李夢夢，韋紅玲，劉明珠，3，黃帥帥，4，王太霞，黃琳*，李鵬飛，3*

（1河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2廣西科學(xué)院/廣西水產(chǎn)生物技術(shù)與現(xiàn)代生態(tài)養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西漁業(yè)重大疫病防控與高效健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程研究中心，南寧 530007；3廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；4北部灣大學(xué)海洋學(xué)院/廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011）

0 引言

【研究意義】我國水域資源豐富，為漁業(yè)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。2020年我國海洋漁業(yè)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)總值超過6.75千億元（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等，2021）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球70多億人口的動(dòng)物蛋白攝入來源中15%以上是來自水產(chǎn)品。與畜禽動(dòng)物相比，水產(chǎn)動(dòng)物肉質(zhì)更鮮嫩，且脂肪含量少，更有利于人體健康。石斑魚作為我國與東南亞地區(qū)的大宗名貴海水養(yǎng)殖魚類，其肉質(zhì)細(xì)膩、蛋白含量高、脂肪含量低，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值（肖賀賀等，2021）。2020年我國石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量已超過19萬t，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，水體養(yǎng)殖環(huán)境污染嚴(yán)重，導(dǎo)致病毒性疾病暴發(fā)率不斷上升，嚴(yán)重制約著石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等，2021）。石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）是一種高致病性魚類傳染性病毒，是危害石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要病原之一（余慶等，2020）。SGIV在不同種類魚群間傳播迅速且致死率極高（余慶等，2019），對魚類造血器官和組織的破壞極其嚴(yán)重，可使感染的魚體出現(xiàn)貧血及多器官衰竭癥狀而死亡。因此，研發(fā)出有效抑制SGIV感染的藥物對促進(jìn)石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，抗生素等化學(xué)藥物仍大量用于防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害，但大量使用抗生素不僅極易造成藥物殘留及耐藥性等問題，還會(huì)影響魚體的免疫機(jī)能（耿毅和汪開毓，2004）。因此，迫切需要研發(fā)出綠色、健康、高效且環(huán)境友好的漁用藥物。藥物防治仍是控制水產(chǎn)疫病最主要、有效的手段（李鵬飛等，2018），已有研究證實(shí)藥用植物提取物對水生病毒具有顯著的抗病毒效果，且安全無害，對環(huán)境友好（李鵬飛等，2021a）。紫花地?。╒iola yedoensisMakino）為雙子葉植物綱堇菜屬多年生草本藥用植物，其花色一般呈紫堇色或淡紫色，主產(chǎn)于我國廣西、貴州及云南等地。紫花地丁不僅具有食用價(jià)值和觀賞價(jià)值，還具有抗病毒、抗菌及抗氧化等藥用價(jià)值（崔雪等，2020）。已有研究證實(shí)，紫花地丁水提物可通過干擾SGIV對宿主細(xì)胞的吸附、侵入與復(fù)制過程，而發(fā)揮抗SGIV感染的功效（Yu et al.，2019）。桑葉（Morus alba）為?？粕僦参铮淙~片一般呈卵形、寬卵形、心形等，在我國南北地區(qū)均有種植，具有抗病毒、抗菌等多種生物活性（張倩和張立華，2020）。李鵬飛等（2021b）研究表明，桑葉水提物及桑葉主要活性成分異槲皮苷能有效抑制SGIV感染，其抑制率高達(dá)99%。莪術(shù)［Curcuma zedoaria（Christm.）Rosc］為芭蕉目姜科姜黃屬植物，在我國臺(tái)灣、福建、江西、廣東、廣西、四川及云南等地均有分布，含有莪術(shù)醇、莪術(shù)二醇和姜黃素等多種天然活性成分，具有抗腫瘤、抗病毒及抗菌等藥理作用（黃云峰等，2020），其有效活性成姜黃素在細(xì)胞水平及活體水平均具有良好的抗SGIV感染效果（Liu et al.，2020a）。八角茴香（Illicium verumHook.f.）為木蘭科八角屬的天然藥用植物，主產(chǎn)于我國廣西西部和南部地區(qū)，其果實(shí)為由八枚骨突果集成的聚合果，果皮肥厚，單瓣果實(shí)前端鈍或鈍尖（陳瑞生等，2011）；八角茴香含有黃酮類、多糖類、萜類等天然化合物，具有抑菌、抗病毒、抗氧化、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用（黃麗貞等，2015；Yu et al.，2018；吳玲等，2019；Hu et al.，2021）。八角茴香也是開發(fā)成天然抗氧化劑的重要資源（趙二勞等，2019）。謝冬惠（2012）、趙二勞等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香提取物具有抗氧化活性，是一種理想的天然抗氧化劑；Peng等（2016）研究表明，八角茴香提取物可激活獲得性免疫反應(yīng)；Yu等（2018）、Liu等（2020b）研究證實(shí)，八角茴香主要成分——槲皮素具有抗SGIV活性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，有關(guān)八角茴香藥理作用及其抗病毒活性的研究已有較多報(bào)道（Cai et al.，2013；黃麗貞等，2015；Khan et al.，2018；Yu et al.，2018；Hu et al.，2021），但鮮見從免疫應(yīng)答角度探究八角茴香抗SGIV感染的作用機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從免疫應(yīng)答角度探析八角茴香水提物（IVE）調(diào)控宿主免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗SGIV的作用機(jī)制，以期為八角茴香應(yīng)用于石斑魚健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)及開發(fā)綠色、健康、高效漁用藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥材八角茴香購自廣西南寧一心大藥房；石斑魚脾臟細(xì)胞系（Grouper spleen cell line，GS）由廣西漁業(yè)重大疫病防控與高效健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程研究中心保存提供；SGIV分離自廣西人工養(yǎng)殖的珍珠龍膽石斑魚（肖賀賀等，2019）。

