李偉亞， 祁飛燕， 孟娟， 李娜， 李曉琪, 王秋生， 唐貴良， 張戰(zhàn)輝

(1.河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南 鄭州 450046；2.密歇根理工大學生物系，密歇根(美國) 霍頓 49931)

microRNA(miRNA)是一類長約20～24個核苷酸的內(nèi)源非編碼小分子RNA，在真核生物轉(zhuǎn)錄后通過影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性或翻譯過程來調(diào)控基因的表達[1]，其在植物的生長發(fā)育和應激反應等過程中起重要的調(diào)控作用[2-3]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)miR161包括miR161.1和miR161.2這2個家族成員。miR161由其靶基因的反向重復序列進化而成，miR161.1與miR161.2間存在部分序列重疊[4]。miR161.1和miR161.2均可以靶向剪切PPR-P(PtypePentatricopeptiderepeatprotein)基因mRNA，參與質(zhì)體RNA剪接、RNA穩(wěn)定性和翻譯的調(diào)控，并且一些PPR-P基因可被miR161剪切生成次級siRNA，從而調(diào)節(jié)細胞質(zhì)雄性不育、逆境脅迫響應和生長發(fā)育[5-9]。目前，研究者預測的miR161靶基因包括AT1G62590、AT5G41170、AT1G64580、AT1G63630、AT1G62910、AT1G63130、AT1G62930、AT1G63080、AT1G63400、AT1G63150、AT1G63070和AT1G63330[4，9]，表明miR161可能具有多樣性的功能。然而，僅有的少數(shù)相關研究主要揭示了miR161參與細胞質(zhì)雄性不育的調(diào)節(jié)[10]，其他功能尚需進一步研究。

短串聯(lián)靶標模擬(short tandem targets mimic，STTM)技術是研究miRNA功能的理想工具[11-12]，本研究利用已有的STTM161.1表達載體，通過花序侵染獲得了miR161.1特異性敲減的突變體。研究結果可為擬南芥miR161.1的功能研究奠定基礎，加深對擬南芥miR161.1分子機制的理解。

1 材料與方法

1.1 載體的構建與花序侵染轉(zhuǎn)化

本研究使用的STTM161.1載體由PENG等[12]在前期研究中構建，具體構建步驟為：首先，利用集成的DNA技術設計并合成了特異性STTM引物。利用引物上的SwaI位點，通過PCR將STTM片段導入pOT2-Poly-Cis載體進行自連接，得到pOT2-STTM。其次，使用含有PacI位點的引物將pOT2-STTM載體用作起源缺失PCR的模板，產(chǎn)生兩端具有PacI位點的STTM-CmR(氯霉素)片段。由2×35 S啟動子驅(qū)動，將STTM-CmR片段與pFGC5941-PacI(用于擬南芥)克隆到雙二元載體中，用限制性內(nèi)切酶PacI(NEB)切割后連接。將pFGC5941-STTM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為DH5α，并在含有25 g·L-1氯霉素和50 g·L-1卡那霉素(Sigma-Aldrich)的 Luria-Bertani板上選擇陽性轉(zhuǎn)化[13],最終獲得pFGC5941-STTM161.1的擬南芥雙元表達載體(圖1)。所有最終構建都通過測序驗證,將構建好的載體通過擬南芥花序侵染法進行轉(zhuǎn)基因，獲得了轉(zhuǎn)基因T0代種子。

1.2 植物生長條件

本研究所用植物材料包括擬南芥野生型Col-0、STTM161.1突變體和T-DNA插入突變體。擬南芥種子先用體積分數(shù)75%的乙醇預消毒3 min，再用體積分數(shù)10%次氯酸鈉消毒10 min，最后用無菌水清洗3～5次，置于4 ℃冰箱中春化3 d促進種子萌發(fā)。3 d后將種子點播于1/2 MS培養(yǎng)基中(pH 5.8)，7 d后，將擬南芥從培養(yǎng)基中移栽到營養(yǎng)土(120 ℃，滅菌60 min)中。置于溫室中，生長條件為(21±1)℃，光照16 h/暗8 h，相對濕度70%。

1.3 擬南芥STTM161.1轉(zhuǎn)基因株系與T-DNA插入突變體的基因型鑒定

擬南芥移栽至營養(yǎng)土3 d后，在植株表面噴灑Basta除草劑，存活的植株初步鑒定為潛在的陽性STTM植株；擬南芥移栽至營養(yǎng)土14 d左右，利用SLS法提取STTM161.1突變體、T-DNA插入突變體、野生型Col-0擬南芥植株的葉片基因組DNA，利用STTM common real primer對STTM161.1進行PCR檢測和測序；通過在線網(wǎng)站：http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html查找T-DNA插入突變體的檢測引物(表1)，對T-DNA插入突變體進行基因型鑒定。

