黃 琦，吳婧婧，彭 瑤，李 娜，王年飛

結(jié)直腸癌是胃腸道常見(jiàn)的腫瘤之一。近年，全球結(jié)直腸癌發(fā)病率、病死率顯著提升。2020年全球結(jié)直腸癌總發(fā)病率上升至第3位，病死率上升至全球癌癥死亡原因的第2位[1]。因此，發(fā)現(xiàn)新的介導(dǎo)結(jié)直腸癌惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)控分子有望為控制結(jié)直腸癌的發(fā)展提供靶點(diǎn)，對(duì)提高結(jié)直腸癌患者的生存具有重要的臨床價(jià)值，也是亟待解決的問(wèn)題。有研究顯示，腫瘤代謝過(guò)程的干預(yù)是實(shí)現(xiàn)腫瘤防治的新手段，具有較好的抑制效果[2-3]。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的LYRM2分子可通過(guò)Akt-LYRM2-Comlplex Ⅰ代謝軸在結(jié)直腸癌細(xì)胞氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)代謝中發(fā)揮重要作用[4]。因此，本文著重探討LYRM2對(duì)結(jié)腸癌糖酵解代謝的調(diào)控機(jī)制，為L(zhǎng)YRM2作為結(jié)腸癌的潛在治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。LYRM2過(guò)表達(dá)載體L2HA(對(duì)照為CHA載體)和LYRM2干擾載體SH1KD(對(duì)照為GPH載體)及相應(yīng)的慢病毒顆粒購(gòu)自上海英為信公司(因LYRM2抗體效果不佳，構(gòu)建L2HA、CHA載體中加入HA標(biāo)簽便于蛋白水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功，CHA為帶有HA標(biāo)簽的對(duì)照空載體，GPH為對(duì)照空載體)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海李記公司；Transwell試劑盒購(gòu)自北京康寧公司；Seahorse XF糖酵解壓力測(cè)試試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；細(xì)胞乳酸含量檢測(cè)試劑盒、代謝酶活性檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2 腫瘤細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RKO細(xì)胞以2×105個(gè)/孔鋪至24孔板中，細(xì)胞匯合度約50%。按病毒轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。SH1KD ShRNA序列：5′-TGATGATTACT CAAGGCAATA-3′。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖按2 000個(gè)/孔的細(xì)胞量重復(fù)接種至6塊96孔板中，更換10 μL CCK-8+100 μL新鮮培養(yǎng)基的混合液(避免產(chǎn)生氣泡)，680型酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值。每24 h檢測(cè)1塊96孔板，連續(xù)檢測(cè)6天。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力劃痕實(shí)驗(yàn)：將5×106個(gè)/孔細(xì)胞接種至6孔板中，待匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，移除培養(yǎng)基，超凈臺(tái)中用200 μL的移液槍頭劃3條直線，分別于0 h和培養(yǎng)48 h后拍照。Transwell實(shí)驗(yàn)：基質(zhì)膠和無(wú)血清培養(yǎng)基按1 ∶5稀釋、混勻(冰浴上操作)，取100 μL于上室，37 ℃孵育4～5 h至凝固。取100 μL密度為1×104/mL重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞鋪于上室，下室加入含15%FBS的培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h。經(jīng)10%中性福爾馬林固定，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗2次，棉棒輕柔擦除小室上表面細(xì)胞。顯微鏡觀察小室下層穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野。

1.5 海馬(Seahorse)細(xì)胞能量檢測(cè)按(1.0～1.5)×104個(gè)/孔細(xì)胞種植于海馬細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約80 μL，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。每孔加入200 μL校正液到Sensor Cartridge中，于無(wú)CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中水化過(guò)夜。更換培養(yǎng)基，加入基礎(chǔ)測(cè)試液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，最終維持每孔175 μL，于無(wú)CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。配制檢測(cè)過(guò)程中需加入的藥物：10 mmol/L 葡萄糖、1 μmol/L寡霉素、50 mmol/L 2-DG。將矯正后的Cartridge板每個(gè)加藥孔中加入相應(yīng)藥物25 μL。機(jī)器中矯正平衡30 min后運(yùn)行檢測(cè)。完成后計(jì)數(shù)各孔細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)化最終檢測(cè)結(jié)果，得到各組細(xì)胞糖酵解代謝水平。進(jìn)一步基于Wave軟件轉(zhuǎn)化、計(jì)算得出各組細(xì)胞ATP含量(單位定義為每分鐘104個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的ATP含量)。