1.2 IVE制備

將八角茴香粉碎成粉末，稱取25 g浸泡于500 mL超純水中，4℃浸泡過夜，次日將八角茴香浸泡液及藥包置于鍋中煎煮至100 mL，定容得到250 mg/mL的八角茴香水提物母液。經(jīng)12000 r/min離心10 min，0.22 μm濾膜過濾即得到IVE，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞安全濃度確定

將1×105個(gè)GS細(xì)胞接種于96孔板中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。以無任何處理的GS細(xì)胞為對照組，加入不同濃度IVE為試驗(yàn)組，每組均設(shè)3個(gè)平行。分別在用藥后24和48 h通過光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化，并于48 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以磷酸緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞，向各孔細(xì)胞中加入10 μL CCK-8溶液。室溫避光孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在波長450 nm處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率計(jì)算公式如下：

式中，C為細(xì)胞存活率（%），C1為試驗(yàn)組細(xì)胞吸光值，C0為對照組細(xì)胞吸光值。

1.4 IVE預(yù)處理GS細(xì)胞激活細(xì)胞免疫反應(yīng)

將8×105個(gè)GS細(xì)胞接種于12孔板中，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。將IVE在培養(yǎng)基中稀釋至安全濃度后接入GS細(xì)胞中，以無任何處理的GS細(xì)胞為對照組，在28℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在用藥后2和4 h收集細(xì)胞，提取總RNA。200 ng總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后以cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測干擾素基因（IFN）、蛋白激酶基因（IKKα）、干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3、轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT1），以及干擾素刺激因子STING、PKR和ISG15的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列信息Table 1 Information of sequence of real-time fluorescence quantitative PCR amplification primers

1.5 光學(xué)顯微鏡觀察IVE抗SGIV效果

將8×105個(gè)GS細(xì)胞接種至12孔板中，28℃培養(yǎng)18 h。設(shè)2個(gè)對照組，對照組1：GS細(xì)胞不進(jìn)行任何處理；對照組2：將L15培養(yǎng)基接入GS細(xì)胞孵育2 h后移除培養(yǎng)液，接入0.4 μL SGIV（106TCID50/mL）孵育2 h，然后移除培養(yǎng)液，以L15培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次并加入新的L15培養(yǎng)基。試驗(yàn)組GS細(xì)胞進(jìn)行如下處理：以L15培養(yǎng)基將IVE稀釋至安全濃度，接入細(xì)胞后28℃培養(yǎng)2 h，移除培養(yǎng)液，以L15培養(yǎng)基清洗2次，接入0.4 μL SGIV（106TCID50/mL）孵育2 h，移除培養(yǎng)液并以L15培養(yǎng)基清洗2次，再加入L15培養(yǎng)基。各組細(xì)胞在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于病毒感染后24和48 h采用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IVE抗SGIV活性