圖1 擬南芥pFGC5941-STTM161.1的載體圖譜Fig.1 Vector map of Arabidopsis pFGC5941-STTM161.1

表1 STTM與T-DNA插入突變體篩選和RT-qPCR分析所用引物Table 1 Primers for STTM and T-DNA insertion mutants screening and RT-qPCR analysis

續(xù)表Continuing table

1.4 轉(zhuǎn)錄組分析

為了鑒定STTM161.1突變體植株在轉(zhuǎn)錄組水平上的變化，對生長35 d的野生型(Col-0)植株和STTM161.1突變體植株的地上部分進行取樣，使用試劑盒(TIANGEN DP501)提取總RNA。然后使用瓊脂糖電泳凝膠對RNA質(zhì)量進行檢測，使用Nanodrop 2 000/2 000 C對RNA濃度進行檢測。合格的樣品提交北京貝瑞和康生物技術有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析參照YANG等[14]的研究進行。

1.5 RT-qPCR定量分析

本試驗對miRNA161.1及其靶基因分別進行了RT-qPCR驗證。使用miRcute miRNA提取分離試劑盒(TIANGEN DP501)提取野生型(Col-0)，STTM161.1突變體的花和果莢的總RNA。使用miR 1stStand cDNA synthesis kit(by stem-loop) 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊)對樣品的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以U6小核RNA作為內(nèi)源性對照，野生型(Col-0)作為樣本對照。對STTM161.1中miRNA161.1突變體相對表達量進行鑒定。為了檢測miR161.1靶基因和關鍵差異表達基因在STTM161.1中的表達水平。使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對去除gDNA的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Taq II(Tli RNaseh Plus)試劑盒(中國大連Takara)，以ACTIN作為歸一化的內(nèi)源性對照，野生型(Col-0)作為樣本對照。使用CFX96 Touch實時聚合酶鏈反應檢測系統(tǒng)(Bio-Rad美國加州)儀器進行RT-qPCR反應。所使用的引物如表1所示，所有定量數(shù)據(jù)由2-ΔΔCt法[15]進行分析。利用軟件SPSS22.0(IBM，NY，USA)對獲得的定量數(shù)據(jù)進行方差分析和t測驗。

2 結果與分析

2.1 STTM161.1突變體介導擬南芥植株中miR161.1敲減與靶基因上調(diào)表達

STTM161.1的結構包括48 nt鏈接序列和2個miR161.1結合位點組成，每個結合位點為miR161.1互補序列在12～14位堿基插入3個堿基(CAT)(圖2-A)。根據(jù)YAN等[11]前期研究，利用Common real primer對初篩到的STTM161.1突變體植株進行PCR檢測和測序分析，7株中篩選到6株為陽性(圖2-B)。利用RT-qPCR對野生型Col-0與STTM161.1突變體植株中miR161.1和2個靶基因的表達水平進行分析。結果表明，與野生型相比，STTM161.1突變體中miR161.1的表達水平顯著下降超過95%(圖2-C)，miR161.1的2個靶基因(分別編碼不同的PPR蛋白)的表達水平均顯著上升超過3倍(圖2-D)。結果表明，STTM技術可以有效降低目標miR161.1的表達量，并提高其對應靶基因的表達。

A， STTM161.1的結構；B，STTM161.1突變體的PCR檢測(M:MAKER;泳道1-6:STTM161.1;泳道7：野生型)；C，擬南芥STTM161.1突變體中miR161.1的表達水平；D， miR161.1兩個靶基因的定量分析。*，**，***分別表示差異顯著水平達到(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。

2.2 miR161.1敲減介導擬南芥的表型變化

對STTM161.1突變體進行表型分析。與野生型植株相比，生長21 d的STTM161.1，突變體植株表現(xiàn)出蓮座葉較多、葉片較大、抽薹開花較早、莖基部花青素含量較多(圖3-A，3-B)。生長至35 d，STTM161.1植株表現(xiàn)出較野生型更高的株高、更多分枝和花發(fā)育缺陷(圖3-C， 3-D)。這表明miR161.1參與了擬南芥發(fā)育進程、側(cè)生分生組織和花器官發(fā)育的調(diào)控。

