高偉城，王小平*，黃建軍，王二麗，謝偉容，黃醒梅，林小晴，陳羽晴

1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000；2.漳州市醫(yī)院，福建 漳州 363000

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉[1]，具有祛痰、止咳、抗炎、抗肺纖維化等功效[2]，臨床應(yīng)用廣泛。以“咳嗽”和“枇杷葉”為關(guān)鍵詞在中國中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫（http://cintmed.cintcm.com/cintmed/）中進行檢索，有70 首方劑。其中，三萜酸類成分是其重要藥效成分[3]，主要為熊果酸、齊墩果酸及以其為母體的衍生物[4]。

福建省云霄縣有“中國枇杷之鄉(xiāng)”的稱號，枇杷種植面積達0.93 萬hm2，而果農(nóng)常把枇杷葉當(dāng)作柴火燒掉或不處理。若能進行資源再利用，不僅可以給當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收，也可為云霄區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展帶來新動力[5-6]。

本研究對云霄枇杷葉三萜酸類成分進行提取工藝研究，以期對枇杷葉進行資源開發(fā)利用，為進一步研究開發(fā)枇杷葉相關(guān)產(chǎn)品提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀；TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Mettler-Toledo XSE205DU 型電子分析天平、OHAUS PX224ZH/E 型電子分析天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；FST-Ⅲ-10 型精密超純水機（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）；XL-10B型中藥粉碎機（廣州旭朗機械設(shè)備有限公司）；CW-2000A 型超聲-微波協(xié)同萃取反應(yīng)儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）；KQ5200 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZKF040 型真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品熊果酸（批號：MUST-19062710，純度≥98.46%）、齊墩果酸（批號：MUST-19032706，純度≥98.46%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；香草醛、乙酸銨（西隴科學(xué)股份有限公司，分析純）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司，分析純）；乙醇（食用級）。

枇杷葉（早鐘，批號：20201015）采自云霄縣火田鎮(zhèn)，2020 年10 月采收。經(jīng)漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院中藥教研室王小平教授鑒定為薔薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 枇杷葉預(yù)處理

將新鮮采收的枇杷葉用沸水潬3 min左右，取出晾干，再用鼓風(fēng)干燥箱70 ℃烘干，備用。

2.2 枇杷葉干浸膏制備

將枇杷葉切成寬絲（9～10 mm），稱取50 g，以適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間、提取次數(shù)進行回流提取，濃縮提取液，真空減壓干燥，即得，備用。

2.3 考察指標(biāo)

以干浸膏得率、總?cè)扑岷?、齊墩果酸及熊果酸的含量為評價參數(shù)，設(shè)置權(quán)重系數(shù)分別為20%、40%、40%，進行無量綱化加權(quán)處理，得綜合評價值。

2.4 總?cè)扑岷繙y定

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸對照品5.22 mg，置于50 mL 量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為104.4 μg·mL-1的對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 稱取干浸膏0.01 g，加甲醇超聲溶解并定容至25 mL，即得，備用。

2.4.3 測定波長的選擇 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1 mL于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴將溶劑蒸干，加入新配制5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，再加入的高氯酸0.8 mL，充分搖勻，在60 ℃的水浴中加熱15 min，立即取出，放入冷水中冷卻至室溫，再加入冰醋酸5 mL，搖勻。在400～800 nm 波長進行掃描，以甲醇試劑作參比。結(jié)果表明，供試品溶液和對照品溶液在550 nm 處均有最大吸收，空白干擾最小，故選550 nm作為測定波長。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取熊果酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴加熱蒸干溶劑，依次加入新配制5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，充分搖勻，在60 ℃的水浴中加熱15 min，立即取出，放入冷水中冷卻至室溫，再加入冰醋酸5 mL，搖勻。以0 mL 作空白對照，在550 nm 波長處測定吸光度（A）[7]。以A為縱坐標(biāo)（Y），熊果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=0.050 1X-0.020 4，r=0.999 1，結(jié)果表明，熊果酸在3.48～17.4 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗 準(zhǔn)確吸取熊果酸對照品溶液1 mL，按照2.4.4項下方法連續(xù)測定6次，測得A的RSD為0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗 準(zhǔn)確吸取6份枇杷葉寬絲（9～10 mm）各50 g，按照2.4.2項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1 mL，按照2.4.4 項下方法測定，測得含量的RSD 為1.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 準(zhǔn)確吸取6 份供試品溶液1 mL，于室溫放置0、2、4、8、16、24 h，按照2.4.4 項下方法測定A，測得A的RSD 為1.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率試驗 準(zhǔn)確稱取6 份枇杷葉寬絲（9～10 mm）各25 g，按照2.4.2 項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液1 mL 置具塞試管中，再分別加入熊果酸對照品溶液0.5 mL，按照2.4.4 項下方法測定，平均加樣回收率為98.62%，RSD為1.76%。