將8×105個(gè)GS細(xì)胞接種至12孔板中，28℃培養(yǎng)18 h。試驗(yàn)組細(xì)胞中加入以培養(yǎng)基稀釋至安全濃度的IVE孵育2 h（對照組加入等體積的L15培養(yǎng)基），以L15培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次并接入0.4 μL SGIV（106TCID50/mL）孵育2 h，移除培養(yǎng)基，以L15培養(yǎng)基清洗2次，再加入L15培養(yǎng)基。各組細(xì)胞在28℃下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于病毒感染后24和48 h收集細(xì)胞，提取總RNA，200 ng RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SGIV的MCP基因表達(dá)情況，檢驗(yàn)IVE抗SGIV活性。每組樣品均設(shè)3個(gè)平行。

1.7 IVE體外激活宿主細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IVE體外激活宿主細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)，具體操作方法同1.6。分別在病毒感染后24和48 h收集各組細(xì)胞，提取總RNA，200 ng總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測干擾素相關(guān)基因IFN、STING、PKR、IKKα、ISG15、IRF3及STAT1的表達(dá)情況。每組樣品均設(shè)3個(gè)平行。

1.8 活體水平檢測IVE抗SGIV活性情況

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)得出IVE腹腔注射石斑魚的安全工作濃度為4 mg/尾。選取30尾體長、體質(zhì)量相近的石斑魚，隨機(jī)分為3組分別暫養(yǎng)于3個(gè)30 L的水缸內(nèi)。對照組石斑魚腹腔注射50 μL SGIV（106TCID50/mL），試驗(yàn)組石斑魚腹腔同時(shí)混合注射4 mg/尾的IVE和50 μL SGIV。SGIV感染后24和48 h，分別采集石斑魚脾臟組織提取總RNA，200 ng總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MCP基因相對表達(dá)量，分析IVE在活體水平的抗SGIV活性。每組樣品均設(shè)3個(gè)平行。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2020對進(jìn)行處理，采用SPSS 22.0的單因素方差分析比較組間差異，并以Graph-Pad Prism 7制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 IVE細(xì)胞安全工作濃度

不同濃度IVE與GS細(xì)胞孵育48 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。由圖1-A可看出，與無任何處理的GS細(xì)胞相比，當(dāng)IVE濃度≤0.50 mg/mL時(shí)，GS細(xì)胞正常生長，細(xì)胞形態(tài)正常；當(dāng)IVE濃度≥1.25 mg/mL時(shí)，GS細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的脫落、皺縮、變圓等細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effects，CPEs）。CCK-8檢測結(jié)果（圖1-B）與光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果一致，因此確定IVE細(xì)胞水平的安全工作濃度≤0.50 mg/mL。

圖1 不同濃度IVE對GS細(xì)胞的影響Fig.1 Effects of different concentrations of IVE on GS cells

2.2 IVE預(yù)處理激活宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)

IFN是一種具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒功能的細(xì)胞因子，在宿主抗病毒感染的先天性免疫中發(fā)揮重要作用（劉穎等，2012；張輝等，2014）。因此，在確定IVE細(xì)胞安全工作濃度后，進(jìn)一步研究其對干擾素相關(guān)免疫基因表達(dá)的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖2）顯示，與對照組GS細(xì)胞相比，IVE孵育2 h后可顯著（P＜0.05，下同）或極顯著（P＜0.01，下同）上調(diào)干擾素相關(guān)基因IFN、STAT1、PKR、IKKα、IRF3及STING的表達(dá)，僅ISG15基因的表達(dá)無顯著變化（P＞0.05，下同）；IVE孵育4 h后STING、STAT1和IRF3基因的相對表達(dá)量呈下調(diào)趨勢，但仍極顯著高于對照組，IFN、ISG15和PKR基因的相對表達(dá)量與對照組間無顯著差異。由于IVE孵育2 h的干擾素相關(guān)基因表達(dá)量較高，故選擇藥物孵育2 h進(jìn)行病毒感染試驗(yàn)。

圖2 IVE對GS細(xì)胞干擾素相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of IVE on expression of IFN-related genes of GS cells