進一步對STTM161.1擬南芥突變體植株的花器官形態(tài)和花粉活性進行觀察與分析。與野生型(Col-0)相比，STTM161.1轉(zhuǎn)基因植株花器官的形態(tài)發(fā)生了改變，包括花瓣、花藥、雌蕊的大小和形狀(圖4-A)。進一步對花粉的活性進行檢測，利用碘-碘化鉀(I2-KI)染色后，在光學顯微鏡下使用10倍目鏡觀察，結果顯示，STTM161.1的花粉量較野生型減少，且染色較淺(圖4-B)。對STTM161.1突變體和野生型的種子發(fā)育進行分析，結果表明，STTM161.1果莢中種子較少，且部分種子敗育(圖4-C)。這些結果表明，miR161.1參與了花器官發(fā)育和雄性不育性的調(diào)控，并且可能參與了種子發(fā)育的調(diào)控。

A、B，生長21 d的擬南芥STTM161.1表型(Bar=5 cm)；C，生長35 d的擬南芥STTM161.1表型(Bar=5 cm)；D，擬南芥STTM161.1花序和果莢表型(Bar=1 000 μm)。

A，生長35 d的擬南芥STTM161.1與野生型植株花器官的形態(tài)差異(Bar=500 μm)；B，擬南芥STTM161.1與野生型植株花粉活性分析(Bar=10 μm)；C，擬南芥STTM161.1植株種子發(fā)育表型(Bar=1 000 μm)。

2.3 MiR161.1靶基因PPR相關擬南芥表型驗證

為了進一步驗證miR161.1的功能，從Arashare科技服務中心購買了2個miR161.1靶基因AT5G41170(SALK_097120C)和AT1G63080(SALK-020638C)的T-DNA突變體。通過對T2代擬南芥進行基因型鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別篩選到SALK_097120C35株突變體、SALK-020638C17株突變體(圖5)。對突變體的表型進行鑒定，與野生型相比，突變體SALK_097120C表現(xiàn)出更早的抽薹開花期和較多的蓮座葉，但發(fā)育后期與野生型的差異減小。通過體視顯微鏡觀察，SALK_097120C和SALK-020638C突變體果莢種子均較少，發(fā)育不完全，出現(xiàn)部分敗育。這些結果表明，AT5G41170和AT1G63080與miR161.1的功能有密切相關性，但相關的調(diào)控機制尚需進一步研究。

2.4 轉(zhuǎn)錄組分析

分別選取長勢一致的擬南芥野生型(Col-0)與轉(zhuǎn)基因STTM161.1植株，采集的地上部分進行轉(zhuǎn)錄組分析。通過對構建的6個cDNA文庫進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，共篩選到225個差異表達基因，其中162個上調(diào)基因和63個下調(diào)基因(圖6，表2)。其中包含線粒體特異性表達的基因(AT1G53480、AT4G08870、AT3G28510、AT5G42610，可能參與細胞質(zhì)雄性不育、線粒體生成與發(fā)育、胚胎發(fā)育)、轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF(AT1G12610、AT1G63030，可能參與種子發(fā)育過程、花、果實等器官的形態(tài)建成)，轉(zhuǎn)錄因子MADS-M-type(AT1G28460，參與擬南芥花器官的分化)，轉(zhuǎn)錄因子bHLH(AT1G59640)亞家族成員BPEp通過影響花瓣發(fā)育期間的細胞擴增從而影響花瓣的大小[16]，轉(zhuǎn)錄因子MYB21(AT3G27810)，在花絲伸長和花粉成熟方面存在缺陷，導致雄蕊不育[17-18]，是編碼基因調(diào)控花器官發(fā)育的關鍵基因。這些基因可能在miR161.1-PPR-P參與擬南芥生長發(fā)育、花器發(fā)育、雄性不育性、種子和果實發(fā)育調(diào)控途徑中發(fā)揮著至關重要的作用。

與野生型(Col-0)相比，轉(zhuǎn)基因STTM161.1在植株、葉片、果莢等表型上表現(xiàn)出明顯差異。為了進一步確定miR161.1在擬南芥中的功能，對225個差異基因進行了GO注釋 (圖7)。結果表明，STTM161.1和野生型Col-0之間差異基因主要參與脅迫響應、茉莉酸響應、茉莉酸合成、萜類代謝、氧化脅迫響應等生物途徑。KEGG富集分析(圖8)表明，差異表達基因主要參與的代謝途徑主要包括：次生代謝物生物合成、苯丙烷生物合成、嘌呤代謝、α-亞麻酸代謝等。這些結果表明，miR161.1-PPR參與了這些途徑的調(diào)控，進而決定STTM161.1突變體的表型。

