張 軻，王春瓊，張曉偉，孫浩巍，龍 杰，張冀武，童治軍，蓋小雷，蔡潔云，李海燕，陳 丹*

(1.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，云南昆明 650106；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南昆明 650218；3.云南省煙草煙葉公司，云南昆明 650011)

近年來(lái)，除了電子霧化煙和加熱不燃燒煙草制品的流行，所謂的“花煙”“茶煙”“藥煙”等外形與卷煙相差無(wú)幾的類煙產(chǎn)品也頻繁出現(xiàn)在消費(fèi)者的視線中，并且已經(jīng)有未成年人吸食“茶煙”[1]和“藥煙”中檢出煙堿成分[2]的報(bào)道。盡管煙草專賣局、食品藥品監(jiān)督局和市場(chǎng)管理局等部門已加強(qiáng)了對(duì)有一定市場(chǎng)空間和回購(gòu)率且仍處于初期的類煙產(chǎn)品的監(jiān)管力度，但對(duì)于仿冒程度較高的類煙產(chǎn)品，采用現(xiàn)有的方法進(jìn)行鑒別及判定存在一定的誤判風(fēng)險(xiǎn)。因此，探索高效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的鑒別類煙產(chǎn)品抽樣方案和檢驗(yàn)方法，對(duì)保障真品卷煙的合理流通、煙草專賣和市場(chǎng)監(jiān)管具有重要意義。

目前，卷煙真?zhèn)舞b別檢驗(yàn)以感官鑒別法和評(píng)吸鑒別法較為常用[3]，而借助電子鼻技術(shù)[4]、近紅外光譜技術(shù)[5]和頂空-氣相色譜-質(zhì)譜[6]等儀器鑒別的方法也正發(fā)展成為煙草分析的重要手段，但仍存在一定局限性，如抽樣量大、檢驗(yàn)費(fèi)用高，準(zhǔn)確、及時(shí)鑒別仿冒程度較高的卷煙產(chǎn)品難度大。同時(shí)，在現(xiàn)行鑒別檢驗(yàn)類煙產(chǎn)品的方法中，主要通過(guò)測(cè)定樣品中煙堿和N-亞硝胺含量，來(lái)判定此類產(chǎn)品是否為煙草專賣品。但煙堿并非煙草所獨(dú)有，很多茄科植物也含有，并且煙草特有N-亞硝胺的含量極低，常出現(xiàn)卷煙樣品中檢不出煙草特有N-亞硝胺的情況，因此，利用該方法鑒別檢驗(yàn)類煙產(chǎn)品存在較大司法風(fēng)險(xiǎn)[7]。DNA標(biāo)記是指用直接或間接的手段反映研究對(duì)象在DNA序列上的差異，即DNA多態(tài)性，具有操作簡(jiǎn)便、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、基本干擾小、樣本量少、結(jié)果準(zhǔn)確、及時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，已在司法鑒定[7]、海關(guān)檢疫[8]、農(nóng)產(chǎn)品鑒別檢驗(yàn)[9]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。此外，DNA測(cè)序技術(shù)[10]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)[11]的迅速發(fā)展，為利用煙草DNA分子特異標(biāo)記鑒定檢驗(yàn)卷煙產(chǎn)品奠定堅(jiān)實(shí)的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。在抽樣方法上，與隨機(jī)抽樣、分層抽樣等方法相比，序貫抽樣法具有明顯優(yōu)勢(shì)，即任何一次抽樣都可作為終結(jié)檢驗(yàn)，可大大降低平均樣本量、檢驗(yàn)成本和時(shí)間，此法較為適合取樣量少的DNA標(biāo)記技術(shù)[12]。以往鑒別檢驗(yàn)卷煙真?zhèn)蔚难芯看蠖嗉性诟泄勹b別法、評(píng)吸鑒別法和儀器鑒別法，而關(guān)于序貫抽樣與DNA標(biāo)記結(jié)合鑒別類煙產(chǎn)品研究鮮有報(bào)道。筆者以市場(chǎng)上獲得的400支茶煙為材料，研究構(gòu)建適合類煙產(chǎn)品最小和最大抽樣量的序貫抽樣檢驗(yàn)方案以及DNA檢測(cè)方法，為科學(xué)、準(zhǔn)確、高效地鑒別類煙產(chǎn)品提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料該研究的材料來(lái)源于市場(chǎng)銷售的某品牌規(guī)格相同的類煙產(chǎn)品(茶煙)400支；煙支規(guī)格為長(zhǎng)84 mm，直徑7.7 mm。

1.2 方法

抽樣特性曲線(OC曲線)是基于抽樣方案(ncum，c)繪制的，即從整體為N的產(chǎn)品中抽取樣本數(shù)量為ncum的樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，若符合判定標(biāo)準(zhǔn)c，則判定該批產(chǎn)品總體合格，否則判定不合格，通過(guò)OC曲線與抽樣方案變化的關(guān)系可以進(jìn)一步驗(yàn)證抽樣方案的合理性。

