陳月，薛英茹，劉海軍，劉安妮，周衛(wèi)強，，楊小凡，李非，安泰，李義，4，佟毅，4

（1. 營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 100029；2. 河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130； 3. 中糧生化能源（榆樹）有限公司，長春 130401；4. 玉米深加工國家工程研究中心，吉林中糧生化有限公司，長春 130033）

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是細菌體內(nèi)的一種聚酯，可以提供細菌內(nèi)部碳源和能源的存儲材料［1］，具有生物可降解性［2］、生物相容性、壓電性、氣體阻隔性能、熱塑性［3］等優(yōu)良性能，在許多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，例如塑料包裝、電器材料、藥品開發(fā)以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等［4-6］。為了進一步完善PHA 生產(chǎn)發(fā)酵工藝、特性研究與應(yīng)用開發(fā)，需要建立準(zhǔn)確的檢測方法。文獻報道的PHA檢測方法有重量分析法及染色法、紫外光譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、核磁共振法、流式細胞光度和熒光分光光度法及傅立葉變換紅外光譜技術(shù)［7-11］。由于氣相色譜法分析樣品速度快且需要的樣品量少，因而較多用于聚羥基丁酸脂（PHB）樣品含量測定［12］，但該法存在樣品酯化時間長的缺點。

Fukai 等［13］首次發(fā)現(xiàn)在堿性較低的條件下可以將PHB解聚，繼而轉(zhuǎn)化為可以進行氣相色譜檢測的酯類物質(zhì)。Braunegg 等［14］發(fā)現(xiàn)向PHB 樣品中加入少許酸化甲醇（含硫酸）和氯仿，然后在加熱、冷卻后添加適當(dāng)?shù)恼麴s水，等待溶液分層，最后取適當(dāng)有機相進行氣相色譜檢測，可間接測定PHB。在低酸度條件下，PHB可被還原為3-羥基丁酸，而3-羥基丁酸被甲酯化后可以利用氣相色譜進行檢測。在該實驗中發(fā)現(xiàn)，加入苯甲酸作為酯化反應(yīng)過程中的內(nèi)標(biāo)物可以提高檢測準(zhǔn)確性及靈敏度，并且因為這種方法應(yīng)用的樣本量較小，分析速度較快，可以分析任何類型的細胞，同時具有對PHB進行定性和定量分析的優(yōu)點，在一段時間內(nèi)被廣泛應(yīng)用。各種聚合物單體的組成可以通過氣相色譜法確定，但若要對其進行定量就必須創(chuàng)建不同單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線［15］。這種方法的缺點是檢測前樣品處理需要的酯化時間及檢測時間均較長。

在樣品預(yù)處理步驟中，有人對酯化時間、酯化溫度等進行了探討。如廖杏梅等[16]對PHA 纖維在不同干熱溫度與干熱時間條件下的纖維化學(xué)組分、結(jié)晶度、斷裂能力及染色性能進行了分析研究，其中，主要是通過將自動烘干機調(diào)制預(yù)定實驗溫度，采取控制變量法，分別控制干熱時間與干熱溫度，再分別通過紅外光譜儀、X射線衍射儀、紫外可見分光光度計和強力測試儀檢測處理前后的PHA纖維，從而得出結(jié)論：隨著溫度的升高，化學(xué)組分不發(fā)生變化，結(jié)晶尺寸逐漸增大進而破裂，斷裂強力及伸長率逐漸減小，有利于染色，并且隨著處理時間的延長，主衍射的衍射強度隨之增強，更易于辨別。

筆者采用正交響應(yīng)面法對氣相色譜法檢測PHA含量的樣品預(yù)處理過程進行了優(yōu)化，對樣品的酯化時間、酯化溫度、發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度對檢測效果的影響進行了分析。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

智能消解儀：6B-56型，江蘇盛奧華環(huán)?？萍加邢薰尽?/p>

氣相色譜檢測器：7890B型，美國安捷倫科技有限公司。

嗜鹽菌發(fā)酵液樣品：PHA 質(zhì)量分數(shù)為96.03%，中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司。

