白 潔，姚 拓，王占軍，雷 楊，楊曉蕾，張 蔚

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所，寧夏 銀川 750000)

歐李(Cerasushumilis)是一種落葉叢生小灌木，主要生長(zhǎng)于我國(guó)北方的草原、森林、沙漠邊緣以及一些丘陵地區(qū)[1]。其自身表現(xiàn)出的抗逆性是其在不良環(huán)境下穩(wěn)定生長(zhǎng)的重要原因之一，如耐寒、耐旱、耐鹽堿等特性。因此，可作為防風(fēng)固沙、抵抗水土流失、改善生態(tài)環(huán)境的先鋒樹種[2]。此外，由于歐李葉量大，莖細(xì)且質(zhì)地柔軟，便于牛羊的啃食，在畜牧業(yè)中被視為一種良好的飼料。前人研究發(fā)現(xiàn)，歐李莖葉中不僅含有糖和蛋白質(zhì)等牛羊生長(zhǎng)所需的一般營(yíng)養(yǎng)，而且其鈣元素含量較高，是牛羊骨骼發(fā)育的重要補(bǔ)鈣來(lái)源[3]。因此，該灌木不管是在生態(tài)建設(shè)還是作為飼料生產(chǎn)方面均具有較大發(fā)展前景。

歐李所表現(xiàn)出的較強(qiáng)的生態(tài)價(jià)值，主要源于其龐大且呈網(wǎng)狀分布的根系能夠在瘠薄的土壤中吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供給植物生長(zhǎng)[4]。而定殖于植物根系內(nèi)的內(nèi)生促生菌(Plant growth-promoting endo phytes,PGPE)所分泌的多種生理活性物質(zhì)，如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等，會(huì)刺激植物新陳代謝，促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)[5]。此外，還可通過(guò)固氮、解磷(將有機(jī)磷水解轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷酸鹽)[6]、溶磷(將不溶性無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽)[7]等方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)[8-9]。謝安強(qiáng)等[10]從桉樹體內(nèi)分離篩選到的內(nèi)生細(xì)菌，可提高桉樹的抗逆性與生長(zhǎng)量。張現(xiàn)勇等[11]從油菜中分離的菌株yc8，顯著提高了油菜幼苗的鮮重和株高。然而，目前關(guān)于從生長(zhǎng)良好的歐李根系中分離多功能PGPE的研究還未見報(bào)道。

鑒于此，本研究從歐李根系中分離獲得PGPE菌株，并對(duì)其固氮、解磷、溶磷、合成植物生長(zhǎng)素IAA和耐鹽堿特性進(jìn)行初步研究，利用分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，以期為后續(xù)歐李微生物接種劑(菌肥)研制提供優(yōu)良菌株，并豐富我國(guó)微生物菌種資源庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源及處理 歐李樣品來(lái)源于寧夏回族自治區(qū)銀川市永寧縣，位于寧夏中部，屬于典型的溫帶大陸性氣候，土壤質(zhì)地為砂土。采集歐李植物根系，裝入無(wú)菌自封袋中，標(biāo)注植物名稱及采集日期，放置于冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冰箱中4℃保存，進(jìn)行菌株分離。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 LB(luria bertani,LB)固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0[12]。

King氏液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，丙三醇15 mL，L-色氨酸0.1 g[13]。

無(wú)機(jī)磷(National botanical research institute’s phosphate,NBRIP)液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，Ca3(PO4)25g，MgCl2·6H2O 5g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH4)2SO40.1 g，總體積1 000 mL，pH 6.8～7.0[14]。

蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基：MnSO4·4H2O 0.03 g，F(xiàn)e SO4·7H2O 0.03 g，CaCO35.0 g，葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，卵磷脂0.2 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，酵母膏0.4 g，總體積1 000 mL，pH 7.0～7.5[15]。

NFM (Nitrogen free medium,NFM)培養(yǎng)基：CaCl2·2H2O 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，NaCl 0.1 g，KOH 5 g，蘋果酸5 g，生物素10 μg，0.5%溴百里酚藍(lán)5 mL，瓊脂20 g(固體培養(yǎng)基)或2 g(半固體培養(yǎng)基)，總體積1 000 mL，pH 7.0[16]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離與純化 采用組織勻漿法[17]，將歐李根系置于自來(lái)水下沖洗干凈，用8%次氯酸鈉浸泡3 min，75%乙醇表面消毒30 s，使用無(wú)菌蒸餾水清洗3次，去除表面的滅菌劑。滅菌的植物根系用滅菌刀片切成約為1 g的小塊，用高壓滅菌的研磨棒和研磨缽在9 mL的無(wú)菌水中研磨至勻漿。將0.1 mL的組織懸浮液涂布于LB平板上。接種平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)菌落形態(tài)與顏色的不同，使用接種環(huán)挑取單菌落進(jìn)行四區(qū)劃線，反復(fù)純化至單一菌落。分離純化后的菌株懸浮于20%甘油，保存至-80℃冰箱中備用。