1.6 細(xì)胞乳酸含量檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書溶解、配制各試劑。按50×104個(gè)細(xì)胞：1 mL提取液混勻細(xì)胞，冰浴超聲波破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000g離心10 min后取上清。按試劑盒說(shuō)明書順序加樣各試劑后，于分光光度計(jì)檢測(cè)、計(jì)算細(xì)胞乳酸含量，具體溶劑配制，計(jì)算公式參考說(shuō)明書，單位定義為104個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)生乳酸量。

1.7 細(xì)胞代謝酶活性檢測(cè)HK2、PK、PHK、LDH按試劑盒說(shuō)明書溶解、配制各試劑。收集細(xì)胞至離心管中，按50×104細(xì)胞：1 mL提取液混勻細(xì)胞，冰浴超聲波破碎細(xì)胞，4 ℃、8 000g離心10 min后取上清。按說(shuō)明書順序加樣各試劑后于分光光度計(jì)檢測(cè)、計(jì)算各代謝酶活性。具體溶劑配制、計(jì)算公式參考試劑盒說(shuō)明書。單位U定義：每1×104個(gè)細(xì)胞每分鐘生成1 nmoL NADPH定義為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果

2.1 LYRM2過(guò)表達(dá)、敲低結(jié)腸癌細(xì)胞系的構(gòu)建及驗(yàn)證利用LYRM2過(guò)表達(dá)載體L2HA和干擾載體SH1KD構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)LYRM2過(guò)表達(dá)及敲低結(jié)腸癌細(xì)胞系。mRNA表達(dá)驗(yàn)證：轉(zhuǎn)染L2HA的RKO細(xì)胞LYRM2的mRNA表達(dá)(167.10±3.73)顯著高于對(duì)照CHA細(xì)胞(8.79±0.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；轉(zhuǎn)染SH1KD的RKO細(xì)胞LYRM2的mRNA表達(dá)(1.13±0.11)顯著低于對(duì)照GPH細(xì)胞(11.51±0.82)，敲低率達(dá)90%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1A)。利用HA標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)LYRM2蛋白在RKO細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定表達(dá)(圖1B)。

圖1 LYRM2過(guò)表達(dá)及敲低細(xì)胞系mRNA及蛋白水平驗(yàn)證：A. mRNA表達(dá)；B.蛋白表達(dá)；***P<0.001

2.2 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：LYRM2過(guò)表達(dá)L2HA細(xì)胞的增殖比對(duì)照CHA細(xì)胞顯著加快，尤其在第6天，LYRM2過(guò)表達(dá)L2HA細(xì)胞的吸光度是對(duì)照CHA細(xì)胞的1.53倍[OD450 nm：(1.83±0.08)vs(1.20±0.09)，P<0.001]；第6天LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞的增殖速率比對(duì)照GPH細(xì)胞顯著降低[OD450 nm：(0.82±0.07)vs(1.35±0.09)，P<0.01，圖2]。

圖2 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞增殖的影響：***P<0.001

2.3 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：LYRM2過(guò)表達(dá)L2HA細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)遷移速度顯著高于對(duì)照CHA細(xì)胞，在48 h遷移距離分別為(46.67±0.33) μm和(28.33±0.33) μm；LYRM2敲低的SH1KD細(xì)胞在48 h遷移距離僅約(3.67±0.33) μm，顯著低于對(duì)照GPH細(xì)胞(27.67±0.33) μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3)。

圖3 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)顯示：LYRM2過(guò)表達(dá)的L2HA細(xì)胞侵襲數(shù)目(941.70±39.55)比對(duì)照CHA細(xì)胞(469.30±21.53)明顯增多；LYRM2敲低的SH1KD細(xì)胞侵襲數(shù)目(87.00±9.29)比對(duì)照GPH細(xì)胞(504.30±3.48)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖4)。

