陳沛芬，賴瑾瑜，鄺永培

南方醫(yī)科大學附屬東莞市人民醫(yī)院超聲科，廣東東莞523059

在女性惡性腫瘤中，乳腺癌的發(fā)病率及病死率均列首位。乳腺癌的早期診斷可為治療爭取時機，改善治療結局。二維超聲作為乳腺腫塊最主要篩查方式，可有效發(fā)現腫塊存在，但在腫塊良惡性鑒別方面的準確性欠佳。超聲造影技術被稱為“超聲技術的第三次革命”，在腫瘤早期篩查中的敏感性、準確性均大幅提升[1]。研究顯示，超聲造影參數上升支斜率、曲線下面積(AUC)等與乳腺癌惡性程度相關[2-3]。乳腺癌細胞增殖、侵襲、自噬基因表達量可直接客觀反映細胞增殖、侵襲、自噬活性，進而間接反映乳腺癌的惡性程度[4-5]。增殖基因丙酮酸激酶M2(PKM2)、侵襲基因Gab2、自噬基因ATG2B的表達水平是腫瘤細胞生物學行為的量化表現，其水平異常可反映腫瘤細胞的惡性生物學行為。基于此，本研究分析超聲造影參數與乳腺癌患者惡性生物學行為相關基因的相關性，旨在提升超聲診斷乳腺癌的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年6月—2019年12月在我院接受乳腺手術治療的120例女性乳腺癌患者作為觀察組，年齡34～75(55.08±7.85)歲。均經病理檢查確診，其中浸潤性導管癌111例、導管內原位癌9例，臨床分期Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期41例，Ⅳ期30例。患者均為首診，術前未行抗腫瘤治療。排除標準：合并其他組織臟器惡性腫瘤性疾?。蝗焉锲诨虿溉槠?；合并乳腺局部或全身感染性疾病。另選取120例女性乳腺腺纖維瘤患者作為對照組，年齡31～77(56.12±8.57)歲。兩組年齡具有可比性(P>0.05)。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準，患者及家屬知情并簽署知情承諾書。

1.2 超聲造影檢查 采用Aplio 500彩色多普勒超聲診斷儀?；颊呷朐汉笙刃卸S超聲檢查，了解病灶位置、數目、大小、內部回聲、質地、血流灌注、是否合并微鈣化等；固定探頭位置，切換至造影模式，20 mL造影劑Sono Vue與5 mL生理鹽水混勻，抽取4.8 mL經肘正中靜脈推注，隨后快速注入5 mL生理鹽水沖管。通過超聲診斷儀觀察病灶處動態(tài)灌注，利用Qontrast軟件計算時間—強度曲線中達峰強度(PI)、AUC，其中PI反映微血管密度，AUC反映血流灌注。以二者平均值為界，小于等于平均值為低水平，大于平均值為高水平。

1.3 腫瘤組織PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR法。取凍存的手術切除腫瘤組織標本，加入細胞裂解液，以3 500 r/min離心10 min，取無色水相。異硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：PKM2上游5′-ACAGCTGTGTGGTGCTTCTGTG-3′，下游5′-CATTGTCCTCTGTCCAGGCATC-3′；Gab2上游5 ′-CATCATTCACCCTTGGCACAGGTGT-3′，下游5′-TGATCCCAAGTGGTCCACCCCAAC-3′；ATG2B上游5′-CTTGCCCCTTTCGTCTATTTG-3′，下游5′-TACGGCCCTGAAGTACAGTCTT-3′。擴增體系：逆轉錄產物5 μL，寡聚核苷酸引物各為400 nmol/L，探針150 nmol/L，dATP、dCTP和dGTP各200 μmol/L，dUTP 400 μmol/L，10×緩沖液5 μL，MgCl25 mmol/L，TaqDNA聚合酶1.25 U，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)0.5 U。擴增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min；94 ℃ 30 s，66 ℃1 min，共40個循環(huán)。在7700 Sequence Detector分析儀上測定標準品和標本中PKM2、Gab2、ATG2B含量，根據標準曲線計算PKM2、Gab2、ATG2B mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達水平比較 觀察組PKM2、Gab2 mRNA表達水平高于對照組，ATG2B mRNA表達水平低于對照組(P均<0.05)。見表1。

2.2 不同臨床分期乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達水平比較 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者PKM2、Gab2 mRNA表達水平低于Ⅲ～Ⅳ期，ATG2B mRNA表達水平高于Ⅲ～Ⅳ期(P均<0.05)。見表2。

表1 兩組PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達水平比較

表2 不同臨床分期乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達水平比較

2.3 兩組超聲造影參數比較 觀察組PI、AUC均高于對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組超聲造影參數比較

