胡茹英，劉效栓，肖正國，李季文，李喜香，王雪梅

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，增生形成血管翳，侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。遺傳、環(huán)境和生活方式是RA的主要影響因素[1-2]。臨床對于RA 仍無較滿意的治療手段，目前，以甲氨蝶呤為首選策略[3]。清熱除濕止痛方由忍冬藤、絡(luò)石藤、秦艽、桑枝、防己、牛膝、地龍、木瓜、薏苡仁、槲寄生10 味中藥組成，臨床應(yīng)用效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)采用層次分析（AHP）-熵權(quán)法結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)選出清熱除濕止痛液的最佳提取工藝，旨在將清熱除濕止痛方制備為安全有效、質(zhì)量可控、使用方便的新制劑。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（1525 型泵、717 型進(jìn)樣器、2487 型雙通道紫外檢測器，Waters 公司）；CPA-225D 型十萬分之一電子天平、BS224S 型萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；98-1-B 型電子恒溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；SB-3200DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ZXFD-A5140 型全自動新型鼓風(fēng)干燥箱微波真空干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；HWS-24 型恒溫水浴鍋（上海齊欣儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

對照品綠原酸（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y22M8K36544，純度≥98%）；龍膽苦苷（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號：190513，純度≥98%）；絡(luò)石苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：111858-201603，純度≥99.5%）；乙腈、甲醇均為色譜純；水為娃哈哈礦泉水。

絡(luò)石藤（批號：171102）、槲寄生（批號：1903040）、秦艽（批號：180902）、薏苡仁（批號：181125）、防己（批號：180801）、木瓜（批號：1712001）、牛膝（批號：180819）、忍冬藤（批號：190202）、桑枝（批號：180301）、地龍（批號：2018001）均購于甘肅省康樂中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李喜香主任藥師鑒定均符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液的制備

按原處方比例稱取忍冬藤、絡(luò)石藤、秦艽、桑枝、防己、牛膝、地龍、木瓜、薏苡仁、槲寄生10味中藥，共65 g，混勻后，按一定料液比加水浸泡，首次煎煮前補(bǔ)足飲片吸水量，煎煮3 次，濾過。合并濾液，濃縮至65 mL，即得清熱除濕止痛液水提液，冷藏備用。

2.2 高效液相色譜法（HPLC）測定含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry Shieid?RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.25%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，6%～10%A；10～30 min，10%A；30～35 min，10%～23%A；35～50 min，23%A；50～55 min，23%～6%A）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：室溫；檢測波長：280 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷對照品適量，分別置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為1.26、1.03、1.17 mg·mL-1的對照品儲備液。分別精密吸取上述各儲備液0.485、2.500、1.000 mL至5 mL棕色量瓶中，配制成分別含綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷0.122、0.515、0.234 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密移取2.1 項(xiàng)下清熱除濕止痛液水提液樣品5 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，分次加入甲醇，超聲溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，定容至刻度，搖勻，靜置，移取適量上清液稀釋4 倍，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，見圖1。

圖1 清熱除濕止痛液中3個指標(biāo)成分混合對照品溶液及供試品溶液的HPLC圖

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取2.2.2 項(xiàng)下的混合對照品溶液適量，分別進(jìn)樣2、4、6、10、12、16 μL，記錄峰面積，計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 清熱除濕止痛液中3個指標(biāo)成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2 項(xiàng)下的混合對照品溶液10 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。測得綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷峰面積RSD 分別為1.227%、0.631%、0.690%，3 種成分的峰面積RSD 均小于3%，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣10 μL測定，記錄綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷的峰面積，結(jié)果綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷峰面積RSD 分別為0.83%、0.45%、1.00%，3 種成分的峰面積RSD 均小于3%，表示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，精密吸取10 μL，并按照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷3 種成分含量的RSD 分別為0.87%、1.79%、0.92%，均小于3%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已測定各成分含量的清熱除濕止痛液提取液6 份，每份精密稱定5 mL，分別加入已知含量的對照品溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，所得結(jié)果為綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷的平均回收率分別為97.61%、101.40%、98.25%，RSD 分別為0.12%、0.02%、0.05%，加樣回收率符合要求。