1.2.2 內(nèi)生促生菌促生特性測(cè)定 將分離出的7株菌分別進(jìn)行促生特性測(cè)定，固氮酶活性測(cè)定：乙炔還原法[18]；解磷、溶磷特性測(cè)定：鉬銻抗比色法[19]；合成植物生長(zhǎng)素IAA特性測(cè)定：Salkowski法[20]。

1.2.3 內(nèi)生促生菌耐鹽堿特性測(cè)定 在LB液體培養(yǎng)基pH 7.0的條件下，將各培養(yǎng)基中的NaCl濃度分別提高5%，培養(yǎng)基中NaCl濃度分別為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%；在LB液體培養(yǎng)基中NaCl濃度為10 g·L-1的條件下，將培養(yǎng)基中pH值分別提高一個(gè)單位，各培養(yǎng)基中pH值分別為7、8、9、10、11、12、13。將分離菌株分別接種至具有不同鹽堿濃度的LB液體培養(yǎng)基中，每株菌3次重復(fù)，以不接菌的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在30℃，180 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)2 d后，測(cè)定培養(yǎng)基在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值(OD600 nm)并制作曲線。

1.2.4 分離菌株鑒定 將上述分離出的7株菌在LB平板上活化后，提取細(xì)菌總DNA，使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、DNA模板2 μL、引物各1 μL、ddH2O 21 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)循環(huán)32次；72℃總延伸5 min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%凝膠瓊脂糖電泳檢測(cè)，并于-20℃保存待用。16S rRNA基因序列測(cè)定由北京奧科鼎盛科技有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果在Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，并利用MEGA 7.0軟件中CLUSTAL W程序進(jìn)行同源序列比對(duì)，使用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，顯著性水平為P<0.05，并用Origin Lab Origin Pro 8.5和MEGA 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李內(nèi)生促生菌分離菌株促生特性分析

由表1可看出，供試7株內(nèi)生菌的固氮酶活性分布在50.64～127.40 nmol·h-1·mL-1，以菌株Y3固氮酶活性最高，為127.40 nmol·h-1·mL-1。對(duì)分離菌株解磷、溶磷特性的測(cè)定中，菌株解有機(jī)磷量在1.28～358.90 μg·mL-1，菌株N23和N22均有較強(qiáng)的解磷能力，解磷量分別為358.90 μg·mL-1和342.20 μg·mL-1，其他5株菌解磷量均小于150 μg·mL-1；分離菌株溶無(wú)機(jī)磷量在6.29～143.61 μg·mL-1，菌株Y2和Y3相較于其他5株菌具有較強(qiáng)溶磷能力,溶磷量均大于100 μg·mL-1。通過(guò)對(duì)分離菌株解磷、溶磷能力的定量測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，不同菌株具有不同的解磷、溶磷特性，其中3株分離菌株出現(xiàn)解有機(jī)磷量大于溶無(wú)機(jī)磷量。此外，在合成植物生長(zhǎng)素IAA特性測(cè)定中，菌株合成IAA量在14.24～70.48 μg·mL-1，以菌株N22合成IAA量最高。

表1 分離菌株促生特性測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination result of the growth-promoting characteristics of isolated strains

2.2 歐李內(nèi)生促生菌分離菌株耐鹽堿特性分析

分離菌株對(duì)不同NaCl濃度的耐受性測(cè)定中，菌株Y1、Y2、N22、N23、N1能耐受NaCl最高濃度為10%。菌株Y4、Y3能耐受NaCl最高濃度為30%，說(shuō)明該兩株菌株具有較廣泛的耐鹽能力。此外菌株Y3、Y4、N1的最適NaCl濃度為5%(圖1)。在10 g·L-1NaCl濃度下，菌株N1、N22堿性(pH值)的耐受范圍為7～10，菌株N23堿性(pH值)的耐受范圍為7～11，其中菌株N1、N22最適生長(zhǎng)的堿性(pH值)耐受為8。此外，菌株Y1、Y2、Y3、Y4堿性(pH值)的耐受范圍為7～13，其中菌株Y1、Y2、Y4最適生長(zhǎng)的堿性(pH值)耐受為8，而菌株Y3的最適生長(zhǎng)的堿性(pH值)耐受為9，該結(jié)果表明分離出的7株菌在10 g·L-1NaCl濃度下均具有一定的耐堿能力(圖2)。

圖1 分離菌株對(duì)不同NaCl濃度耐受性Fig.1 Tolerance of isolated strains to different NaCl concentrations

圖2 分離菌株對(duì)不同堿性程度(pH值)的耐受性Fig.2 Tolerance of isolated strains to different alkaline (pH value)

2.3 歐李內(nèi)生促生菌分離菌株鑒定

通過(guò)對(duì)7株分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)Y3、Y4、N1菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)，其余菌株為革蘭氏陰性菌(G-)。測(cè)序結(jié)果在Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)(表2)，并使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，菌株Y4、Y3確定為芽胞桿菌屬Bacillusp.，菌株N22、N23為猴假單胞菌Pseudomonassimiae，菌株Y1、Y2為無(wú)色桿菌Achromobactermarplatensis，N1為耐寒短桿菌Brevibacteriumfrigoritolerans。