2.4.9 樣品溶液測定 精密吸取供試品溶液1 mL，按照2.4.4 項下方法進行測定，按公式（1）計算總?cè)扑豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)（K）。

式中，C為供試品溶液質(zhì)量濃度，L為稱取干浸膏的質(zhì)量，M為總干浸膏質(zhì)量。

2.5 齊墩果酸和熊果酸的含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack Scepter HDC18-80（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨溶液（67∶12∶21）；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃。色譜圖見圖1。

圖1 枇杷葉供試品溶液與混合對照品溶液的HPLC圖

2.5.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取熊果酸、齊墩果酸對照品適量，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成熊果酸492.5 μg·mL-1、齊墩果酸125 μg·mL-1的混合對照品儲備溶液，備用。

2.5.3 供試品溶液的制備 稱取干浸膏0.09 g，加甲醇超聲溶解并定容至25 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、2、3、4、5、10 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，分別精密吸取20 μL，按2.5.1 項下色譜條件測定。以進樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果熊果酸線性回歸方程：Y=668.26X+92.065，r=0.999 6，在0.985～4.925 μg 峰面積與進樣量呈良好線性關(guān)系，齊墩果酸線性回歸方程：Y=722.07X+75.524，r=0.999 5，在0.25～1.25 μg 峰面積與進樣量呈良好線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗 精密吸取同一質(zhì)量濃度的混合對照品溶液20 μL，重復(fù)進樣測定6次，計算熊果酸的峰面積RSD 為1.07%，齊墩果酸的峰面積RSD 為1.01%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同批次枇杷葉（批號：20201015）50 g，按2.5.3項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、8、16、24 h 后分別取樣測定，結(jié)果熊果酸的峰面積RSD 為1.62%，齊墩果酸的峰面積RSD 為1.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗 精密稱取6 份同批次枇杷葉（批號：20201015）50 g，按2.5.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.997（RSD為1.06%）、7.667 mg·g－1（RSD為1.75%）。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取6 份已知含量的枇杷葉25 g，每份分別精密加入123.13 μg·mL-1的熊果酸、31.25 μg·mL-1的齊墩果酸對照品溶液1 mL，按2.5.3 項下方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果熊果酸平均回收率為99.61%，RSD 為1.22%；齊墩果酸平均回收率為99.11%，RSD為1.92%。

2.5.9 樣品含量測定 精密移取2.5.3 項下供試品溶液，按2.5.1 項下色譜條件進樣，每個樣品平行測定3 次，采用外標(biāo)法計算樣品中熊果酸、齊墩果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.6 提取方法篩選

查閱相關(guān)文獻[3,8-9]，本實驗對比了回流提取法、超聲提取法和超聲微波協(xié)同提取法，共同方法為50 g枇杷葉，80%乙醇，液料比10∶1，提取3 次。結(jié)果表明，在不同提取條件下，前2次提取得到的枇杷葉干浸膏得率、總?cè)坪俊R墩果酸及熊果酸含量可達到90%以上；超聲提取與超聲微波協(xié)同提取兩者提取效果相當(dāng)，相對來說超聲微波協(xié)同提取更省時，而回流提取效果在3 個方法中最好（表1）。從經(jīng)濟性、安全性角度，回流提取更符合工業(yè)化生產(chǎn)實際。

表1 枇杷葉提取工藝提取方法的篩選

2.7 單因素試驗

按照表2 的設(shè)計條件每組進行回流提取，考察各因素下干浸膏得率、總?cè)扑岷?、齊墩果酸和熊果酸含量的變化影響。見圖2。

圖2 枇杷葉提取工藝單因素的試驗結(jié)果

表2 枇杷葉提取工藝單因素試驗設(shè)計

結(jié)果表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提升，干浸膏得率、總?cè)扑岷俊R墩果酸和熊果酸含量有明顯的增加，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～80%時增加顯著，80%～95%時增加稍緩和，這與三萜類成分極性低相符合。當(dāng)液料比為14∶1 時，干浸膏得率、總?cè)坪俊R墩果酸和熊果酸含量開始有明顯增加。飲片切絲寬度，對干浸膏得率、總?cè)坪?、齊墩果酸和熊果酸含量影響較小。隨著提取時間延長，干浸膏得率、總?cè)坪俊R墩果酸和熊果酸含量有緩慢增加趨勢。

2.8 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗

2.8.1 響應(yīng)面法設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計四因素三水平試驗方案，見表3。選擇中心點重復(fù)試驗5次，得交互作用試驗29 組，以干浸膏得率、總?cè)扑岷?、齊墩果酸及熊果酸的含量進行無量綱化處理得到的綜合評價值為考察指標(biāo)，進行試驗，結(jié)果見表4。