圖4 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞糖酵解代謝的影響Seahorse實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同LYRM2表達(dá)RKO細(xì)胞的糖酵解代謝水平；通過(guò)細(xì)胞外酸化率(extra-cellular acidification rate,ECAR)檢測(cè)細(xì)胞的胞外產(chǎn)酸能力，間接顯示糖酵解能力。在不同時(shí)間點(diǎn)分別加入高濃度葡萄糖、寡霉素(ATP合酶抑制劑)和2-DG(糖酵解抑制劑)檢測(cè)在不含葡萄糖或丙酮酸的糖酵解壓力測(cè)試培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的糖酵解水平。結(jié)果顯示：LYRM2過(guò)表達(dá)的L2HA細(xì)胞糖酵解代謝水平顯著高于對(duì)照CHA細(xì)胞，LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞糖酵解水平明顯低于對(duì)照GPH細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖5)。計(jì)算細(xì)胞ATP含量與細(xì)胞糖酵解結(jié)果一致，表現(xiàn)為L(zhǎng)YRM2過(guò)表達(dá)L2HA細(xì)胞ATP含量高(5.68±0.39) pmoL，LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞ATP含量低(1.71±0.09) pmoL，分別與對(duì)照CHA、GPH細(xì)胞相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。各組細(xì)胞內(nèi)乳酸生成量：LYRM2過(guò)表達(dá)L2HA細(xì)胞內(nèi)乳酸含量(66.70±0.87) nmoL比對(duì)照CHA細(xì)胞(10.08±0.12) nmoL明顯增加(P<0.001)，LYRM2敲低SH1KD細(xì)胞內(nèi)乳酸含量(6.02±0.10) nmoL比對(duì)照GPH細(xì)胞(9.65±0.20) nmoL明顯減少(P<0.01，圖6)。

2.6 LYRM2差異表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞代謝酶活性的影響腫瘤組織糖酵解關(guān)鍵代謝酶包括HK、PFK異構(gòu)體和PK。檢測(cè)不同LYRM2表達(dá)的RKO細(xì)胞內(nèi)各糖酵解關(guān)鍵代謝酶活性：LYRM2高表達(dá)L2HA細(xì)胞內(nèi)HK2活性為(0.126±0.002) U，顯著高于對(duì)照CHA細(xì)胞HK2活性(0.098±0.002) U；LYRM2低表達(dá)SH1KD細(xì)胞內(nèi)HK2活性為(0.076±0.002) U，顯著低于對(duì)照GPH細(xì)胞HK2活性(0.099±0.002) U，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。各LYRM2差異表達(dá)的RKO細(xì)胞中，PFK和PK酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

圖5 LYRM2對(duì)RKO細(xì)胞糖酵解代謝的影響：ECAR.細(xì)胞外酸化率

圖6 LYRM2表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)ATP及乳酸生成的影響：A. ATP；B.乳酸；**P<0.01，***P<0.001

3 討論

LYRM2位于6號(hào)染色體，編碼約10.4×103大小的蛋白質(zhì)。目前，有關(guān)LYRM2的研究有限。本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LYRM2蛋白主要定位于線粒體，在結(jié)直腸癌中可通過(guò)與Complex Ⅰ結(jié)合參與Complex Ⅰ活性的調(diào)控，對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞OXPHOS代謝有顯著調(diào)節(jié)作用[4]。