2.3 IVE體外抗SGIV活性分析結(jié)果

光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果（圖3-A）顯示，與僅接種SGIV的對照組GS細(xì)胞相比，經(jīng)IVE預(yù)處理再加入SGIV感染的試驗(yàn)組細(xì)胞病變效應(yīng)明顯減少。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖3-B）表明，與僅接種SGIV的對照組GS細(xì)胞相比，試驗(yàn)組GS細(xì)胞中SGIV的MCP基因相對表達(dá)量極顯著降低，故推測IVE通過抑制MCP基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)抗SGIV感染的效果。

圖3 IVE細(xì)胞水平抗SGIV感染的效果Fig.3 SGIV infection effects of IVE level of cells

2.4 IVE激活宿主細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)

為探究IVE在病毒感染時(shí)是否影響細(xì)胞免疫因子表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IVE體外激活宿主細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。與僅孵育SGIV的GS細(xì)胞相比，試驗(yàn)組GS細(xì)胞中干擾素相關(guān)基因IFN、STAT1和IRF3在病毒感染后24 h極顯著上調(diào)，但至病毒感染后48 h無顯著差異；PKR、IKKα、ISG15和STING基因在病毒感染后24和48 h均呈顯著或極顯著上調(diào)趨勢。說明IVE可增強(qiáng)SGIV感染GS細(xì)胞中干擾素相關(guān)基因的表達(dá)。

圖4 IVE調(diào)控宿主細(xì)胞抗SGIV的免疫反應(yīng)Fig.4 Immune response of IVE to regulate cells of host against SGIV

2.5 IVE在石斑魚活體中的抗SGIV效果分析

2.5.1 石斑魚活體用藥安全濃度確定石斑魚腹腔注射不同劑量IVE后觀察魚體1周內(nèi)的死亡情況，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，腹腔注射10 mg/尾IVE的石斑魚存活率為40%，注釋8 mg/尾的存活率為60%，注釋6 mg/尾的存活率為70%，注射劑量≤4 mg/尾的石斑魚進(jìn)食正常且無死亡，因此確定石斑魚活體的IVE用藥安全濃度≤4 mg/尾。

圖5 IVE注射劑量對石斑魚存活率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of IVE on grouper vability rate

2.5.2 IVE在石斑魚活體中的抗SGIV活性.如圖6所示，與對照組僅注射SGIV的石斑魚相比，試驗(yàn)組石斑魚脾臟組織中的MCP基因相對表達(dá)量在病毒感染后24和48 h均極顯著降低，說明IVE在活體水平也能有效抑制SGIV感染。

圖6 IVE在石斑魚活體中的抗SGIV活性Fig.6 Anti-SGIV activity of IVE against grouper in vivo

3 討論

SGIV是危害石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要病原之一，致死率極高，因此亟待研發(fā)出能有效抑制SGIV感染的藥物。與抗生素等化學(xué)藥物相比，藥用植物具有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括活性化合物成分多、綠色無藥殘及成本低等（季本安等，2017）。已有研究證實(shí)，一些藥用植物具有抗菌、抗病毒功能活性。如黃連水提物具有一定的抑菌功效，具備研發(fā)成高效抗水產(chǎn)病害中藥制劑的潛力（劉明珠等，2019）。桑葉有效成分——異槲皮苷可通過破壞SGIV粒子結(jié)構(gòu)，干擾病毒粒子對宿主細(xì)胞的吸附、侵入及復(fù)制過程而發(fā)揮抗SGIV感染作用（李鵬飛等，2021b）。八角茴香富含槲皮苷、β-谷甾醇等多種活性成分，具有抗菌、抗氧化、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，藥效顯著、用途廣泛。姚莉韻和王麗平（1999）研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香水溶性成分Ⅱ槲皮素-3-O-β-呋喃葡萄糖甙對單純皰疹病毒1型（HSV-1）有明顯的抑制作用；Liu等（2020b）研究證實(shí)，八角茴香主要活性成分具有抑制SGIV感染的效果，其中槲皮素可通過干擾SGIV與宿主靶細(xì)胞結(jié)合而影響SGIV侵入宿主細(xì)胞。至今，鮮見從細(xì)胞免疫應(yīng)答角度闡述IVE抗SGIV感染的研究報(bào)道，為此本研究探究IVE對宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響，旨在闡明其抗病毒機(jī)制。

