袁家梁，蔡明蕾，李秧秧

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

氣孔是植物葉片與外界環(huán)境進(jìn)行水分和CO2交換的門(mén)戶,因而直接影響植物的蒸騰和光合作用。短時(shí)段內(nèi)，植物主要通過(guò)氣孔的開(kāi)閉來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境條件的變化，而長(zhǎng)時(shí)段內(nèi)，則通過(guò)改變氣孔的大小和密度等來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化[1]。因而研究葉氣孔特征是探究植物對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)機(jī)制的重要內(nèi)容。水分和氮素虧缺是限制旱地作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要因子，關(guān)于干旱對(duì)氣孔的影響方面研究較多[2-4]，但氮素虧缺及二者協(xié)同作用下對(duì)氣孔特征的研究則相對(duì)較少。

氮素是植物所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，一方面，氮素作為光合關(guān)鍵酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶和葉綠素的主要構(gòu)成成分，通過(guò)影響葉綠素含量、酶含量及酶活性等直接影響光合作用，進(jìn)而影響植物葉片的氣孔特征[5]；另一方面,氮素通過(guò)影響ABA積累調(diào)控根冠間信息傳遞而影響氣孔導(dǎo)度[6]。關(guān)于氮素對(duì)植物氣孔特征的影響已有一些研究，如夏玉米施低量氮后葉片氣孔密度顯著下降，施高量氮后氣孔密度有所增大；與不施氮相比,施氮葉片氣孔長(zhǎng)度、寬度和面積均下降[7]；擬南芥上表皮氣孔密度隨氮用量增加顯著降低，而下表皮氣孔長(zhǎng)則顯著增加[8]；干、濕生境中生長(zhǎng)的藍(lán)桉(Eucalyptusglobulus)葉氮濃度均與氣孔密度呈顯著正相關(guān)，而在高降雨量地區(qū)葉片氮含量與氣孔大小存在顯著負(fù)相關(guān)[9]；我國(guó)東部典型森林不同木本植物氣孔特征對(duì)氮添加的響應(yīng)不同[10]，不同研究中施氮對(duì)氣孔的效應(yīng)不同，可能與植物、生育期、氮脅迫處理的時(shí)間和強(qiáng)度及植物的養(yǎng)分利用策略等的差異有關(guān)。

氮素和水分虧缺降低植物葉片的光合速率和氣孔導(dǎo)度，影響其水分利用[9,11-12]，其原因可能與對(duì)氣孔特征的影響有關(guān)，為此，我們探討了不同氮素和水分處理下玉米葉氣孔特征的變化及與葉光合氣體交換的關(guān)系，試圖揭示氮素和水分影響植物生長(zhǎng)和水分利用的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽試驗(yàn)，所用塑料盆上底內(nèi)徑28.5 cm、下底內(nèi)徑21.0 cm、高24.5 cm，盆中裝入12 kg的風(fēng)干過(guò)篩土。土壤為土，采自陜西楊凌大寨村農(nóng)田耕層。楊凌地處關(guān)中平原，屬暖溫大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫12.9℃，年日照時(shí)數(shù)2 163.8 h，年降水量635.1 mm，年平均蒸發(fā)量993.2 mm。所采土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮和Olsen-P 分別為8.1、12.54 g·kg-1、0.82 g·kg-1、40.7 mg·kg-1和11.4 mg·kg-1，田間持水量為25.68%。

試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)氮肥水平：不添加氮肥 (N0)；播種前干土中施純N 0.2 g·kg-1，生育期不追肥(N1)；播種前和五葉期各施純N 0.2 g·kg-1，生育期總施氮量為純N 0.4 g·kg-1(N2)。播種前一次性施入KH2PO40.2 g·kg-1。每個(gè)氮水平處理12盆，于2018年5月31日每盆播4粒精選玉米種子，所用品種為先玉335，在三葉期每盆定苗2株，然后在土壤表面覆蓋約2 cm厚的珍珠巖以抑制土壤蒸發(fā)。土壤用稱(chēng)重法按田間持水量的75%～80%進(jìn)行灌水。播種后42 d左右開(kāi)始水分處理，每個(gè)氮水平隨機(jī)分為3組，即：充分灌水(土壤含水量一直維持在田間持水量的75%～80%，W2)、中度水分脅迫(土壤含水量降至田間持水量的50%～55%，然后維持該含水量，W1)、重度水分脅迫(土壤含水量降至田間持水量的30%～35%，然后維持該含水量，W0)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理4次重復(fù)。水分處理持續(xù)約3周后，于2018年8月4日起選擇玉米植株最上部完全展開(kāi)葉進(jìn)行葉光合氣體交換參數(shù)和葉氣孔特征測(cè)定。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 光合氣體交換參數(shù) 晴朗無(wú)風(fēng)天氣9∶00—12∶00用Li-6800型便攜式光合儀(Li-COR，Lincoln，USA)測(cè)定最上部完全展開(kāi)葉的光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)、蒸騰速率(Tr)。測(cè)定時(shí)光照設(shè)為1 500 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，溫度和相對(duì)濕度為大氣溫濕度，每個(gè)處理重復(fù)4次。葉瞬時(shí)水分利用效率(WUEi)為光合速率與蒸騰速率的比值。