2.3 干膏得率的測定

精密量取2.1 項(xiàng)下濃縮液5 mL，置已干燥至質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，按照《中國藥典》2020 年版（四部）通則0831 測定，按公式（1）計(jì)算干膏得率。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 熵權(quán)法計(jì)算權(quán)重 信息熵法是將每個評價(jià)指標(biāo)作為1 個隨機(jī)變量，計(jì)算該指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)，其取值變異程度越大、越無序，提供的信息量越多，該指標(biāo)就越重要；反之，該指標(biāo)就越不重要[4-9]。用熵權(quán)法確定權(quán)重的計(jì)算步驟如下。

1）原始數(shù)據(jù)矩陣歸一化，建立原始評價(jià)指標(biāo)矩陣。設(shè)m個評價(jià)指標(biāo)，n個評價(jià)對象的原始數(shù)據(jù)矩陣為A=（aij）mn，對其歸一化后得到R=（Xij）mn，對大者為優(yōu)的指標(biāo)而言，按照公式（2）歸一化。

式中，Xij表示i次試驗(yàn)時(shí)第j個評價(jià)指標(biāo)的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

2）將原始數(shù)據(jù)陣（Xij）mn轉(zhuǎn)換為概率矩陣（Pij）mn；在信息熵公式中Pi為某個信息的概率，滿足0≤Pi≤1，必須先對矩陣（Xij）mn做歸一化處理，經(jīng)處理后的矩陣可視為指標(biāo)的概率矩陣。其中Pij表示第j次試驗(yàn)在第i個評價(jià)指標(biāo)下的概率。

3）計(jì)算指標(biāo)的熵值，確定第i個評價(jià)指標(biāo)的信息熵（Hi）。

4）計(jì)算指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)（Wj）。

由公式（5）可知，當(dāng)信息熵值越小，熵權(quán)系數(shù)越大，即當(dāng)Xij值相差越大，表明該指標(biāo)傳遞的信息量越多，作用越大，其權(quán)重值越大。結(jié)果見表2。

表2 清熱除濕止痛液中3個指標(biāo)成分及干膏得率權(quán)重系數(shù)

2.4.2 AHP 法計(jì)算權(quán)重 AHP 法又名層次分析法，是主觀確定權(quán)重的方法。依據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷并比較各指標(biāo)的先后順序，進(jìn)而構(gòu)造判斷矩陣，建立層次結(jié)構(gòu)模型，再用軟件計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重[10-14]。根據(jù)提取液中各指標(biāo)成分的含量，本實(shí)驗(yàn)將綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷及干膏得率的優(yōu)先順序作為權(quán)重指標(biāo)予以量化，構(gòu)建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣。各指標(biāo)的優(yōu)先順序?yàn)辇埬懣嘬眨揪G原酸＞絡(luò)石苷＞干膏得率，并賦予各項(xiàng)指標(biāo)相對評分。各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)層次分析后得到的權(quán)重系數(shù)結(jié)果見表3。

表3 清熱除濕止痛液中3個指標(biāo)成分及干膏得率成對比較的判斷優(yōu)先矩陣

根據(jù)測定結(jié)果，運(yùn)用yaahp 軟件處理得到龍膽苦苷含量、綠原酸含量、絡(luò)石苷含量、干膏得率4項(xiàng)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.585 2、0.225 8、0.110 6、0.078 4，根據(jù)公式CR=CI/RI（RI：隨機(jī)一致性指標(biāo)），CR=0.059 2＜0.1，即指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣具有良好的一致性，權(quán)重系數(shù)有效。

2.4.3 AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合權(quán)重 通過熵權(quán)法和AHP法[17-19]分別計(jì)算得到綠原酸、龍膽苦苷、絡(luò)石苷及干膏得率的復(fù)合權(quán)重，按公式（6）計(jì)算4種指標(biāo)的復(fù)合權(quán)重（ωj）分別為0.16、0.76、0.05、0.03。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選清熱除濕止痛液提取工藝