固有免疫是機(jī)體在系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化過程中形成的天然免疫防御功能，是機(jī)體抵御病原微生物感染的第一道屏障（Boraschi et al.，2017）。宿主可通過免疫細(xì)胞模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs），包括病毒雙鏈DNA（dsDNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、單鏈RNA（ssRNA）等病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），啟動(dòng)特異性級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后誘導(dǎo)I型IFN表達(dá)，產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)以抵抗病原感染（Akira et al.，2006）。近年來，諸多研究表明STING基因在先天免疫中發(fā)揮重要作用（Ishikawa and Barber，2008；Liu et al.，2015），作為細(xì)胞質(zhì)DNA傳感器，STING可通過激活胞質(zhì)激酶IκB kinase（IKK）及轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB），而誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生（Ran et al.，2014；Chow et al.，2015）。IFN與細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過激活JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控具有抗病毒活性的干擾素刺激基因（Interferon stimulated genes，ISGs），包括ISG15、PKR、ISG56基因的表達(dá)而發(fā)揮抗病毒作用（Schneider et al.，2014；Xin et al.，2020）。此外，有研究報(bào)道藥物可通過調(diào)控IFN表達(dá)而達(dá)到抗病毒效果。如甘草素可通過調(diào)控I型IFN信號(hào)通路而發(fā)揮抗新冠肺炎作用（Zhu et al.，2020）；α-硫辛酸可促進(jìn)IRF3、IRF7、Viperin、ISG15、IFN1和PKR基因表達(dá)而抑制病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）感染（Zhang et al.，2021）；香豆素衍生物7-［（4-aminophenyl）diazenyl］-4-methyl-coumarin（AMC）可通過上調(diào)IFN1、MxI、EF1和MDA5基因表達(dá)，抑制傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）在感染過程中的復(fù)制（Hu et al.，2021）。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似，IVE處理GS細(xì)胞可有效上調(diào)IFN、STAT1、PKR、IKKα、IRF3和STING等干擾素相關(guān)基因表達(dá)，故推測IVE可通過激活GS細(xì)胞中的干擾素相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)而間接發(fā)揮抗病毒功能。

近年來，IFN在魚體免疫中的重要作用已受到廣泛關(guān)注。Purcell等（2012）研究發(fā)現(xiàn)IFN系統(tǒng)的預(yù)激活可顯著抑制魚彈狀病毒復(fù)制；劉鐳（2018）研究表明香豆素可通過促進(jìn)HO-1表達(dá)，觸發(fā)IFN產(chǎn)生從而發(fā)揮抗鯉春病毒血癥病毒作用；Zhang等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，α-硫辛酸可通過抑制VHSV依賴的氧化應(yīng)激反應(yīng)和上調(diào)抗病毒基因Viperin和ISG15，進(jìn)而發(fā)揮抗VHSV感染的作用。STING基因能通過識(shí)別DNA分子，而啟動(dòng)免疫反應(yīng)產(chǎn)生I型IFN，在抗病毒感染過程中發(fā)揮極為重要的作用（歐陽婷等，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IVE預(yù)處理后可有效抑制SGIV感染GS細(xì)胞，且能影響IFN、ISG15、STING、PKR、STAT1和IRF3等干擾素相關(guān)基因的表達(dá)；石斑魚活體抗病毒試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)IVE在石斑魚活體內(nèi)具有抑制SGIV感染的效果。SGIV是一個(gè)正二十面體的雙鏈DNA病毒，STING基因在天然免疫中能識(shí)別病毒DNA及藥用植物可調(diào)控干擾素信號(hào)通路（秦啟偉和黃曉紅，2019）。因此，推測IVE是通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)STING基因表達(dá)，增強(qiáng)其對SGIV的識(shí)別，同時(shí)進(jìn)一步誘導(dǎo)干擾素相關(guān)基因表達(dá)，激活宿主細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)（圖7）而發(fā)揮抗病毒功能。

圖7 IVE抗SGIV感染的作用機(jī)制示意圖Fig.7 Schematic diagram of anti-SGIV mechanism of IVE

4 結(jié)論

IVE具有抑制SGIV感染的生物功能，其作用機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)干擾素相關(guān)基因表達(dá)而激活宿主的抗病毒狀態(tài)，從而發(fā)揮間接抗SGIV效果；也說明八角茴香在水產(chǎn)疫病防控中具有研發(fā)成漁用抗病功能制劑的潛力。