1.2.2 氣孔特征 每盆取測(cè)定完光合氣體交換參數(shù)的目標(biāo)葉，帶回實(shí)驗(yàn)室利用印跡法測(cè)定氣孔特征。先用透明指甲油分別涂在目標(biāo)葉上(距葉尖1/3處)、中部(距葉尖1/2處)和下部(距葉尖2/3處)兩側(cè)的上、下表皮上，待干后輕輕撕下，制成臨時(shí)裝片,然后進(jìn)行顯微數(shù)碼拍攝，每個(gè)裝片觀察4 個(gè)視野，每片葉上、下表面各觀察24個(gè)視野。氣孔密度(SD，mm-2)即單位葉面積的氣孔數(shù)，在100×鏡下進(jìn)行觀測(cè)，而氣孔長(zhǎng)(SL，氣孔孔徑長(zhǎng))、氣孔寬(SW，垂直于氣孔長(zhǎng)軸中央的孔徑及保衛(wèi)細(xì)胞寬度)、氣孔面積(SA，實(shí)測(cè)的含保衛(wèi)細(xì)胞在內(nèi)的面積)、保衛(wèi)細(xì)胞寬(GCW)的觀測(cè)在400×鏡下進(jìn)行。每片葉每一面氣孔大小的觀測(cè)不少于96 個(gè)氣孔。氣孔SPI(Stomatal pore area index)按SL2×SD×10-4(SL,氣孔長(zhǎng)；SD，氣孔密度)計(jì)算,可近似理解為單位面積的最大氣孔孔徑面積[13]。同一葉片上、下表面所有測(cè)定位點(diǎn)的平均值作為其上、下表面的氣孔特征值。

葉對(duì)水蒸汽的最大氣孔導(dǎo)度 (gsmax)按照Franks 等[14]的公式計(jì)算：

式中，d為水在空氣中的擴(kuò)散率(m2·s-1)，25℃下為24.9 × 10-6m2·s-1；SD是氣孔密度(個(gè)·mm-2)；αmax為估算的最大氣孔孔徑面積(=π×SL2/4，其中SL為氣孔長(zhǎng))；l為氣孔腔深度，假設(shè)等于保衛(wèi)細(xì)胞的寬度；ν是空氣的摩爾體積(m3·mol-1)，25℃、101.3 kPa下為22.4 × 10-3m3·mol-1。葉的最大氣孔導(dǎo)度為上、下表面最大氣孔導(dǎo)度之和。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用二因素方差分析檢驗(yàn)氮素、水分及其交互作用對(duì)氣孔特征和氣體交換參數(shù)的影響，若方差分析中氮素或水分的效應(yīng)達(dá)到顯著后，Tukey法進(jìn)行多重比較。用配對(duì)樣品T檢驗(yàn)分析葉上、下表面間氣孔特征的差異，Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)氣孔特征間及氣體交換參數(shù)與氣孔特征間相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮素和水分對(duì)玉米葉片氣孔特征的影響

氮素對(duì)玉米葉上表面的氣孔特征，包括氣孔密度、氣孔長(zhǎng)、氣孔寬、氣孔面積、SPI和最大氣孔導(dǎo)度(gsmax)都有極顯著的影響(P<0.01)，對(duì)下表面除氣孔寬和氣孔面積外的所有氣孔特征指標(biāo)也有極顯著的影響(P<0.01)；水分顯著影響上表面的氣孔長(zhǎng)、氣孔面積及下表面的氣孔密度、氣孔長(zhǎng)和氣孔面積(P<0.05)；氮肥和水分的交互作用僅對(duì)下表面氣孔密度的影響達(dá)到顯著(P<0.01)(表1)。所有處理葉下表面的氣孔密度、氣孔寬、氣孔面積、SPI和gsmax顯著高于上表面(P<0.05)，但氣孔長(zhǎng)顯著低于上表面(P<0.05)(圖1)。

