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海立嚙齒桿菌OmpA基因缺失株的構(gòu)建及其生物學特性

2022-02-08 12:15:38馮育芳張雪青趙德明岳秉飛
實驗動物科學 2022年5期
關(guān)鍵詞:巴斯德同源質(zhì)粒

邢 進 馮育芳 張雪青 高 強 趙德明 岳秉飛

(1.中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所/國家嚙齒類實驗動物資源庫,北京 102629) (2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 100193)

嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica, Pp)是嚙齒類實驗動物中非常重要的條件致病菌,根據(jù)實驗動物微生物學檢測國家標準的要求,SPF級動物必須排除[1]。北京地區(qū)實驗動物質(zhì)量抽檢結(jié)果中,嗜肺巴斯德桿菌是檢出率最高的病原菌[2],是造成SPF級動物不符合標準的主要因素。根據(jù)最新分類學研究,嗜肺巴斯德桿菌被重新劃分為海立嚙齒桿菌(Rodentibacterheylii,Rh)和嗜肺嚙齒桿菌(Rodentibacterpneumotropica, Rp),二者分別對應(yīng)原Heyl和Jawetz兩種生物型[3-4]。目前現(xiàn)行的國家標準,海立嚙齒桿菌(Rh)和嗜肺嚙齒桿菌(Rp)仍同時作為嗜肺巴斯德桿菌進行檢測。

外膜蛋白A(OmpA)是革蘭陰性細菌的主要外膜蛋白之一,在綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、流感嗜血桿菌和衣原體等病原菌中具有重要的致病作用。OmpA通過參與細菌黏附侵襲過程,逃避宿主防御或促炎性細胞因子產(chǎn)生的刺激因子,幫助細菌在宿主體內(nèi)存活具有重要作用。這些致病作用最常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病和泌尿生殖系統(tǒng)疾病有關(guān)[5]。

RTX和YadA可能是嗜肺巴斯德桿菌的重要毒力因子[6-7],二者分別是巴斯德菌科[8]和耶爾森氏菌的主要毒力基因[9],與嗜肺嚙齒桿菌相比,海立嚙齒桿菌具有更高的毒力[10],相關(guān)研究多圍繞前者開展[11-12],尚缺乏針對海立嚙齒桿菌的研究。在北京地區(qū)實驗動物嗜肺巴斯德桿菌陽性樣本中,以海立嚙齒桿菌感染為主,占比90%[12],因此有必要對海立嚙齒桿菌展開深入研究。本研究采用同源重組技術(shù)構(gòu)建海立嚙齒桿菌OmpA基因缺失株,研究該基因缺失株的生物學特性及對小鼠的致病性,為闡明海立嚙齒桿菌的致病機制奠定基礎(chǔ)。對于優(yōu)化檢測項目,完善我國實驗動物微生物檢測體系,不斷提高實驗動物質(zhì)量具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級4~5周齡雄性15只ICR小鼠,由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(京)2017-0005】,使用許可證號【SYXK(京)2017-0013】。本實驗由動物福利倫理審查,倫理審批號:中檢動(福)第2019(B)023號。所有受試動物經(jīng)qPCR和培養(yǎng)法檢測,海立嚙齒桿菌和嗜肺嚙齒桿菌均為陰性。

1.1.2菌株和載體:海立嚙齒桿菌小鼠分離株P(guān)P320,本實驗室保存;海立嚙齒桿菌ATCC12555、嗜肺嚙齒桿菌ATCC35149購自ATCC;大腸桿菌CMCC44117購自CMCC。自殺質(zhì)粒pDS132由中國食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所崔生輝博士惠贈;S17-1λpir購自莊盟生物公司;大腸桿菌DH5α pET-30a菌株由本實驗室保存。

1.1.3主要試劑:哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(OXIOD公司),胰酪蛋白胨液體培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、LB培養(yǎng)基(BD公司),SOC液體培養(yǎng)基(Solarbio公司),氯霉素、卡那霉素(生工生物有限公司),DMEM 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、無菌PBS(Gibco公司)。

