趙成欣，王金玲，李丹丹，李泉妙

（國(guó)藥一心制藥有限公司，長(zhǎng)春 130000）

阿扎胞苷為嘧啶核苷胞苷類(lèi)似物，屬于一類(lèi)被稱(chēng)為低甲基化藥物（Hypomethylatingagents）的表觀遺傳學(xué)（Epigenetic）抗腫瘤藥。由Pharmion 制藥公司研制開(kāi)發(fā)，持證商為Celgene 公司，于2004 年5 月在美國(guó)批準(zhǔn)上市，上市規(guī)格為 100 mg，商品名“Vidaza?”，是第一個(gè)骨髓增生異常綜合征的治療藥物[1]。

阿扎胞苷原料合成工藝使用了二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide DMSO），根據(jù)2020 年版《中國(guó)藥典》和ICHQ3C 殘留溶劑指導(dǎo)原則相關(guān)要求，需要對(duì)原料合成過(guò)程中使用的殘留溶劑進(jìn)行去除，并對(duì)殘留溶劑進(jìn)行檢查[2-3]。目前，有關(guān)阿扎胞苷原料中殘留溶劑二甲基亞砜檢測(cè)方法方面的研究，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用高效液相色譜法（HPLC）建立了阿扎胞苷原料中殘留溶劑二甲基亞砜含量的檢測(cè)方法。通過(guò)專(zhuān)屬性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度等試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性，重現(xiàn)性良好，為阿扎胞苷原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

Waters e2695 高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測(cè)器；Aglient 1260 高效液相色譜儀；

阿扎胞苷原料藥（自制，180301 批、180201 批、x-180307 批）；二甲基亞砜（SIGMA，色譜純）；超純水（本公司自制，電阻率為18.2 MΩ·cm）；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱Agilent ZORBAX C8（5 μm，4.6×250 mm）；流 動(dòng) 相 水- 乙 腈95∶5（V∶V）；流 速1.0 mL/ min；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

2.2 溶液配制

空白溶液：超純水。

對(duì)照品貯備液：取二甲基亞砜約50.60 mg，精密稱(chēng)定，用超純水溶解并定量稀釋制成每1 mL 含二甲基亞砜約2.17 μg 的溶液，為對(duì)照品貯備液。

對(duì)照品溶液：精密量取2.2 節(jié)中對(duì)照品貯備液1 mL 置100 mL 量瓶中，用超純水定量稀釋至刻度，為對(duì)照品溶液。

線性溶液：精密量取2.2 節(jié)中對(duì)照品貯備液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL 分別置10 mL 量瓶中，用超純水定量稀釋定容至刻度，制成每1 mL 含二甲基亞砜分別約為5.060、10.120、20.240、24.288、32.384、40.480、48.576 μg/mL 線性溶液。

供試品溶液：稱(chēng)取阿扎胞苷原料約40 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL 量瓶中，加入適量超純水溶解后定容至刻度，為供試品溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：稱(chēng)取阿扎胞苷原料約40 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL 量瓶中，用超純水適量溶解后，加入對(duì)照品貯備液0.2 mL，再用超純水定量稀釋定容至刻度，為系統(tǒng)溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性

取2.2 節(jié)中的空白溶液、對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液，按2.1 節(jié)中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)空白溶液不干擾供試品中二甲基亞砜檢測(cè)；阿扎胞苷與二甲基亞砜分離度為3.4，大于2.0，拖尾因子小于1.5，理論板數(shù)大于4 000；表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 空白溶液、供試品溶液、二甲基亞砜照溶液與系統(tǒng)溶液對(duì)比圖Fig.1 Comparison of blank solution， test solution， dimethyl sulfoxide reference solution and system solution

2.3.2 定量限與檢測(cè)限

取2.2 節(jié)中對(duì)照品溶液，用超純水逐級(jí)稀釋?zhuān)孕旁氡龋⊿/N）大于10 為定量限，以信噪比（S/ N）大于3 為檢測(cè)限，按2.1 節(jié)中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。定量限為5.060 μg/mL，檢測(cè)限為0.12 μg/ mL。

取以信噪比（S/N）大于10 的定量限溶液，按2.1節(jié)中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄色譜圖。二甲基亞砜保留時(shí)間的RSD 值為0.38%，小于1.0%，峰面積的RSD 值為1.34%，小于2.0%，表明定量限重復(fù)性良好。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取2.2 節(jié)中對(duì)照品溶液，按2.1 節(jié)中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄色譜圖。二甲基亞砜保留時(shí)間的RSD 值為0.29%，小于1.0%，峰面積RSD 值為0.67%（n= 6）。表明該方法系統(tǒng)適用性良好。

