h作為最佳作用濃度和最佳作用時間。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 采用細(xì)胞克隆形成實驗。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按3×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組，對照組正常培養(yǎng)，GCGP組加入100 mg/L GCGP，順鉑組加入100 ng/mL順鉑，GCGP+順鉑組加入100 mg/L GCGP和100 ng/mL順鉑，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。去除含藥培養(yǎng)基，加入2 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到形成肉眼可見的細(xì)胞集落方可終止培養(yǎng)。PBS清洗細(xì)胞，加入多聚甲醛固定20 min，PBS清洗。顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析細(xì)胞克隆數(shù)目。細(xì)胞集落形成率(%)=(實驗組細(xì)胞集落形成數(shù)/對照組細(xì)胞集落形成數(shù))×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按3×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組，對照組正常培養(yǎng)，GCGP組加入100 mg/L GCGP，順鉑組加入100 ng/mL順鉑，GCGP+順鉑組加入100 mg/L GCGP和100 ng/mL順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。上流式細(xì)胞儀，用488 nm激光激發(fā)和530 nm發(fā)射濾光片檢測細(xì)胞凋亡率，采用Flow J軟件進(jìn)行分析。

1.6 細(xì)胞PAPP-A、IGFBP-4、uPA、ERK、Akt蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集培養(yǎng)48 h的四組細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，加入細(xì)胞裂解液吹打均勻，4 ℃振搖30 min。收集細(xì)胞裂解液于EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA法行蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別與鼠抗人PAPP-A、IGFBP-4、uPA、ERK和Akt單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記熒光抗鼠二抗1∶5 000室溫避光孵育2 h，洗滌3次，每次10 min，將PVDF膜置于化學(xué)反應(yīng)液中5 min進(jìn)行顯色，取出洗凈膜，將其放置熒光化學(xué)發(fā)光圖像分析儀中進(jìn)行曝光，采用Image J 圖像軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 四組細(xì)胞增殖能力比較 對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組的細(xì)胞集落形成率分別為100%、57.2%±4.2%、43.8%±5.1%、11.9%±3.6%。與對照組比較，GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組細(xì)胞集落形成率均降低，且GCGP+順鉑組細(xì)胞集落形成率低于GCGP組和順鉑組(P均<0.01)。

2.2 四組細(xì)胞凋亡率比較 對照組、GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組的細(xì)胞凋亡率分別為1.3%±0.8%、22.5%±3.8%、38.7%±4.2%、61.6%±5.9%。與對照組比較，GCGP組、順鉑組、GCGP+順鉑組細(xì)胞凋亡率均升高，且GCGP+順鉑組細(xì)胞凋亡率高于GCGP組和順鉑組(P<0.05或<0.01)。

2.3 四組細(xì)胞PAPP-A、uPA、IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達(dá)水平比較 與對照組比較，GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組中PAPP-A、uPA蛋白表達(dá)均降低，IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達(dá)均升高(P<0.05或<0.01)，與GCGP組和順鉑組比較，GCGP+順鉑組PAPP-A、uPA蛋白表達(dá)降低，IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。見表1。

表1 四組細(xì)胞PAPP-A、uPA、IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

食管癌的傳統(tǒng)治療方法包括化學(xué)治療、放射治療、外科治療、綜合治療等，但均無法降低食管癌術(shù)后高復(fù)發(fā)率及高病死率。新的藥物聯(lián)合化療藥物在惡性腫瘤的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，聯(lián)合用藥目前已在急性白血病和胰腺導(dǎo)管腺癌等癌癥的治療中取得一定的療效，其可針對不同致癌細(xì)胞信號通路減少單獨用藥的不良反應(yīng)和并發(fā)癥[5]，但其在食管癌中的應(yīng)用研究尚少。順鉑是傳統(tǒng)的化療藥物，已有研究指出，長期使用該藥物具有一定的耐藥性[6-7]。GCGP由多肽和多糖組成，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能以及抗氧化、清除氧自由基的作用。研究表明，GCGP具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)活性、護(hù)肝解毒、鎮(zhèn)靜、降血糖等作用[8-10]，作為一種高效抗腫瘤藥物已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的過度增殖和凋亡減少密切相關(guān)。正常人體組織、細(xì)胞的生長受到精確調(diào)控，而腫瘤細(xì)胞具有無限生長的特性，腫瘤細(xì)胞的無限生長是腫瘤細(xì)胞凋亡受抑制的結(jié)果，細(xì)胞凋亡障礙與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[11-13]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，GCGP組、順鉑組和GCGP+順鉑組食管鱗狀細(xì)胞癌Eca-109細(xì)胞集落形成率均降低，細(xì)胞凋亡率均升高，且GCGP+順鉑組細(xì)胞集落形成率低于GCGP組和順鉑組、細(xì)胞凋亡率高于GCGP組和順鉑組。說明GCGP、順鉑單獨或聯(lián)合應(yīng)用均可抑制Eca-109細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，而與單獨用藥相比較，聯(lián)合用藥能更加有效地抑制Eca-109細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路是兩條經(jīng)典的促進(jìn)生長和抗凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)被異?；罨罂纱龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、血管形成、抑制凋亡、參與自噬等。PAPP-A被認(rèn)為與促進(jìn)腫瘤有關(guān)，PAPP-A表達(dá)與IGFBP-4密切相關(guān)，PAPP-A升高可降低IGFBP-4表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[11-12]。IGFBP-4被PAPP-A降解后，IGFBP-4裂解釋放出IGF-1，活化MAPK/ERK信號通路，下游MAPK和ERK被進(jìn)一步激活[13-15]。uPA是一種高度特異性的絲氨酸蛋白酶，可將纖溶酶原激活成纖溶酶，纖溶酶可降解纖維蛋白、層黏連蛋白，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。PI3K普遍存在于靜息細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，屬于原癌基因的一種，uPA活化可激活PI3K/Akt信號通路，PI3K活化后，下游Akt被進(jìn)一步激活，該研究結(jié)果在乳腺癌細(xì)胞中得到證實[17-18]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，GCGP+順鉑組IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達(dá)明顯升高，PAPP-A、uPA蛋白表達(dá)明顯下降。這表明下調(diào)PAPP-A和uPA蛋白表達(dá)，可以激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路上的IGFBP-4、ERK、Akt蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，GCGP聯(lián)合順鉑能夠抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能與其激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路的相關(guān)蛋白IGFBP-4、ERK、Akt表達(dá)，下調(diào)PAPP-A、uPA蛋白表達(dá)有關(guān)。