2.4 不同超聲造影參數水平患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達水平比較 乳腺癌PI、AUC高水平患者PKM2、Gab2 mRNA表達水平高于低水平患者，ATG2B mRNA表達量低于低水平患者(P均<0.05)。見表4。

表4 不同超聲造影參數水平患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達水平比較

2.5 乳腺癌患者超聲造影參數與PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達的相關性 在乳腺癌患者中，PI與PKM2、Gab2 mRNA表達呈正相關(r分別為0.518、0.388，P均<0.05)，與ATG2B mRNA表達呈負相關(r=-0.646，P<0.05)；AUC與PKM2、Gab2 mRNA表達呈正相關(r分別為0.506、0.486，P均<0.05)，與ATG2B mRNA表達呈負相關(r=-0.559，P<0.05)。

3 討論

超聲造影可直觀地觀察乳腺癌惡性轉化及發(fā)生發(fā)展過程中血管構筑變化與相應血流動力學變化，主要體現在血管數量、形態(tài)、結構、空間分布及灌注功能的改變[6-7]。研究顯示，血管生成能力可預測良性增生組織的惡性傾向[8-9]。超聲造影參數時間—強度曲線中PI動態(tài)增強掃描開始至腫瘤濃度達峰所需時間，反映血管阻力，可反映微血管密度，AUC描述整個動態(tài)增強周期內腫瘤組織對比劑濃度變化趨勢，可反映病灶組織血流灌注及通透性，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，時間—強度曲線中PI、AUC逐漸增高[10]。本研究結果顯示，觀察組超聲造影參數PI、AUC水平高于對照組，提示乳腺癌組織中血流灌注更多，與其腫瘤特性相吻合。

乳腺癌細胞惡性增殖與促增殖/抗增殖基因表達失衡直接相關，對細胞增殖相關基因表達量進行檢測，可反映乳腺癌細胞的增殖活性，評估其惡性程度[11]。PK是細胞糖酵解通路的限速酶，也是腫瘤代謝異常的關鍵酶。PK有四種同工酶形式(M1、M2、L、R)，在腫瘤形成過程中，其他三種同工酶逐漸消失，PKM2則大量表達。腫瘤細胞PKM2的酪氨酸與絲氨酸位點會發(fā)生磷酸化，PKM2上磷酸酪氨酸可促進1，6二磷酸果糖釋放，四聚體轉變?yōu)槎垠w，進而使糖酵解向生物合成轉變，加速有氧糖酵解，促進腫瘤發(fā)展[12]。研究顯示，腫瘤組織中PKM2高表達，作為轉錄輔助因子可參與細胞耐藥及有絲分裂、增殖周期調節(jié)，下調PKM2表達可對凋亡相關蛋白表達產生影響，促進腫瘤細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，觀察組乳腺癌組織中PKM2 mRNA表達量高于對照組，且臨床分期Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者PKM2 mRNA表達水平低于Ⅲ～Ⅳ期，表明PKM2表達異常參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤惡性進展后可出現遠處侵襲轉移，導致預后不佳，該過程有較多侵襲相關基因參與。Gab2是腫瘤相關蛋白，在卵巢癌、卵巢癌等中呈異常高表達，與腫瘤侵襲轉移密切相關[14-15]。研究表明，Gab2可通過PI3K/Akt/ARK5信號通路影響基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9表達，進而促進乳腺癌的侵襲與轉移[16]。自噬功能異常是癌癥發(fā)生的重要因素之一。ATG2B是典型的自噬相關基因，可調控溶酶體降解受損細胞器和大分子，誘導細胞凋亡進程[17]。本研究結果顯示，觀察組Gab2 mRNA表達量高于對照組，且Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者表達量高于Ⅰ～Ⅱ期患者；ATG2B mRNA表達量低于對照組，且Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者表達量低于Ⅰ～Ⅱ期患者。這表明Gab2、ATG2B表達異常與乳腺癌發(fā)生及侵襲轉移有關。

探討超聲造影與分子生物學指標的聯(lián)系，可對臨床治療和預后評估方面提供更全面的依據。本研究結果顯示，乳腺癌超聲造影PI、AUC高水平患者PKM2、Gab2 mRNA表達高于低水平患者，ATG2B mRNA表達低于低水平患者，且PI、AUC水平與PKM2、Gab2 mRNA表達呈正相關，與ATG2B mRNA表達呈負相關。提示超聲造影參數水平與乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達水平相關，可在一定程度上反映乳腺癌細胞的增殖活性、侵襲活性及自噬活性。

綜上所述，乳腺癌患者超聲造影參數水平及PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達異于良性腫瘤者，且具體參數水平與PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達量直接相關，可作為早期篩查疾病、評估惡性程度的可靠手段。降低PKM2、Gab2 mRNA表達，提高ATG2B mRNA表達有望成為控制乳腺癌侵襲轉移的靶點。