表3 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗因素水平

表4 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.8.2 模型建立及其顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，得到二次多元回歸方程：Y=0.87-0.026A+0.021B+0.032C+0.065D+0.020AB-0.029AC -0.042AD+0.012BC -4.250×10-3BD+0.019CD+4.792×10-3A2-0.011B2-0.030C2-0.068D2。方差分析結(jié)果見表5，結(jié)果表明，模型的P＜0.001，回歸模型極顯著；失擬項P＞0.05，顯示非試驗因素對試驗結(jié)果影響不大；決定系數(shù)0.921 6＞0.6，模型擬合較高；變異系數(shù)為3.35%，試驗精確度良好；信噪比（S/N）為12.402＞4，表明可用模型對三萜酸的提取進行分析和預(yù)測。由回歸模型顯著性分析可知，B 和C2顯著（P＜0.05），A、C 和AD 非常顯著（P＜0.01），D 和D2極顯著（P＜0.001)，其余項均不顯著。4 個因素對三萜酸的提取影響順序為D＞C＞A＞B。

表5 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果

2.8.3 兩兩因素交互作用分析 枇杷葉提取兩兩因素之間交互作用的響應(yīng)面3D圖與等高線圖，見圖3?？梢钥闯?，提取次數(shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)2 個因素的交互影響作用最強，隨著提取次數(shù)增加，綜合評價值明顯升高，且等高線呈橢圓形。其次是提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料比與提取次數(shù)影響最小。

圖3 枇杷葉提取工藝響應(yīng)面試驗各因素交互作用對綜合評價的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.8.4 提取條件的優(yōu)化及模型驗證結(jié)果 由響應(yīng)面法得出的枇杷葉三萜酸的最佳提取工藝條件為95%乙醇，液料比16∶1，提取時間2.31 h，提取數(shù)2.18次，理論綜合評價值為0.881?？紤]實際操作，將最佳工藝條件修正為95%乙醇，液料比16∶1，提取時間2 h，提取數(shù)2 次，在此條件下平行試驗3 次，得枇杷葉干浸膏得率為23.60%，總?cè)扑豳|(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.71%，齊墩果酸與熊果酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.94%［《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規(guī)定不低于0.7%］，綜合評價值的平均值為0.838（RSD 為2.54%），比模型綜合評價值低0.043，這與實際修正提取時間、提取次數(shù)有關(guān)，因兩者對結(jié)果有顯著影響，表明Design-Expert 8.0.6 建立的模型的預(yù)測具有良好的準(zhǔn)確率，可以很好地優(yōu)化枇杷葉中三萜酸類成分的提取工藝。

3 討論

3.1 提取方法篩選

本實驗比較了回流提取、超聲提取及超聲微波協(xié)同提取，結(jié)果表明，超聲提取和超聲微波協(xié)同提取效果相當(dāng)，超聲微波提取更省時，回流提取效果更好?；亓魈崛》檄h(huán)境友好的理念，操作簡單、經(jīng)濟安全、大規(guī)模化生產(chǎn)投資較少，而且為后續(xù)純化工藝帶來了便捷[8]。

3.2 測定波長、流動相和色譜柱選擇

齊墩果酸與熊果酸兩者是同分異構(gòu)體，分離難，在查文獻、借鑒前人的研究結(jié)果基礎(chǔ)上[3,9-12]，分別對190、208、210 nm 進行檢測波長篩選，最終確定210 nm，該波長下齊墩果酸與熊果酸吸收峰峰形較好。分別對乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨溶液、乙腈-水、甲醇-水及乙腈-磷酸水的不同比例進行考察，也考察了不同型號的色譜柱如Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），最后選擇Shim-pack Scepter HDC18-80 色譜柱，乙腈-甲醇-0.5%乙酸銨溶液，可以將兩者較好分離。

3.3 飲片切制寬度

中藥飲片切絲，適用于皮類、葉類和較薄的果皮類等藥材?！吨袊幍洹?020年版（四部）0213炮制通則，飲片切絲，細絲2～3 mm，寬絲5～10 mm。本實驗考察了細絲與寬絲對三萜酸的提取率影響，結(jié)果表明，細絲與寬絲對三萜酸的提取率影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與市場上枇杷葉飲片切制規(guī)格寬絲（9～10 mm）相符合。

3.4 提取條件的優(yōu)化

查閱有關(guān)枇杷葉三萜酸提取工藝的文獻[3,8]，有14.4 倍量82%乙醇，提取2 次，每次155 min，三萜酸提取率為3.38%，本實驗三萜酸提取率為5.71%，獲得較高的三萜酸提取率。但乙醇體積分?jǐn)?shù)高，液料比為16∶1，溶劑用量相對大一些，也相應(yīng)增加工業(yè)生產(chǎn)安全性風(fēng)險及成本。