無水甲醇：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

濃硫酸、苯甲酸：均為分析純，中國醫(yī)藥集團有限公司。

三氯甲烷：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Agilent HP-5 柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司）；流動相流量：2 mL/min；壓力：69.22 kPa；載氣：高純氮氣；柱箱溫度：開啟時80 ℃，維持時間3 min，最高柱箱溫度350 ℃；空 氣 流 量：400 mL/min；氫 氣 流 量：30 mL/min；尾吹氣流量：25 mL/min；加熱器溫度：250 ℃；總流量：65 mL/min；分流比：30∶1；分流流量：60 mL/min。

1.3 酯化液配制

實驗所用酯化液由970 mL無水甲醇、30 mL濃硫酸及1 g苯甲酸配制而成，避光密封保存。

1.4 實驗步驟

從發(fā)酵開始，以8 h 為起點，每隔4 h 取一次PHA菌體樣品，直到48 h，將取出的樣品放入50 mL離心管中以5 000 r/min離心10 min，倒出上清液，加水震蕩重懸，洗滌，再次以5 000 r/min 離心10 min，將處理好的菌泥及時預(yù)凍，預(yù)凍前注意需要用保鮮膜封口、扎眼，并用橡皮筋扎牢，將其冷凍干燥約48 h 后適時取出查看是否完成冷凍，以金屬針穿刺樣品不粘附為標(biāo)準(zhǔn)。樣品凍干后按圖1所示的流程進行實驗操作。將凍干樣品碾碎，稱取0.051 g碾碎樣品于酯化管中（酯化管預(yù)先去皮），并做好標(biāo)記，用5 mL移液槍取每管2 mL三氯甲烷溶液、2 mL酯化液（配制溶液）于酯化管中，使樣品完全溶解，然后將酯化管放入金屬浴中，于100 ℃加熱反應(yīng)3.5 h，反應(yīng)前確保酯化管擰緊不漏液，以免加熱過程中三氯甲烷溶液揮發(fā)。反應(yīng)完成后將酯化管降溫，并在每個酯化管中加入1 mL 去離子水（不要一次性開太多管，以免揮發(fā)），用震蕩儀震蕩5 min后靜置1 h，使溶液上下分層，然后用1 mL進樣針管取分層后的下層液1 mL過膜，進行氣相檢測。

圖1 實驗流程圖

1.5 定量原理

PHA 是一類聚合物，并不是某種單一的物質(zhì)，PHB是PHA家族中被發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的典型代表，通?？梢酝ㄟ^PHB 替代PHA 開展研究工作［2］。PHB在濃硫酸作用下可以解聚，脫去水分子后形成巴豆酸，在配制的酯化液中也可以使巴豆酸與甲醇發(fā)生酯化反應(yīng)進一步生成巴豆酸甲酯，而巴豆酸甲酯可以通過氣相色譜檢測分析得到其含量，從而推斷出PHA的含量，并且該方法可以用于純品以及菌體細胞中PHA的檢測。即：PHB+濃硫酸→巴豆酸；巴豆酸+無水甲醇→巴豆酸甲酯。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

利用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法定量，得到不同樣品預(yù)處理條件下樣品中PHA的質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 過程變量的影響

根據(jù)Box-Behnken 的實驗設(shè)計原理，選擇發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度、酯化時間、酯化溫度為優(yōu)化因子，最優(yōu)區(qū)間分別設(shè)為12.25～13.25 g/L，3～4 h，90～110 ℃，設(shè)計3 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗，試驗因素編碼與水平見表1，響應(yīng)曲面法實驗方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)曲面法實驗因素編碼與水平

表2 響應(yīng)曲面法實驗方案及結(jié)果

根據(jù)優(yōu)化實驗方案的結(jié)果，可以得到常數(shù)項、線性項（X1、X2、X3）、交互項（X1X2、X1X3、X2X3）、平方項（X12、X22、X32）對PHA 含量檢測結(jié)果的影響，并且得到了PHA含量檢測值（響應(yīng)值X）與各影響因素的二次多項回歸方程模擬：

