邱 遷，廖 蕓，孟 琦，周 鋒，閻怡平，張 華，2

（1.重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404120；2.重慶市渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程技術研究中心，重慶 404120）

佛手屬于蕓香科柑橘屬植物[1]，是一種藥食同源植物，其花、葉、果均可入藥，具有疏肝理氣、和胃止痛的作用[2]。食品方面可加工成佛手蜜餞、佛手茶和佛手酒等。佛手主要功能成分包括揮發(fā)油、多糖、氨基酸、黃酮類化合物、香櫞脂類等化合物[3-5]。酵素是一種以水果、蔬菜為原材料，利用酵母菌、乳酸菌及其他益生菌發(fā)酵而形成的一種液體或固體食物，所含營養(yǎng)成分非常較多，包括脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等，具有抗炎、抗菌、抗氧化、增強免疫力、降脂、解酒、保肝、美白及改善腸道微環(huán)境的功能[6-8]。由于其天然特性和無副作用而受到人們的廣泛追捧。目前，佛手主要通過售賣佛手果和盆景來獲得一定的經(jīng)濟效益。與國外相比，我國佛手果深加工產(chǎn)品較少[9]。因此，試驗以佛手為原材料，通過優(yōu)化試驗條件，以羥基自由基清除率為考查指標，研究具有羥基自由基活性最佳佛手酵素制備工藝，為佛手的進一步深加工和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本與主要試劑

野生新鮮成熟佛手果，外表金黃、皺而有光澤、購自自重慶市萬州區(qū)龍沙鎮(zhèn)。

無水乙醇、七水硫酸亞鐵、30%過氧化氫溶液，中國重慶川東化工集團有限公司提供；水楊酸，成都市科龍化工試劑廠提供；無水葡萄糖，購自當?shù)厮幍?；果膠酶，山東圣斯德食品添加劑有限公司提供；安琪活性干酵母，安琪酵母（伊犁）有限公司提供；紅棉純正紅糖，廣州市華僑糖廠提供；水為超純水，實驗室自制。

1.2 主要儀器

722型可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品；FA1004型號電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產(chǎn)品；HH.S型精密恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司產(chǎn)品；FW80型高速試樣粉碎機，河北省黃市新興電器廠產(chǎn)品；ZXFD-5250型十段編程鼓風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；AIphal1-2 LDplus型真空冷凍干燥機，德國Christ公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 樣品預處理

將新鮮佛手果切成薄片，置于60℃恒溫干燥箱中干燥4 d，粉碎后過40目篩，密封干燥保存。

2.2 酵母菌的活化

準確稱安琪活性干酵母粉5 g加入質(zhì)量分數(shù)為2%的葡萄糖溶液50 mL，于30℃條件下進行活化3~5 h。

2.3 酵素制備

2.3.1 工藝流程

佛手液的制備（佛手干粉1 g∶蒸餾水20 mL）→添加果膠酶反應→煮沸糖化→滅菌→接種酵母菌→離心取上清液→真空冷凍干燥。

2.3.2 操作要點

準確稱取5 g過40目篩的佛手果干粉，加入蒸餾水,料液比為1∶20（g∶mL），之后加入果膠酶0.21 g，作用15 min后，煮沸糖化1.5 h，加入不同量的紅糖，搖勻，然后放入滅菌鍋，在115℃條件下滅菌30 min。滅菌冷卻后在無菌環(huán)境下按不同接種量接種已活化的安琪高活性干酵母，放入恒溫箱中進行發(fā)酵[10]。發(fā)酵后獲得酵素液，并通過測定羥基自由基的活性作為評價酵素功能的檢測指標。

2.4 單因素試驗

2.4.1 酵母菌接種量的確定

設定糖質(zhì)量分數(shù)20%，發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度30℃，分別考查不同酵母接種量（體積分數(shù)）2%，4%，6%，8%，10%所得酵素的羥基自由基清除率。

2.4.2 糖質(zhì)量分數(shù)的確定

設定發(fā)酵時間36 h，發(fā)酵溫度30℃，酵母接種量2%，分別考查不同糖質(zhì)量分數(shù)（質(zhì)量分數(shù)）10%，15%，20%，25%，30%所得酵素的羥基自由基的清除率。

2.4.3 發(fā)酵時間的確定

設定糖質(zhì)量分數(shù)20%，發(fā)酵溫度30℃，酵母接種量2%，分別考查不同發(fā)酵時間36，60，84，108，132 h所得酵素的羥基自由基清除率。