圖3 基于分離菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of the isolated strains

表2 分離菌株16S rRNA基因相似性比對(duì)Table 2 Comparison of 16S rRNA gene similarity of isolated strains

3 討論與結(jié)論

PGPE是一類具有較強(qiáng)定殖和靶向功能的微生物，相較于土壤和根際微生物，接種后更易進(jìn)入植物體內(nèi)，并發(fā)揮相關(guān)功能[21]。本研究從歐李根系中分離獲得7株內(nèi)生細(xì)菌，包含4個(gè)屬，分別為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、短桿菌屬和無(wú)色桿菌屬，其中假單胞菌屬菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的解磷特性。前人研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌在植物根系中是一類較為活躍的解磷微生物[22-24]。本試驗(yàn)中，編號(hào)為N23菌株被初步鑒定為Pseudomonassimiae，其解有機(jī)磷量最高，為358.90 μg·mL-1，并且該菌株同時(shí)兼具固氮、合成植物生長(zhǎng)素IAA、耐鹽堿等特性，這在已報(bào)道的假單胞菌株中是較為少見的。另外，盡管有2株細(xì)菌同屬于P.simiae，且這兩株菌的16S rRNA基因序列與P.simiaeOLi的相似度均達(dá)到99.85%，但它們的促生潛力卻具有顯著差異,說(shuō)明同一種屬的內(nèi)生細(xì)菌的促生潛力存在菌株間的差異，引起菌株間促生潛力的差異與細(xì)菌自身代謝能力、外界環(huán)境中碳源、氮源及微量元素的種類等諸多因素有關(guān)[25]，還需進(jìn)一步研究。

歐李主要分布于我國(guó)北方地區(qū)，多山地丘陵或沙漠草原，土壤養(yǎng)分貧瘠，而固氮微生物在為植物提供氮源方面發(fā)揮很大作用。本研究測(cè)定分離菌株固氮酶活性在50.64～127.40 nmol·h-1·mL-1，芽胞桿菌Y3固氮酶活性最高，為127.40 nmol·h-1·mL-1，與前人報(bào)道的芽胞桿菌固氮活性結(jié)果一致[26]。吲哚乙酸(IAA)是一種極為重要的生理活性物質(zhì)，由包含PGPE在內(nèi)的多種微生物產(chǎn)生[27-28]。本試驗(yàn)中分離的菌株均能夠分泌植物生長(zhǎng)素IAA，如果給宿主植物接種分泌IAA菌株，可擴(kuò)大根表面積，利于根系從土壤中吸收水分和礦物質(zhì)[29]，對(duì)提高歐李的產(chǎn)量和品質(zhì)具有積極作用。

在PGPE菌株分離過(guò)程中，不僅要分離具有促生作用的菌株，還應(yīng)篩選具有耐鹽堿特性菌株，這對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要作用[30]。全球大約20%的耕地和50%的灌區(qū)受到鹽堿化的影響[31]，內(nèi)生菌能夠從植物的多個(gè)方面來(lái)改善植物組織滲透平衡和離子毒害，從而緩解鹽堿脅迫對(duì)植物的傷害，有利于植物在鹽堿地生長(zhǎng)[32]。根據(jù)Larsen等[33]和Vreeland[34]提出的微生物對(duì)鹽堿敏感程度的分類系統(tǒng)，本試驗(yàn)分離菌株Y3、Y4能夠在NaCl濃度為30%、pH值為13的條件下正常生長(zhǎng)，屬于極端嗜鹽嗜堿微生物。推測(cè)該株菌與歐李能夠生長(zhǎng)在鹽堿環(huán)境中有一定關(guān)系,可協(xié)助植物適應(yīng)環(huán)境，并在鹽堿地生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用潛力。

本研究分離的7株內(nèi)生菌均具有一定的促生功能(固氮、解磷、溶磷、合成植物生長(zhǎng)素IAA)和耐鹽堿特性，解有機(jī)磷量最高為342.20 μg·mL-1，溶無(wú)機(jī)磷量最高為143.61 μg·mL-1，固氮酶活性最高為125.9 nmol·h-1·mL-1；合成植物生長(zhǎng)素IAA量最高為70.48 μg·mL-1，耐鹽堿特性較強(qiáng)的菌株可在NaCl濃度為30%，pH值為13的條件下正常生長(zhǎng)。7株優(yōu)良PGPE被鑒定為：Y3、Y4為Bacillussp.，N23、N22為Pseudomonassimiae，N1為Brevibacteriumfrigoritolerans，Y1、Y2為Achromobactermarplatensis。各菌株之間促生潛力存在顯著差異，可為后續(xù)復(fù)合微生物菌劑(菌肥)研發(fā)提供依據(jù)。