表3 是優(yōu)化實驗分析結(jié)果。由表3 中的P值可知，酯化溫度（X1）、發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度（X3）對PHA 含量測定值的影響顯著，顯著性大小為：酯化時間（X2）＜發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度（X3）＜酯化溫度（X1）。由表3 可知，該模型的F=13.07，P=0.028 9＜0.05，表明該模型在規(guī)定的回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好，并且該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.975 1，表明PHA 含量的實際值與模型的預(yù)測值擬合程度較好，校正決定系數(shù)RAdj2=0.900 5，表明模型的90.05%可以由響應(yīng)面法解釋，該模型的精密度為10.867＞4，進一步說明模型合理。綜上所述，該模型可以理想地分析與預(yù)測實驗結(jié)果。

表3 優(yōu)化實驗分析結(jié)果

應(yīng)用Design-expert 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，得到了各個影響因素的交互作用對響應(yīng)值R的三維圖以及等高線圖，從三維圖中可以看到因素的交互作用對響應(yīng)值R的復(fù)雜關(guān)系。

圖2為酯化溫度與酯化時間交互左右對PHA含量的響應(yīng)曲面。由圖2 可見，在以發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度12.75 g/L為中心點條件下，隨著酯化溫度與酯化時間在一定范圍內(nèi)的增大，PHA含量測定值不斷增大，當(dāng)酯化溫度為95～105 ℃、酯化時間為3.2～3.8 h時，PHA含量測定值較高。

圖2 酯化溫度與酯化時間交互左右對PHA含量的響應(yīng)曲面

圖3為以酯化時間3.5 h為中心點的酯化溫度與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對PHA 檢測含量的響應(yīng)曲面。由圖3 可見，隨著酯化溫度以及發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)的升高，PHA含量測定值不斷增大，當(dāng)酯化溫度為95～105 ℃，而發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度為12.25～12.85 g/L 時，PHA含量測定值較大。

圖3 酯化溫度與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對PHA檢測含量的響應(yīng)曲面

圖4為酯化時間與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對PHA 檢測含量的響應(yīng)曲面。由圖4 可見，在酯化溫度在中心點100 ℃的條件下，隨著酯化時間以及發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)的增加，當(dāng)發(fā)酵液菌體質(zhì)量濃度為12.25～12.85 g/L、酯化時間為3.2～3.6 h時，PHA含量測定值較高。

圖4 酯化時間與發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度交互作用對PHA檢測含量的響應(yīng)曲面

2.2 模型優(yōu)化

利用軟件優(yōu)化影響因素后，模型的最佳實驗條件為酯化溫度103.28 ℃，酯化時間3.43 h，樣品質(zhì)量濃度為12.64 g/L，預(yù)測得到的PHA 質(zhì)量分數(shù)為96.13%。為了方便實驗操作與儀器控制，確定最佳實驗條件：酯化溫度103 ℃，酯化時間3.4 h，樣品質(zhì)量濃度12.64 g/L。同時為了保證實驗的準(zhǔn)確性及可行性，按照優(yōu)化條件進行了3次平行試驗，得到的PHA 質(zhì)量分數(shù)為96.04%，與響應(yīng)預(yù)測值相比較，相對誤差為0.09%，證明該實驗條件可行。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法，從發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度、酯化時間以及酯化溫度三個影響因素探究了PHA 檢測前處理的優(yōu)化，P值為0.028 9，小于0.05，R2=0.975 1，表明該模型在規(guī)定的回合區(qū)域內(nèi)擬合效果較好，預(yù)測值與實際值之間有著很好的擬合度，最終確定酯化溫度為103 ℃，酯化時間為3.4 h，樣品質(zhì)量濃度為12.64 g/L時，檢測效果最佳。PHA質(zhì)量分數(shù)檢測值為96.04%，與預(yù)測值誤差為0.09%。

通過研究PHA檢測前處理過程，發(fā)現(xiàn)可以通過適當(dāng)?shù)目刂契セ瘻囟?、酯化時間、發(fā)酵液菌體樣品質(zhì)量濃度，減少PHA檢測時間損耗以及能源消耗。