表1 氮素和水分對(duì)玉米葉片上、下表面氣孔特征影響的方差分析Table 1 ANOVA of nitrogen and water on the adaxial and abaxial stomatal traits in corn leaves

隨施氮水平增加，上、下表面的氣孔密度逐漸增加，N2水平的氣孔密度顯著高于N0和N1處理(P<0.05)；上表面氣孔長(zhǎng)、氣孔寬和氣孔面積隨施氮水平增加而增加，N2顯著高于N0(P<0.05)；下表面氣孔長(zhǎng)亦隨施氮水平增加而增加，但氣孔寬和氣孔面積并無(wú)顯著變化；上、下表面的SPI和gsmax均隨施氮水平增加而增加，表現(xiàn)出N2>N1>N0(圖1)。

隨水分增加，下表面氣孔密度出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，W2處理的氣孔密度顯著低于W0(P<0.05)，但上表面氣孔密度變化不大；上、下表面的氣孔長(zhǎng)和氣孔面積也隨水分的增加而增加，W2顯著高于W0(P<0.05)；不同水分處理下上、下表面的氣孔寬、SPI和gsmax沒(méi)有顯著差異(圖1)。綜合來(lái)看，水分對(duì)氣孔特征的影響要小于氮處理。

不同處理上、下表面的氣孔長(zhǎng)與氣孔寬、氣孔面積間均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，上表面的氣孔寬和氣孔面積亦呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，但下表面的氣孔寬和氣孔面積相關(guān)性不顯著。上表面的SPI與氣孔密度、氣孔長(zhǎng)、氣孔寬和氣孔面積均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而下表面的SPI與氣孔密度、氣孔寬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與氣孔長(zhǎng)、氣孔面積的相關(guān)性不顯著。上、下表面的gsmax均與氣孔密度、氣孔寬和SPI呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表2)。

注：不同小寫(xiě)字母表示不同氮或水分處理間的差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示同一氮肥或水分處理上、下表面氣孔特征之間的差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significantly difference among different N levels or water levels (P<0.05).Different capital letters indicate significant difference of stomatal traits between adaxial and abaxial sides under the same N or water levels (P<0.05).圖1 玉米葉片上、下表面氣孔特征隨氮肥和水分的變化Fig.1 Changes of adaxial and abaxial stomatal traits with nitrogen and water use in corn leaves

表2 玉米葉片上、下表面氣孔特征間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficients of adaxial and abaxial stomatal traits in corn leaves

2.2 氮素和水分對(duì)玉米葉片氣體交換參數(shù)的影響

氮素對(duì)葉光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和瞬時(shí)水分利用效率均有極顯著的影響(P<0.01)，水分對(duì)光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率也有極顯著的影響，但二者的交互作用對(duì)所有氣體交換參數(shù)的影響均不顯著(表3)。隨氮肥用量增加，所有氣體交換參數(shù)均逐漸增加，光合速率和氣孔導(dǎo)度表現(xiàn)為N2>N1>N0，蒸騰速率表現(xiàn)為N2=N1>N0，水分利用效率表現(xiàn)為N2>N1=N0；隨水分增加，光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均逐漸增加，且均表現(xiàn)為W2>W1>W0，水分對(duì)瞬時(shí)水分利用效率影響不大(圖2)。

圖2 玉米葉氣體交換參數(shù)隨氮肥和水分水平的變化Fig.2 Changes of leaf gas exchange parameters in corn with different N and water use

表3 氮素和水分對(duì)玉米葉片氣體交換參數(shù)影響的方差分析Table 3 ANOVA of nitrogen and water on leaf gas exchange parameters in corn leaves

2.3 玉米葉片氣體交換參數(shù)與葉片氣孔特征指標(biāo)的關(guān)系

由表4可以看出，不同處理葉光合速率、氣孔導(dǎo)度和上、下表面的氣孔大小，如氣孔長(zhǎng)、氣孔寬和氣孔面積，均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，但與氣孔密度相關(guān)性不顯著；光合速率、氣孔導(dǎo)度和上、下表面的SPI均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，表明不同氮素和水分處理主要通過(guò)影響氣孔大小和氣孔孔徑面積所占比例來(lái)影響氣孔導(dǎo)度和光合速率。由于光合速率、氣孔導(dǎo)度均只與上表面的gsmax呈顯著正相關(guān)，一定程度上弱化了二者與葉gsmax間的相關(guān)性(圖3)。gsmax可以解釋光合速率變異的49.7%和氣孔導(dǎo)度變異的39.7%。