2.4.4 發(fā)酵溫度的確定

設定糖質(zhì)量分數(shù)20%，發(fā)酵時間36 h，酵母接種量2%，分別考查不同發(fā)酵溫度26，28，30，32，34℃所得酵素的羥基自由基清除率。

2.5 正交試驗

在酵母菌接種量（A）、糖質(zhì)量分數(shù)（B）、發(fā)酵時間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個單因素基礎上進行L9（34）正交試驗，設計四因素三水平試驗，取3個考查水平，分別以發(fā)酵時間36，60，84 h和糖質(zhì)量分數(shù)10%，15%，20%，酵母菌接種量4%，6%，8%和發(fā)酵溫度28，30，32℃對比試驗。以所得酵素的羥基自由基的清除率為評價指標，確定酵母菌發(fā)酵的最佳工藝條件，每一次試驗稱取佛手干粉為5 g。

正交試驗的因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗的因素與水平設計

2.6 測定羥基自由基的清除率

2.6.1 試劑配制

（1）9 mmol/L乙醇-水楊酸。精確稱取水楊酸1.243 g，然后用乙醇溶解，將溶解液移入100 mL容量瓶中用乙醇定容，然后取出部分在另一容量瓶中稀釋10倍。

（2）9 mmol/L硫酸亞鐵。精確稱取FeSO4·7H2O溶液2.502 g，加入蒸餾水溶解，將溶解液移入100 mL容量瓶中定容，然后取出部分在10 mL另一容量瓶中稀釋10倍。

（3）8.8 mmol/L H2O2。精確稱取30%的H2O2溶液9.926 g在小燒杯中，加入蒸餾水，然后移入100 mL容量瓶中定容，然后取1 mL置于另一100 mL容量瓶中稀釋100倍。

2.6.2 試驗方法

取出一支10 mL試管，依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL和9 mmol/L水楊酸溶液1 mL，再加入稀釋后的佛手酵素液1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL。充分搖晃均勻后，置于37℃熱水中水浴反應30 min，取出冷卻，然后充分搖晃，于510 nm波長處測定其吸光度為A1，此為試驗組，不加樣品為空白組測得的數(shù)值為A，不加H2O2的為對照組，測得的數(shù)值為A0[11]。

式中：A——空白對照的吸光度；

A1——加樣品的吸光度；

A0——不加顯色劑H2O2。

2.7 真空冷凍干燥

將發(fā)酵液可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)濃縮到30%，通過真空冷凍干燥得到水分質(zhì)量分數(shù)小于5%的佛手果渣酵素粉。真空冷凍干燥條件為冷凍溫度-20℃，真空度10~20 Pa，冷阱溫度-45℃[12]。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組試驗設置3個重復，數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著者進行Ducan's多重比較。結果用“平均值±標準差”表示，顯著水平設置為p=0.05。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 不同酵母菌接種量對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

酵母菌接種量與酵素羥基自由基清除率關系見圖1。

圖1 酵母菌接種量與酵素羥基自由基清除率關系

由圖1可知，酵母菌接種量為6%時，所獲得的羥基自由基清除率最大，最高可達到43.79%。達到最高清除自由基能力之后，隨著接種量的增加，羥基自由基清除能力逐漸降低。

3.1.2 不同糖質(zhì)量分數(shù)對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

糖質(zhì)量分數(shù)與酵素羥基自由基清除率關系見圖2。

由圖2可知，當糖質(zhì)量分數(shù)為15%時有一個峰值，在糖質(zhì)量分數(shù)為25%時一個最低值，之后隨著糖質(zhì)量分數(shù)升高，又有上升趨勢。總體清除自由基能力差別為27%~29%，差別較小?？紤]成本等因素，認為當糖質(zhì)量分數(shù)為15%時為最佳。其他研究也表明，懷山藥酵素液SOD活性隨著糖質(zhì)量分數(shù)的增加先升高再降低，糖質(zhì)量分數(shù)為12%時SOD活性最高[13]。

圖2 糖質(zhì)量分數(shù)與酵素羥基自由基清除率關系

3.1.3 不同發(fā)酵時間對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

發(fā)酵時間與酵素羥基自由基清除率關系見圖3。

圖3 發(fā)酵時間與酵素羥基自由基清除率關系

由圖3可知，最佳發(fā)酵時間為108 h，此時對羥基自由基的清除率最大，為28.34%。其次為60 h和132 h，羥基自由基清除率為23.27%和22.86%。分析原因可能是發(fā)酵菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些諸如SOD等抗氧化酶類清除活性氧。另一方面可能是酵菌本身就具有一定的抗氧化能力。例如，有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的細胞壁多糖能夠清除羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）等活性氧，起到抗氧化的功效[10]。但是隨著發(fā)酵時間增多，發(fā)酵原料物質(zhì)的消耗殆盡，便開始呈現(xiàn)下降或是平穩(wěn)趨勢[14]?？紤]到試驗效率，選取60 h為最佳發(fā)酵時間。