高保真PrimerSTAR預(yù)混液(TaKaRa公司),限制性內(nèi)切酶SacI、SphI(NEB公司),EasyGeno無縫克隆試劑盒(天根生化科技有限公司),細菌基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司),質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen公司),瓊脂糖膠回收試劑盒(全式金有限公司)。

1.1.4引物:根據(jù)Genbank海立嚙齒桿菌 Ppn222全基因組序列(NCBI Reference Sequence: NZ_MLAF01000014.1)、卡那霉素抗性基因(KanR)和pDS132質(zhì)粒序列,CE design1.04(Vazyme)軟件和Primer premier 6.0設(shè)計引物,由生工生物工程有限公司合成,見表1。

1.2 方法

1.2.1上下同源臂和Kan抗性基因的擴增:試劑盒提取海立嚙齒桿菌分離株P(guān)P320基因組。分別以O(shè)vLF/OvLR、OvRF/OvRR為引物,擴增OmpA基因的兩側(cè)序列作為其上下游同源臂;以pET-30a質(zhì)粒為模板,OvKanF/OvKanR擴增Kan抗性片斷,PCR反應(yīng)條件:98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán)。

1.2.2Overlap:PCR構(gòu)建OL-Kan-OR同源片斷:以稀釋10倍的上、下游同源臂和Kan抗性基因PCR產(chǎn)物為模板,引物OvpDSF/OvpDSR擴增OL-Kan-OR同源片斷。反應(yīng)條件:98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 2 min,共30個循環(huán)。

1.2.3自殺重組質(zhì)粒的構(gòu)建:提取S17-1λpir/pDS132質(zhì)粒,經(jīng)SacI和SphI雙酶切線性化。按試劑盒說明,將pDS132線性化質(zhì)粒與PP320上、下同源臂純化片斷連接,反應(yīng)體系:2×EasyGeno Assenmbly Mix 5 μL,切線性pDS132(32 ng/μL)1 μL,OL-Kan-OR(56 ng/μL)1 μL,補水至10 μL,50 ℃反應(yīng)15 min。重組質(zhì)粒加入S17-1λpir感受態(tài)細胞中,熱激法轉(zhuǎn)化后經(jīng)30 μg/mL氯霉素和10 μg/mL卡那霉素LB篩選,雙酶切后測序驗證。

1.2.4OmpA基因缺失株的構(gòu)建:按常規(guī)方法制備PP320電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞[14],100 μL PP320感受態(tài)細胞與20 μg 重組自殺質(zhì)粒輕柔混勻,0.2 cm電擊杯中2.5 kV,25 μF,400 Ω電擊,電擊后立即加入1 mL SOC培養(yǎng)基,37℃下180 r/min搖振復(fù)蘇3 h。在卡那霉素(10 μg/mL)和含氯霉素(30 μg/mL)的10%蔗糖BHI瓊脂平板中篩選基因缺失株。隨機挑選10個CmR和KanR雙交換子單菌落,用引物RhompAF/RhompAR和KanF/KanR分別PCR驗證。驗證正確的OmpA缺失株命名為Rh320△ompA。

1.2.5遺傳穩(wěn)定性:Rh320△ompA在5%血瓊脂平板上連續(xù)傳20代,用16 S rDNA測序引物FD1/RP2、RhompAF/RhompAR和KanF/KanR對各代菌株做菌落PCR鑒定,16 S rDNA產(chǎn)物測序驗證。PP320和Rh320△ompA分別用梅里埃API20E紙條和全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進行生化和質(zhì)譜鑒定。

1.2.6生長曲線測定:將PP320和Rh320△ompA分別接種于BHI,36 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,調(diào)至相同濃度后接種于250 mL BHI培養(yǎng)瓶中,36 ℃ 200 r/min搖振培養(yǎng)11 h,每隔1 h吸取菌液測定濃度。以菌液的濁度值為縱坐標,時間(h)為橫坐標,繪制原分離和突變株的生長曲線。