腫瘤細(xì)胞為維持不受控的迅速增殖，需要大量的能量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。糖酵解因其產(chǎn)能速率明顯快于線粒體OXPHOS而被腫瘤細(xì)胞主要利用。當(dāng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解代謝被抑制時(shí)，OXPHOS會(huì)代償性增加以維持腫瘤細(xì)胞的存活及增殖，這種腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性的調(diào)整其代謝途徑的行為稱為腫瘤細(xì)胞的可塑性[5-6]。在氧氣充足的條件下，腫瘤細(xì)胞依賴有氧糖酵解和OXPHOS雙重代謝供能，不同腫瘤細(xì)胞的差異在于糖酵解和OXPHOS產(chǎn)能比例不同，一些腫瘤細(xì)胞中OXPHOS產(chǎn)能普遍超過(guò)40%，在某些特殊細(xì)胞中如MCF-7，這一比例可高達(dá)80%[7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，代謝的改變與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[8]。目前，腫瘤的特征在經(jīng)歷Hanahan等[9]的三代更新后，“細(xì)胞能量代謝的異常調(diào)控”仍作為腫瘤的十四大特征之一，其始終作為腫瘤進(jìn)展中的核心問(wèn)題。研究提示腫瘤代謝過(guò)程的干預(yù)是實(shí)現(xiàn)腫瘤治療新的手段之一，如果能夠同時(shí)性阻斷腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝和OXPHOS代謝可能成為治療腫瘤的新策略。本組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，LYRM2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的OXPHOS代謝具有重要的調(diào)控作用；本組發(fā)現(xiàn)LYRM2表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞糖酵解代謝也具有顯著影響：LYRM2高表達(dá)促進(jìn)RKO細(xì)胞糖酵解代謝，LYRM2低表達(dá)抑制RKO細(xì)胞糖酵解代謝。對(duì)糖酵解代謝過(guò)程限速酶活性分析發(fā)現(xiàn)：LYRM2高表達(dá)增強(qiáng)RKO細(xì)胞內(nèi)HK2活性，LYRM2低表達(dá)抑制RKO細(xì)胞內(nèi)HK2活性。由此，作者推測(cè)LYRM2可能通過(guò)調(diào)控結(jié)腸癌RKO細(xì)胞糖酵解過(guò)程限速酶HK2的活性參與糖酵解代謝調(diào)節(jié)，進(jìn)一步影響RKO細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲表型。

基于LYRM2定位于線粒體，參與線粒體Complex Ⅰ活性調(diào)節(jié)，作者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Complex Ⅰ對(duì)于誘導(dǎo)糖酵解，維持細(xì)胞的增殖存活至關(guān)重要[10-13]。功能正常的Complex Ⅰ可以誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)表達(dá)，繼而激活細(xì)胞糖酵解，并激活相關(guān)致瘤通路。當(dāng)Complex Ⅰ功能失調(diào)，線粒體內(nèi)多種參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶包括α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體等受到影響，線粒體內(nèi)α-酮戊二酸的累積促使HIF-1α的降解，即使在無(wú)氧條件下也不能誘導(dǎo)糖酵解的發(fā)生[10-11]。這可能是LYRM2表達(dá)誘導(dǎo)糖酵解代謝改變的間接機(jī)制。本組通過(guò)酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LYRM2表達(dá)對(duì)糖酵解代謝限速酶HK2的活性產(chǎn)生影響，這可能是LYRM2誘發(fā)糖酵解代謝改變的直接通路，但需進(jìn)一步探索及驗(yàn)證。

圖7 LYRM2表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)代謝酶活性的調(diào)節(jié)：A.HK2；B.PFK；C.PK；***P<0.001，ns.差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

研究顯示結(jié)直腸癌中HK2蛋白水平上調(diào)，與腫瘤大小、侵犯深度、肝臟轉(zhuǎn)移及腫瘤分期等顯著相關(guān)，且HK2高表達(dá)與患者復(fù)發(fā)及總病死率增加密切相關(guān)，HK2高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素[14-15]。靶向HK2的治療已提示具有較好的抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展的效果[16-18]。結(jié)直腸癌細(xì)胞HK2敲低后，細(xì)胞的乳酸生成量、增殖速率及遷移能力均明顯下降，同時(shí)對(duì)5-氟尿嘧啶化療敏感性增加[19]。即便如此，糖酵解調(diào)控酶活性受腫瘤微環(huán)境變化的影響，單一靶點(diǎn)抑制不足以抑制腫瘤增殖，多靶點(diǎn)聯(lián)合治療可能為更好的選擇?？傊琇YRM2作為同時(shí)參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞OXPHOS和糖酵解代謝分子，可能為結(jié)腸癌的治療提供新靶點(diǎn)。