2.5.1 星點(diǎn)-效應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 對提取時(shí)間（A）、加水量（B）、浸泡時(shí)間（C）及提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，確定提取數(shù)為3 次，其次結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15-22]，確定提取時(shí)間30～150 min，加水量4～12 倍，浸泡時(shí)間15～60 min。分別按處方量稱取中藥65 g，置于圓底燒瓶中，量取適量蒸餾水進(jìn)行浸泡，按表4中參數(shù)進(jìn)行提取。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定3 種成分的含量，按公式（7）計(jì)算4 種指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)綜合評分值（Yj），即因變量。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 清熱除濕止痛液提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.5.2 數(shù)據(jù)處理與分析 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行2次多元回歸擬合分析（表5），得到提取時(shí)間、加水量、浸泡時(shí)間與綜合評分之間的2 次多元回歸模型方程：Y=85.98-2.83A+4.50B-4.63C+0.57AB+4.63AC+1.96BC-7.99A2-1.83B2-4.22C2。由方差分析可知，以綜合評分為響應(yīng)值時(shí)P＜0.05，表明此回歸方程顯著，而失擬項(xiàng)P=0.327 5，不顯著，表示未知因素對實(shí)驗(yàn)干擾性小。由F值大小看出，各因素對提取工藝影響的主次順序?yàn)镃＞B＞A。利用Design-Expert 8.0.6.1 軟件得到二次回歸方程等高線及響應(yīng)曲面圖，評價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互強(qiáng)度，來確定最佳提取工藝參數(shù)。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，越趨向橢圓表示交互作用越強(qiáng)，越趨向圓形則交互作用越弱，結(jié)果見圖2。根據(jù)模型擬合結(jié)果，預(yù)測最優(yōu)提取工藝為提取105 min，浸泡52.5 min，加水量9倍，綜合評分84.10。

圖2 各影響因素間的交互作用對清熱除濕止痛液提取率的響應(yīng)面圖及等高線圖

表5 清熱除濕止痛液提取工藝星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法試驗(yàn)回歸模型方差分析結(jié)果

2.6 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)軟件擬合的最優(yōu)提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，按處方量稱取中藥65 g，平行3 份，置于圓底燒瓶中，按優(yōu)選的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行提取，考慮到實(shí)際操作情況，將預(yù)測的最優(yōu)工藝參數(shù)微調(diào)為煎煮105 min，浸泡53 min，加9 倍量的水下于回流提取裝置中提取，結(jié)果見表6。驗(yàn)證值與預(yù)測值之間的RSD 為1.33%，模型預(yù)測性好，說明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法適用于清熱除濕止痛液的提取工藝優(yōu)化，其建立的提取工藝穩(wěn)定、重復(fù)性較好、可操作性強(qiáng)，具一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表6 清熱除濕止痛液的提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 溶劑的選擇

因提取液中龍膽苦苷含量較高，綠原酸及絡(luò)石苷含量較低，故為了使其平衡，采用70%乙醇、無水乙醇溶解樣品，發(fā)現(xiàn)含乙醇樣品色譜圖雜質(zhì)較多；經(jīng)正丁醇萃取結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠原酸的含量并未因富集而大幅增加，龍膽苦苷及絡(luò)石苷的含量變化不明顯；加少量酸溶液龍膽苦苷溶解效果也一般。最終經(jīng)比較選擇用甲醇超聲溶解處理的樣品，較其他方法綠原酸、龍膽苦苷及絡(luò)石苷各指標(biāo)成分含量均較高，色譜圖峰形好且分離度較佳。

3.2 檢測波長的選擇

經(jīng)全波長掃描，分別比較254、270、300、320 nm等波長下色譜圖，發(fā)現(xiàn)在254 nm 附近龍膽苦苷吸收較好，絡(luò)石苷峰太低，在320 nm 附近綠原酸吸收較好，龍膽苦苷色譜峰吸收不明顯，最終選擇280 nm。

3.3 流動相選擇

實(shí)驗(yàn)過程中分別以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等流動相進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)色譜峰出現(xiàn)分離不好、拖尾等現(xiàn)象，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.25%磷酸水溶液梯度洗脫，色譜峰較好。