A，SALK_097120C與野生型蓮座葉表型比較分析(Bar=5 cm)；B、C，生長35 d SALK_097120C突變體和野生型植株表型比較分析(Bar=5 cm)；D，SALK_097120C、SALK-020638c與野生型植株種子發(fā)育比較分析(Bar=500 μm)。

圖6 擬南芥STTM161.1與Col-0的差異基因篩選Fig.6 Differentially expressed genes screened between STTM161.1 and Col-0

表2 轉(zhuǎn)錄組分析篩選到的主要差異表達基因Table 2 Main differentially expressed genes screened by transcriptome analysis

2.5 關鍵差異表達基因的RT-qPCR驗證

為了驗證STTM161.1突變體轉(zhuǎn)錄組分析結果和miR161.1參與的調(diào)控途徑，選取差異基因中17個上調(diào)基因和6個下調(diào)基因進行熒光定量分析(圖8)。選取的差異顯著基因中的多數(shù)定量結果與轉(zhuǎn)錄組結果一致。在上調(diào)差異表達基因中，AT3G27810(編碼MYB 21)，是調(diào)控花器官發(fā)育的關鍵基因，表現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢。葉綠體、線粒體中表達的相關基因AT1G17420、AT3G45140、AT4G08870顯著上調(diào)，AT1G25145基因表現(xiàn)下調(diào)趨勢，主要參與線粒體和葉綠體外膜，參與信號或植物防御反應。這些基因的表達水平變化可能決定了花粉活性降低。AT5G47300、AT5G15660、AT3G43710(編碼F-box轉(zhuǎn)錄因子)顯著上調(diào)，激素信號途徑相關的AT2G21900(編碼轉(zhuǎn)錄因子WRKY 59)、AT5G64810(編碼轉(zhuǎn)錄因子WRKY 51)表現(xiàn)顯著下調(diào)，可能決定了STTM161.1突變體開花期的提前和植株性狀的改變[19]。AT3G14380(編碼CASPL2A2蛋白)表現(xiàn)顯著上調(diào)，在花器官脫落中起著重要作用[20]。AT1G52040(編碼MBP2蛋白)表現(xiàn)顯著上調(diào)，CAPELLA等[21]研究表明，MBP2的轉(zhuǎn)錄物在雄性不育植物中高度表達。MBP mRNA在未成熟母體中的表達水平較高，并存在于多個花器官中，包括子房、胚珠、花柱、花藥和雄蕊。

3 討論與結論

3.1 miR161及其靶基因的研究意義

miRNA是一類真核生物中廣泛存在的約20～24個核苷酸長度的內(nèi)源單鏈非編碼RNA分子，植物miRNA通過剪切 mRNA 或抑制翻譯負調(diào)控基因表達，在細胞增殖分化、個體生長發(fā)育和抵御逆境脅迫等生理過程中發(fā)揮重要作用[22-23]。miR161僅在少數(shù)幾種十字花科植物中存在，包括擬南芥、甘藍型油菜、白菜和亞麻薺(Release 22.1)[24]。在擬南芥中，miR161包括2個家族成員，miR161.1和miR161.2，可以靶向數(shù)個PPR蛋白編碼基因，并介導基因的沉默[4]。此外，miR161對一些PPR蛋白編碼mRNA切割可以產(chǎn)生次級siRNA[5]。但這些靶基因的功能僅有少數(shù)被驗證，其他植物中尚無miR161及其靶基因功能的報道。本研究利用STTM技術獲得了miR161.1敲減的轉(zhuǎn)基因突變體，且突變體具有明顯表型變異，能夠為miR161功能研究奠定基礎，進而應用于作物雜交種的不育化制種。

圖7 擬南芥STTM161.1突變體與Col-0的差異基因GO富集分析Fig.7 Gene ontology enrichment analysis of DEGs between STTM161.1 mutant and Col-0