1.2.7生物被膜形成能力比較:參考文獻[15]報道的方法,BHI中新鮮培養(yǎng)的PP320及Rh320△ompA調(diào)至濃度為McF0.5,再用BHI稀釋20倍加入96孔細胞培養(yǎng)板,200 μL/孔,重復(fù)6孔,大腸桿菌CMCC44117作陰性對照,36 ℃培養(yǎng)過夜;次日棄去菌液,滅菌去離子水漂洗、晾干后每孔加入200 μL的1%草酸銨結(jié)晶紫染液,染色15 min;棄染液后每孔加入95%乙醇200 μL脫色30 min;漂洗扣干后用酶標儀測定630波長下的吸光度值。

1.2.8MLE-12 細胞的黏附侵襲實驗:參考Steele-Mortimer[16]和Mellor[17]的方法,檢測Rh320△ompA對MLE-12細胞的黏附能力。血瓊脂上過夜培養(yǎng)的Rh320△ompA用PBS制成0.5×108CFU/mL菌液;離心漂洗后感染細胞強度MOI為100∶1(細胞∶細菌),37 ℃和5% CO2中培養(yǎng)1 h;貼壁吸出菌液,PBS清洗后重懸細胞并做10倍梯度稀釋;各稀釋度10 μL加入血瓊脂培養(yǎng)基36 ℃過夜培養(yǎng),重復(fù)5次,36 ℃培養(yǎng)24 h,計算菌落數(shù)[18];菌落平均值與相應(yīng)稀釋度相乘即為黏附菌數(shù),黏附率為黏附菌數(shù)/總菌數(shù)。

1.2.9致病性實驗:前期經(jīng)動物感染和改良寇氏法測得PP320腹腔感染小鼠的半數(shù)致死量(LD50)約為107CFU/mL。據(jù)此,PBS制備PP320和Rh320△ompA 1×109CFU/mL菌液,腹腔注射ICR小鼠,分為PP320、Rh320△ompA和PBS 3組,每組各5只,0.5 mL/只,每2 h觀察小鼠狀態(tài)。

1.2.10統(tǒng)計學方法:PP320和Rh320△ompA的生物被膜測定、對MLE-12細胞的黏附侵襲結(jié)果和對小鼠致病力結(jié)果差異性分析使用SPSS 19.0(IBM)進行。生物被膜結(jié)果采用Student’st-檢驗,對MLE-12細胞黏附侵襲力和致病力結(jié)果采用Pearson卡方檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OmpA缺失突變株的構(gòu)建

2.1.1OmpA缺失片斷OL-Kan-OR的構(gòu)建:以PP320基因組DNA為模板,擴增得到601 bp和720 bp的OmpA基因上、下同源臂;以pET-30a質(zhì)粒為模板,擴增得到1 013 bp抗性基因;經(jīng)Overlap PCR擴增上述膠回收產(chǎn)物,獲得2 334 bp連接片斷OL-KanR-OR,見圖1。

注:1.100 bp DNA Marker;2.OmpA上游同源臂;3.OmpA下游同源臂;4.Kan基因;5.OL-KanR-ORNote:1.100 bp DNA Marker; 2. Upstream homologous arm of OmpA;3. Downstream homologous arm of OmpA;4. Kan gene; 5. OL-KanR-OR圖1 OmpA上、下臂、Kan抗性片斷的擴增和同源片斷OL-Kan-OR的構(gòu)建Fig.1 Upstream and downstream homologous armsof OmpA、amplification Kan resistance fragment andConstrucion of homology fragment OL-Kan-OR