圖3 玉米葉實(shí)測(cè)光合速率、氣孔導(dǎo)度與理論最大氣孔導(dǎo)度的關(guān)系Fig.3 Relationship between measured photosynthetic rate,stomatal conductance and theoretical gsmax in corn leaves

表4 玉米葉片氣體交換參數(shù)與氣孔特征間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 4 Pearson correlation coefficients between measured gas exchange parameters and adaxial and abaxial stomatal traits in corn leaves

蒸騰速率與上表面氣孔長(zhǎng)、下表面氣孔長(zhǎng)、氣孔寬和氣孔面積呈顯著或極顯著正相關(guān)，但與上、下表面SPI相關(guān)性不顯著，表明影響葉蒸騰速率的主要因素是氣孔大小。WUEi與上表面氣孔密度、氣孔寬、氣孔面積、SPI和gsmax呈顯著正相關(guān)，亦與下表面氣孔寬、SPI和gsmax呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明氣孔密度、氣孔大小及氣孔孔徑面積所占比例都是影響葉WUEi的重要因素。

3 討 論

3.1 玉米氣孔特征對(duì)水分和氮素的可塑性響應(yīng)

本研究中，中度和嚴(yán)重干旱均導(dǎo)致下表面的氣孔密度增大，上、下表面的氣孔長(zhǎng)和氣孔面積均減小(圖1)，與前人研究報(bào)道的干旱導(dǎo)致氣孔密度增加，氣孔大小降低[2-3,9]一致。我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一些研究中報(bào)道的中等干旱下氣孔密度增加，而嚴(yán)重干旱下氣孔密度降低[3]，可能與植物差異、遭受水分脅迫時(shí)期和水分脅迫程度有關(guān)。

除玉米下表面氣孔寬和氣孔面積對(duì)施氮不敏感外，氣孔密度、氣孔大小參數(shù)及SPI均隨施氮水平增加而增加(圖1)，這與前人研究報(bào)道的夏玉米施氮后氣孔密度呈現(xiàn)先降低后增加[7]和擬南芥上隨氮用量增加上表皮氣孔密度顯著降低[8]不一致，而與桉樹(shù)上氣孔密度隨葉氮濃度增加而增加[9]，及我國(guó)南方木本植物氣孔密度和SPI隨施氮水平增加而增加[10]一致。Bowsher等[15]研究得出,植物對(duì)養(yǎng)分添加的形態(tài)可塑性反應(yīng)與植物所處環(huán)境的養(yǎng)分狀況有關(guān),生長(zhǎng)在養(yǎng)分含量較高環(huán)境中的植物一般采用積極的生長(zhǎng)策略,而生長(zhǎng)在養(yǎng)分匱乏區(qū)域的植物則反應(yīng)相對(duì)保守,生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。玉米氣孔特征對(duì)氮素表現(xiàn)出高的可塑性反應(yīng)可能與其快速生長(zhǎng)策略有關(guān)。

比較氣孔特征對(duì)氮肥和水分供給的響應(yīng)，對(duì)葉片上表面而言，施氮顯著影響所有氣孔參數(shù)，而水分僅影響影響氣孔長(zhǎng)和氣孔面積；對(duì)下表面而言，施氮顯著影響氣孔密度、氣孔長(zhǎng)、SPI和gsmax，而水分僅影響氣孔密度、氣孔長(zhǎng)和氣孔面積(表1)，氮素對(duì)氣孔特征的影響大于水分。本研究中，由于氮素處理是從播種時(shí)即開(kāi)始處理，持續(xù)60余天，而水分處理是在播種后42 d開(kāi)始，僅持續(xù)3周，因而氮素處理對(duì)氣孔特征的影響程度大于水分處理，且對(duì)多數(shù)氣孔特征指標(biāo)而言二者間并無(wú)顯著交互作用。氮素和水分虧缺對(duì)氣孔特征的影響大小依賴(lài)于實(shí)際的葉發(fā)育期。氮素對(duì)早期保衛(wèi)細(xì)胞發(fā)育的養(yǎng)分限制可能導(dǎo)致低的氣孔密度[16-17]，而水分虧缺由于在后期，其主要通過(guò)葉面積減小，導(dǎo)致氣孔密度增大。