2.3.4 線性與范圍

精密量取2.2 節(jié)中線性溶液，按2.1 節(jié)中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X軸）、峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程見(jiàn)圖2，二甲基亞砜在5.06 ～ 48.58 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 二甲基亞砜線性Fig.2 Calibration curve of dimethyl sulfoxide standard solution

2.3.5 重復(fù)性和中間精密度

取同一批次阿扎胞苷原料，按2.2 節(jié)中方法制備的供試品溶液6 份，按2.1 節(jié)中色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算每份樣品中二甲基亞砜含量。結(jié)果顯示，含量測(cè)定值的RSD（n= 6）為0.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

由不同人員、在不同時(shí)間、使用不同的儀器，重復(fù)上述操作，按外標(biāo)法計(jì)算每份樣品中的二甲基亞砜含量。結(jié)果顯示，含量測(cè)定值的RSD 值（n= 6）為1.5%。

2.3.6 回收率試驗(yàn)

精密量取9 份已知二甲基亞砜含量的阿扎胞苷原料約40 mg，精密稱(chēng)定，分別置10 mL 量瓶中，分別加入2.2 節(jié)中的對(duì)照品貯備液0.025 mL、0.1 mL、0.2 mL 各3 份，按2.2 節(jié)中的供試品溶液配制方法制備不同水平的回收率供試品溶液。按2.1 節(jié)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，不同加樣水平條件下的二甲基亞砜的平均回收率（n= 9）為100.5%，RSD 值為0.9%。

2.3.7溶液穩(wěn)定性

取2.2 節(jié)中的供試品溶液，在室溫下放置，分別于0h、1h、2h、4h、16h，按2.1 節(jié)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，16 h 內(nèi)供試品溶液中二甲基亞砜峰面積的RSD 值為1.9%，小于2.0%，表明在室溫條件下供試品溶液放置16 h 穩(wěn)定。

2.4 二甲基亞砜含量測(cè)定

取各批次阿扎胞苷原料，按2.2 節(jié)中方法制備對(duì)照品及供試品溶液，按2.1 節(jié)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算二甲基亞砜含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 阿扎胞苷原料中二甲基亞砜含量測(cè)定結(jié)果（n = 2）Tab.1 Determination results of dimethyl sulfoxide in azacitidine （n = 2）

3 討論

3.1 方法選擇

據(jù)報(bào)道，目前二甲基亞砜的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、元素分析法等。但由于二甲基亞砜是極性物質(zhì)，沸點(diǎn)為189℃，125℃時(shí)開(kāi)始分解，采用氣相色譜法靈敏度低，且采用水為溶劑時(shí)，對(duì)色譜柱損耗嚴(yán)重；而元素分析法操作繁瑣、靈敏度低，不適合用于殘留溶劑的檢測(cè)。高效液相色譜法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，操作簡(jiǎn)便[6]。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，采用高效液相色譜法檢測(cè)阿扎胞苷原料中二甲基亞砜，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 溶劑選擇

阿扎胞苷略溶于水，同時(shí)二甲基亞砜易溶于水，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，采用水為溶劑，當(dāng)供試品溶液濃度為4 mg/mL 時(shí)，溶解性良好。進(jìn)一步通過(guò)專(zhuān)屬性試驗(yàn)結(jié)果表明，空白溶劑不干擾樣品檢測(cè)，二甲基亞砜與主峰分離度良好，故選擇水為溶劑。

3.3 色譜條件的確定

阿扎胞苷和二甲基亞砜均在214 nm 有紫外吸收，故選擇波長(zhǎng)為214 nm；同時(shí)，根據(jù)阿扎胞苷和二甲基亞砜的理化性質(zhì)，初步選擇流動(dòng)相為乙腈和水，通過(guò)方法可知，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈-水（95∶5）時(shí)，二甲基亞砜與阿扎胞苷及其相鄰雜質(zhì)峰分離度良好，拖尾因子及理論塔板數(shù)均符合規(guī)定，故流動(dòng)相為乙腈-水（95∶5）；根據(jù)二甲基亞砜定量限濃度及《中國(guó)藥典》中殘留二甲基亞砜殘留限度要求（≤0.5%），最終確定供試品濃度為4 mg/mL、進(jìn)樣量5 μL。

本文建立了一種阿扎胞苷原料殘留溶劑二甲基亞砜的高效液相檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)單、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性、準(zhǔn)確性好，能夠準(zhǔn)確測(cè)定阿扎胞苷原料中二甲基亞砜的含量，為阿扎胞苷原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。