2.1.2pDS132-OL-KanR-OR重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建:OL-KanR-OR同源缺失片斷與pDS132酶切線性化質(zhì)粒經(jīng)無縫連接,熱激轉(zhuǎn)入S17-1λpir感受態(tài)細胞,提取質(zhì)粒后,用SacI和SphI雙酶切驗證重組質(zhì)粒,獲得5 000 bp和2 000 pb以上酶切片斷,經(jīng)測序驗證無誤,成功構(gòu)建pDS132-OL-KanR-OR重組自殺質(zhì)粒,見圖2。

注:1.1 000 bp DNA Marker;2.重組質(zhì)粒SacI/SphI酶切產(chǎn)物;3.pDS132重組質(zhì)粒Note:1.1 000 bp DNA Marker; 2. Xba I and Hind III digested productsof the recombinant plasmid; 3. pDS132 recombinant plasmid圖2 重組自殺質(zhì)粒及酶切驗證Fig.2 Agarose electrophoretogram of recombinantsuicide plasmid and digestion

2.1.3OmpA缺失株的篩選及驗證:pDS132-OL-KanR-OR重組自殺質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)入PP320感受態(tài)細胞,篩選CmR和KanR的陽性克隆。挑取10個單克隆,用引物RhompAF/RhompAR擴增OmpA基因,結(jié)果均為陰性;用引物KanF/KanR擴增卡那霉素抗性基因,在1 000 bp左右均出現(xiàn)目的條帶,見圖3,4。

注:1、14:100 bp DNA Marker;2~11.Rh320△ompA突變株;12.PP320單菌落;13.空白對照Note:1、14:100 bp DNA Marker; 2~11. Rh320△ompA mutant strains;12. PP320 single colony; 13. Blank control圖3 Rh320△ompA突變株OmpA基因的擴增Fig.3 Amplification of OmpA inmutant strain Rh320△ompA

注:1、14.100bp DNA Marker;2~11.Rh320△ompA突變株;12.PP320單菌落;13.空白對照Note:1,14.100 bp DNA Marker; 2~11. Rh320△ompA mutant strains;12. PP320 single colony; 13. Blank control圖4 Rh320△ompA突變株卡那霉素抗性基因擴增Fig.4 Amplification of Kanamycin resistancegene in mutant strain Rh320△ompA

2.2 OmpA缺失突變株的生物學特性

2.2.1Rh320△ompA突變株的遺傳穩(wěn)定性:Rh320△ompA經(jīng)20代連續(xù)傳代,經(jīng)16S rDNA、OmpA和Kan基因引物擴增,結(jié)果一致。16S rDNA目的片斷測序驗證無誤,Genbank BLAST比對登錄號為MH990317.1;各代菌株OmpA片斷陰性,Kan片斷陽性。

PP320和Rh320△ompA突變株用梅里埃API20E生化鑒定試紙條鑒定,各生化項目結(jié)果一致,結(jié)果編碼為111506414,經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢?yōu)槭确伟退沟聴U菌(數(shù)據(jù)庫未更新為海立嚙齒桿菌)。

利用全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)對PP320和Rh320△ompA突變株進行鑒定,結(jié)果均為嗜肺巴斯德桿菌(數(shù)據(jù)庫未更新為海立嚙齒桿菌),均出現(xiàn)25~30條左右質(zhì)譜峰,二者僅在8 854.86 m/z處存在峰值差異,其他部分無明顯差異,見圖5。

注:A.PP320;B.Rh320△ompANote:A.PP320;B.Rh320△ompA圖5 PP320與Rh320△ompA的質(zhì)譜峰圖Fig.5 Mass spectrogram of PP320 and Rh320△ompA

2.2.2生長曲線:兩株菌生長曲線基本一致,在6~9 h的對數(shù)生長期,Rh320△ompA繁殖速率略低于PP320,培養(yǎng)至10 h左右,菌液濃度均達McF3.0的穩(wěn)定期,見圖6。

圖6 PP320和Rh320△ompA的生長曲線Fig.6 Growth curve of PP320 and Rh320△ompA

2.2.3生物被膜檢測:基因缺失株Rh320△ompA和野生株P(guān)P320的A630平均值分別為0.110和0.092,Rh320△ompA生物膜形成能力顯著增加(P<0.01)。