物種間和同一物種大的氣候梯度下氣孔密度和氣孔大小(如氣孔長(zhǎng)和氣孔面積)間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系[9-10,14]，這種權(quán)衡關(guān)系反映葉片氣孔形態(tài)的可塑性和對(duì)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)性。隨水分供應(yīng)增加，氣孔密度(上表面)降低，氣孔大小(氣孔長(zhǎng)、氣孔面積)增大，氣孔密度和氣孔大小間存在權(quán)衡關(guān)系；但隨氮肥水平增加，氣孔密度和氣孔大小均增加，二者之間并未出現(xiàn)權(quán)衡關(guān)系。高蒸汽壓虧缺下，西紅柿和甜椒的氣孔密度和氣孔大小均降低[18]，因而氣孔密度和氣孔大小關(guān)系可能受物種和環(huán)境條件的復(fù)雜影響。

3.2 玉米氣體交換參數(shù)和氣孔特征間的關(guān)系

施氮和灌水顯著增加了光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，施氮亦增加了水分利用效率，但灌水對(duì)水分利用效率影響不大(圖2)，這可能與兩種資源脅迫的程度有關(guān)。本研究中，光合速率和氣孔導(dǎo)度的提高主要依賴(lài)于氣孔大小(氣孔長(zhǎng)、氣孔寬和氣孔面積)和SPI提高，蒸騰速率主要決定于上、下表面的氣孔大小(表4)。無(wú)論是光合速率、氣孔導(dǎo)度還是蒸騰速率，均與氣孔密度關(guān)系不大，這與前人研究中發(fā)現(xiàn)的光合速率、氣孔導(dǎo)度和氣孔密度呈正相關(guān)[19-21]不一致，可能與本研究中氮嚴(yán)重虧缺影響氣孔分化或?qū)θ~肉細(xì)胞光合活性的嚴(yán)重限制有關(guān)。

水分利用效率反映了植物光合生產(chǎn)與蒸騰耗水特性之間的關(guān)系，高水分利用效率是植物適應(yīng)干旱的一種重要生理對(duì)策，因而甄別影響水分利用效率的關(guān)鍵因素對(duì)其調(diào)控就尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)水分利用效率與氣孔密度、氣孔大小和SPI均有關(guān)(表4)，在不同水分、CO2和磷處理的豌豆[22]和不同灌溉方式和氮肥處理的馬鈴薯[23]上，均發(fā)現(xiàn)氣孔密度與碳同位素辨別力(Δ13C)呈顯著負(fù)相關(guān)，從而證實(shí)提高氣孔密度可以增加水分利用效率。在擬南芥不同品系上，碳同位素表征的水分利用效率與氣孔大小呈正相關(guān)[24]，不同研究中水分利用效率和氣孔特征間的關(guān)系可能受植物與外界環(huán)境差異的復(fù)雜影響，對(duì)此值得從形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)多角度探明影響水分利用效率的關(guān)鍵因素。

4 結(jié) 論

1)施氮顯著影響玉米葉上、下表面的氣孔密度、氣孔長(zhǎng)、SPI和gsmax及上表面的氣孔長(zhǎng)及氣孔面積。隨水分供應(yīng)增加，下表面的氣孔密度降低，上、下表面的氣孔長(zhǎng)和氣孔面積增加，水分對(duì)其他氣孔特征影響不大。氮處理對(duì)氣孔特征的影響要大于水分處理。

2)上表面的氣孔面積與氣孔長(zhǎng)、氣孔寬呈顯著正相關(guān)，下表面的氣孔面積僅與氣孔長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)；上、下表面的氣孔大小(氣孔長(zhǎng)、氣孔寬和氣孔面積)與氣孔密度間無(wú)顯著相關(guān)性。上、下表面的SPI與氣孔密度、氣孔大小存在顯著相關(guān)性，上、下表面的gsmax均與氣孔密度、氣孔寬和SPI呈顯著正相關(guān)。

3)光合速率和氣孔導(dǎo)度主要決定于上、下表面的氣孔大小和SPI，蒸騰速率主要決定于上、下表面的氣孔大小，而瞬時(shí)水分利用效率決定于上表面氣孔密度、上下表面氣孔大小和SPI。