3.2 miR161.1參與細胞質(zhì)雄性不育性的調(diào)控機制

細胞質(zhì)雄性不育是由核質(zhì)基因共同控制的花粉活性缺陷，細胞核恢復等位基因型可以恢復細胞質(zhì)不育基因控制的雄性不育，而非恢復基因型則可維持不育系的不育性，從而可應用于作物雜交種的生產(chǎn)。不同植物的研究表明，恢復基因的多數(shù)屬于PPR編碼基因，與其他PPR蛋白不同，這些PPR在線粒體中結合雄性不育控制因子編碼mRNA，從而抑制mRNA的表達[25-26]。miR161靶基因中，AT5G41170被證明編碼一種PPR蛋白，該蛋白的表達可以導致擬南芥細胞質(zhì)雄性不育[9]。此外，AT1G63130、AT1G62910和AT1G62930分別編碼線粒體RNA剪接因子RNA PROCESSING FACTOR 3/4/6，主要參與線粒體RNA剪接的調(diào)控，進而可能決定花粉育性[27-28]。本研究，STTM161.1突變體中miR161.1顯著下調(diào)表達，而其靶基因AT5G41170顯著上調(diào)表達，可能是導致STTM161.1突變體雄性不育的主要原因。轉(zhuǎn)錄組分析篩選到的差異表達基因中，下調(diào)表達基因AT3G28510、AT5G42610可能為AT5G41170編碼PPR蛋白的下游靶基因。

圖8 擬南芥STTM161.1突變體與Col-0的差異基因KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis of DEGs between STTM161.1 mutant and Col-0

3.3 miR161.1參與的擬南芥生長發(fā)育調(diào)控途徑

除調(diào)控細胞質(zhì)雄性不育外，PPR蛋白通過線粒體和葉綠體RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控途徑參與植物生長、發(fā)育的調(diào)控，PPR編碼基因的突變，會使植物在生長、胚胎和種子發(fā)育方面造成缺陷[9，29]。本研究中STTM161.1突變體的生育期、種子發(fā)育和花器官形態(tài)表現(xiàn)出明顯表型轉(zhuǎn)變，表明miR161.1-PPR參與了這些生長發(fā)育進程的調(diào)控。miR161.1靶基因AT1G62590被證明編碼葉綠體腺苷酸環(huán)化酶，葉綠體mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控，擬南芥生長發(fā)育的調(diào)控[30]；AT1G63130、AT1G62910和AT1G62930編碼的線粒體RNA剪接因子可能也在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。另外，AT1G63080的mRNA可被miR161.2剪切產(chǎn)生次生siRNA，該基因的T-DNA插入突變體(SALK-020638C)表現(xiàn)出明顯的種子發(fā)育缺陷。這表明miR161.1剪切靶基因產(chǎn)生次生siRNA可能也在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄組測序分析結果表明，AP2/ERF(AT1G12610)，直接或間接參與種子發(fā)育、花和果實等器官的形態(tài)建成等多個進程[31-32]。轉(zhuǎn)錄因子AGL59(AT1G28460)與AGL48和AGL96形成復合物，參與調(diào)節(jié)種子胚胎發(fā)育、果實膨大和衰老[33]。并且在萼片、花瓣、雄蕊、心皮這4個花器官的主要基因中，大多是編碼MADS-box(AGL57，AGL58，AGL64)類的轉(zhuǎn)錄因子，并且在產(chǎn)生花的細胞中具有不同的表達域[34]。另外有研究表明，它們還參與許多生物和非生物脅迫的響應[35]。轉(zhuǎn)錄因子bHLH其家族成員bHLH100(AT2G41240)是調(diào)節(jié)植物中微量元素鐵的關鍵基因[36]。轉(zhuǎn)錄因子MYB24(AT3G27810)與MYB21雙突變體花期花絲短，花藥不開裂，花粉粒不能存活，是調(diào)控花器官發(fā)育的關鍵基因[35-37]。這些基因可能處于miR161.1-PPR調(diào)控途徑的下游。

A，STTM161.1突變體與野生型Col-0轉(zhuǎn)錄組中上調(diào)基因驗證; B，STTM161.1突變體與野生型Col-0轉(zhuǎn)錄組中下調(diào) 基因驗證。*，**，***分別表示差異顯著水平達到(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。 A, STTM161.1 and validation of up-regulated genes in the wild type transcriptome; B, STTM161.1 and validation of down-regulated genes in the wild type transcriptome. *, **, *** represent the significant difference level at P<0.05, P<0.01, and P<0.001, respectively.圖9 擬南芥STTM161.1與Col-0之間關鍵基因DEGs的RT-qPCR分析Fig.9 RT-qPCR analysis of the key gene DEGs between Arabidopsis STTM161.1 and Col-0

3.4 結論

本研究利用STTM短串聯(lián)靶標模擬技術，獲得了STTM161.1轉(zhuǎn)基因突變體，明確了miR161.1在擬南芥雄性不育性、生育期、種子發(fā)育等方面的功能。通過表達量以及轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定到了不同材料間差異表達基因，對miR161.1參與的調(diào)控途徑進行了分析。研究結果可為miR161功能解析和作物中的應用奠定基礎。