2.2.4侵染MLE-12黏附率檢測:用PP320和Rh320△ompA突變株侵染MLE-12細胞后,二者的平均感染菌量、平均黏附菌數(shù)和黏附率分別為1.8×105CFU/mL、7.9×104CFU/mL、43.9%和4.1×105CFU/mL、7.5×104CFU/mL、18.3%,黏附力下降顯著(X2=43 619.064,P<0.001)。

2.2.5對小鼠的致病性:注射PP320菌液的小鼠在8 h內(nèi)全部死亡,而注射Rh320△ompA突變株菌液的小鼠死亡率為1/5(20%),二者對小鼠致死率差異顯著(X2=11.667,P<0.001),對照小鼠全部正常。發(fā)病小鼠表現(xiàn)為精神沉郁,被毛直立,蜷縮于鼠盒角落。瀕死小鼠眼部紅腫,呼吸急促,部分肛門處沾有糞便;急性發(fā)病小鼠口鼻出血后死亡。

3 討論

細菌感染宿主引發(fā)疾病甚至死亡的過程需要多種毒力因子的參與。毒力因子大部分是細菌的一些分泌性蛋白及菌體表面成分,這些蛋白成分可直接對宿主細胞造成損傷,或者介導細菌在致病過程中對宿主細胞的黏附和侵襲過程,也可能具有幫助病原微生物抵御機體防御系統(tǒng)的作用。外膜蛋白(OMPs)是巴斯德菌中已知與毒力和免疫密切相關(guān)的重要因子[19],但嗜肺巴斯德桿菌(海立嚙齒桿菌和嗜肺嚙齒桿菌)的毒力因子始終未得到確認。其中OmpA在革蘭陰性細菌中具有多種功能,在某些細菌中可誘導免疫保護,作為主要免疫原性蛋白和免疫逃逸素,同時也是細菌的一種毒力相關(guān)因子,如黏附素、侵襲素和生物膜的形成也受OmpA蛋白的調(diào)節(jié)。為了揭示OmpA對于海立嚙齒桿菌黏附和致病性的相關(guān)性,本研究利用Overlap PCR制備攜帶Kan抗性基因的上下同源臂片斷,與自殺質(zhì)粒pDS132連接,構(gòu)建自殺重組質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)化將自殺重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入分離株P(guān)P320感受態(tài)細胞中,經(jīng)相應(yīng)抗生素和蔗糖的雙重篩選,構(gòu)建了本地分離株的OmpA缺失菌株。

通過對OmpA基因缺失株的生化鑒定、質(zhì)譜鑒定、生長速率、生物被膜、對細胞黏附力變化和對小鼠致病性等生物學特性的研究。所構(gòu)建的OmpA基因缺失株與野生株相比較,生化特征未發(fā)生改變;質(zhì)譜峰圖株基本一致,但數(shù)據(jù)庫尚未更新,結(jié)果仍報告為嗜肺巴斯德桿菌;生長曲線基本一致,在6~9 h的對數(shù)增長期略慢于野生株,在本實驗取樣時間終點(10 h)時達到的菌量相同?;蛉笔е甑纳锬ば纬赡芰Ω哂谝吧?,可能OmpA基因的缺失對Rh320△ompA的生物膜形成起到了反饋調(diào)節(jié)作用,具體的機制有待進一步研究?;蛉笔е陮LE-12細胞的黏附力低于野生株,表明OmpA的缺失降低了海立嚙齒桿菌對細胞的黏附能力?;蛉笔е陮π∈笾滤缆拭黠@下降,證實OmpA在海立嚙齒桿菌的感染過程中對侵襲小鼠起到了關(guān)鍵作用。給菌后的小鼠同樣表現(xiàn)出典型的感染癥狀,精神萎靡、被毛直立、眶周紅腫和排便失禁等,說明相關(guān)致病機制有待深入研究。

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