3.1.4 不同發(fā)酵溫度對佛手酵素液羥基自由基清除率的影響

發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關系見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關系

由圖4可知，發(fā)酵溫度與酵素羥基自由基清除率關系研究結果表明，最佳發(fā)酵溫度為30℃，羥基自由基清除率最高達到34.4%，是最低值的1.36倍。可能是此時的溫度是適合生存酵母菌的最佳溫度，有利于酵素的形成，酵素的含量增高[13]。

3.2 正交試驗

正交試驗見表2，L9（34）正交試驗結果方差分析見表3。

表2 正交試驗

表3 L9（34）正交試驗結果方差分析

通過表2可以判斷出各因素對試驗結果的影響的主次關系并確定最佳工藝提取條件。4個因素的極差順序為RD＞RC＞RA＞RB，說明發(fā)酵溫度對制備酵素對羥基自由基清除率的影響最大，酵母菌接種量次之，發(fā)酵時間再次之，糖質(zhì)量分數(shù)對其影響最小。根據(jù)總和的比較，發(fā)酵時間K2＞K3＞K1，糖質(zhì)量分數(shù)K3＞K2＞K1，酵 母 菌 接 種 量K3＞K2＞K1，發(fā) 酵 溫 度K1＞K2＞K3得 到 的 制 備 佛 手 酵 素 的 最 優(yōu) 方 案 為A2B3C3D1，即發(fā)酵時間為60 h，糖質(zhì)量分數(shù)為20%，酵母菌接種量為8%，發(fā)酵溫度為28℃時，對羥基自由基的清除率為26.33%±8.20%。

由表3可知，發(fā)酵溫度對佛手酵素羥基自由基清除率的影響差異極顯著，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度影響差異顯著。

3.3 驗證試驗

在分析正交試驗結果后，以得出的最佳提取工藝基礎上進行驗證試驗，在最佳提取工藝條件下，即發(fā)酵時間60 h，糖質(zhì)量分數(shù)20%，酵母菌接種量8%，發(fā)酵溫度28℃時平行試驗3次，測定酵素液的羥基自由基活性，結果表明，26.25%±2.99%與正交最優(yōu)組合26.33%±8.20%基本一致。所以綜合以上因素，A2B3C3D1提取工藝條件較為理想，結果穩(wěn)定、合理。

3.4 佛手酵素制備

試驗最后將最佳工藝所獲得成品濃縮至30%后，經(jīng)真空冷凍干燥后保存于-80℃冰箱中[12]。

4 結論

以佛手果為試驗對象，依據(jù)羥基自由基抗氧化活性強弱制備酵素，分別考查了酵母菌接種量、發(fā)酵時間、糖質(zhì)量分數(shù)、發(fā)酵溫度4個單因素，并進行了正交試驗優(yōu)化。試驗表明佛手酵素具備羥基自由基清除能力，查閱文獻未見佛手酵素相關研究，但是與其他藥食同源食品酵素類似，具有ABTS和DPPH自由基清除能力[15]。試驗選出的最佳發(fā)酵時間為60 h，與已有報道相符。在不同的原料、菌種，不同的的發(fā)酵工藝及目標產(chǎn)物顯示酵素發(fā)酵的時間存在較大差異。例如，王俊偉等人[16]研究糙米發(fā)酵只需2 h，就可以產(chǎn)生γ-氨基丁酸含量較高的酵素。李豆[17]在新型水果酵素的研制過程中，發(fā)酵時間為1~3個月。郭偉峰等人[18]研制桑葚酵素飲料發(fā)酵所需時間24 h，SOD酶活力明顯提高?？傮w而言，最終選出抗氧化活性最佳的佛手酵素發(fā)酵工藝的最佳因素為發(fā)酵時間60 h，糖質(zhì)量分數(shù)20%，酵母菌接種量8%，發(fā)酵溫度28℃。同時，將得到的發(fā)酵液滅菌濃縮后通過真空冷凍干燥，制成佛手果渣酵素粉狀產(chǎn)品。