1.2.2DNA分子標(biāo)記鑒別檢驗(yàn)類煙產(chǎn)品。為驗(yàn)證抽樣方法在檢測(cè)中的實(shí)際效果，將材料中的2條類煙產(chǎn)品破除包裝后，將煙支充分混勻，隨機(jī)抽取52支煙支(類煙產(chǎn)品)為初始樣品，以隨機(jī)抽取的2019年某品牌成品卷煙的標(biāo)準(zhǔn)樣品為對(duì)照，采用能區(qū)分煙與茶的SSR引物，按童治軍[14]的方法進(jìn)行待檢樣品的基因組DNA提取、純化及PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，最終獲得清晰的特異性條帶。

2 結(jié)果與分析

表1 序貫抽樣參考(雙尾)Table 1 Reference of sequential sampling (two tail)

2.4 DNA分子標(biāo)記鑒別驗(yàn)證類煙產(chǎn)品由圖2可知，DNA分子標(biāo)記在卷煙標(biāo)準(zhǔn)樣品(S)中250 bp分子量處擴(kuò)增出特異性條帶，而初次抽樣的52個(gè)類煙產(chǎn)品(n1～n52)均未出現(xiàn)特異性條帶，驗(yàn)證了序貫抽樣的52個(gè)卷煙產(chǎn)品為類煙產(chǎn)品。

圖1 序貫抽樣ncum為52、110、142和一次抽樣n為80、200、400的OC曲線 Fig.1 OC curve (ncum=52，110，142 and n=80，200，400)

注：M為DNA Marker分子量為100～1 500 bp，S為卷煙標(biāo)準(zhǔn)樣品擴(kuò)增結(jié)果，n1～n52為初次抽樣類煙產(chǎn)品樣品1～52擴(kuò)增結(jié)果 Note：M is the DNA marker with molecular weight of 100-1 500 bp，S is the amplification result of cigarette standard sample，n1-n52 is the amplification result of 1 - 52 of the first sample of cigarette-like products圖2 初次抽樣(nmin=52)煙草SSR特異性引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of tobacco specificity SSR primer pairs on original sampling (nmin=52)

3 討論

抽樣檢驗(yàn)是從一批產(chǎn)品中抽取一些樣品進(jìn)行測(cè)量、考核、檢驗(yàn)或與規(guī)定要求相比，最終依據(jù)所得結(jié)果決定整批產(chǎn)品或過(guò)程是否合格的質(zhì)量檢驗(yàn)方法，目的是在短時(shí)間內(nèi)、以較低的成本、正確地判斷產(chǎn)品是否符合技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[15]。序貫抽樣方法需要每次抽樣結(jié)束后進(jìn)行檢驗(yàn)，判斷是否進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)，與隨機(jī)抽樣、分層抽樣等方法相比，存在一定誤判風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)檢驗(yàn)人員的專業(yè)技術(shù)熟練度要求相對(duì)較高[16]。當(dāng)檢驗(yàn)接近判定閾值的批次時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鑒別檢驗(yàn)周期延長(zhǎng)，需平衡時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。在該研究中，無(wú)論是卷煙還是類煙產(chǎn)品均屬于經(jīng)工藝和機(jī)械加工后的工業(yè)產(chǎn)品，其質(zhì)量有一定的穩(wěn)定性，也就是說(shuō)產(chǎn)品的相對(duì)一致性是較好的。因此，鑒別檢驗(yàn)過(guò)程中，煙支含煙草特征性成分的類煙產(chǎn)品數(shù)量較少，即混有卷煙的類煙產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中被嚴(yán)格控制，大多數(shù)的被檢樣品相對(duì)一致性較高，只需檢驗(yàn)很小的樣本就能通過(guò)。從現(xiàn)有的一次抽樣方案來(lái)看，抽取52支檢驗(yàn)，如果假煙大于或等于6支，則該批卷煙判定為不合格，而且以90%的把握認(rèn)為該批卷煙產(chǎn)品總體卷煙支數(shù)比例在區(qū)間(6.09%，20.80%)，說(shuō)明當(dāng)樣本較少時(shí)，置信區(qū)間過(guò)寬，對(duì)總體的估計(jì)偏差增大，抽樣精確度下降，存在抽樣取證的“風(fēng)險(xiǎn)”。該研究中的OC曲線也表明，抽樣方案在較小抽樣量的基礎(chǔ)上，隨著樣品數(shù)量的增加比一次抽樣具有更佳的靈敏度和確定度。該研究中經(jīng)過(guò)序貫抽樣確定nmin為52，此時(shí)停止抽取樣品進(jìn)行DNA鑒定，判定52支卷煙均為類煙產(chǎn)品，說(shuō)明此鑒別方法較為可行。

4 結(jié)論

該研究構(gòu)建了類煙產(chǎn)品序貫抽樣方案，以訴訟方風(fēng)險(xiǎn)α=0.05、嫌疑人風(fēng)險(xiǎn)β=0.10、總體的卷煙比例≤5%為接收標(biāo)準(zhǔn)，確定了雙尾檢驗(yàn)最小理論抽樣量為52，最大抽樣量為363，最多需要檢驗(yàn)11次。經(jīng)序貫抽樣后確定的供檢材料再進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，可提高鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性。