馮連榮，宋立志，趙大根，矯麗曼

（遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213）

新林1號楊（PopulusבXinlin 1’）是國有新民市機(jī)械林場培育的楊樹品種，屬于黑楊派與青楊派的雜交種[1]，樹干通直，樹冠冠形圓滿，樹枝多而密，雄株，無飛絮，2015年9月通過遼寧省林木良種委員會被審定為楊樹良種，2016年10月取得了林木良種生產(chǎn)經(jīng)營許可證。與意大利214楊（P.×euramericana cv.‘I-214’）、蓋 楊（P.×gaixianensis）、107楊（P.×euramericana cv.‘Neva’）和108楊（P.×euramericana cv.‘Guariento’）相比，其生長優(yōu)勢明顯且抗逆性較強(qiáng)[2]，目前在遼寧省內(nèi)沈陽、錦州、葫蘆島等地被大面積推廣，推廣效果良好，是纖維材、膠合板材等原料林重要造林品種，也是重要的防護(hù)林造林品種之一[1]。

新林1號楊1年生扦插盆栽苗在溫室內(nèi)培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)其中1株盆栽苗葉片上出現(xiàn)圓形病斑，為鑒定引起該病斑的病原菌種類，于室內(nèi)進(jìn)行了病原菌菌種分離，并利用rDNA-ITS序列分析進(jìn)行了分子鑒定，為下一步研究該病原菌致病機(jī)理及防治方法等奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 植物材料

新林1號楊（PopulusבXinlin1’）1年生扦插盆栽苗，置于25℃人工智能溫室內(nèi)培養(yǎng)，空氣濕度70%~80%。

1.2 酶和試劑

TaKaRa Ex Taq、DL2000 Marker購自TaKaRa生物工程有限公司、TIANGEN植物快捷型DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）試劑盒購自北京天根生化有限公司；引物ITS1：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4：TC CTCCGCTTATTGATATGC，引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.3 菌種分離

將采集的新林1號楊病葉于超凈工作臺中按下列步驟進(jìn)行菌種分離：無菌水清洗病葉3遍，75%酒精消毒2 min，無菌水漂洗3次，0.1%HgCl消毒2 min，無菌水漂洗3次，剪取病健交界處葉片組織約0.5 cm2接種至PDA固體平板培養(yǎng)基中。每個平板接種2塊，置于25℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。待菌落直徑為2 cm左右時，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接、純化，將純化后的菌株命名為XL-1，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，采用離體葉片接種，以菌絲塊作為接種材料進(jìn)行致病性測定。4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。取健康的新林1號楊中上部葉片，葉柄末端用浸水脫脂棉包裹，葉片表面用75%酒精擦拭消毒后，將菌餅放置在主脈兩側(cè)葉片上，每側(cè)放置一個菌餅，對照處理接種PDA培養(yǎng)基塊，將處理后的葉片放置在直徑為11 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪2層濾紙，滴1 mL無菌水進(jìn)行保濕，25℃條件下培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，從發(fā)病部位進(jìn)行再次分離，通過柯赫氏法則以驗(yàn)證分離菌株是否為病原菌。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，無菌刀片刮取平板菌絲，經(jīng)液氮速凍后進(jìn)行研磨，用TIANGEN快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）進(jìn)行DNA提取，具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。提取后的DNA用TE Buffer溶解于－20℃保存?zhèn)溆?，并利用DHS NanoPro測定DNA濃度。以DNA為模板進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及應(yīng)程序見馮連榮[3]。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物送至TaKaRa（大連）生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果登錄NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行序列BLAST比對分析。下載相似性序列，用Clustalw進(jìn)行多序列比對，并輔以人工修正，分析時所有參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。利用MEGA7.0軟件采用N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建發(fā)育樹時進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 純種菌絲的獲得

經(jīng)過組織分離及轉(zhuǎn)接，獲得了XL-1純種菌絲，菌落特征見圖1，菌落平展邊緣整齊，菌絲絮狀、灰白色，后期變?yōu)榛液稚?，不產(chǎn)生色素。菌絲生長速度較快，5 d左右可以長滿整個平板。

圖1 XL-1菌落正、反特征Fig.1 Positive and negative characteristics of XL-1 colony

2.2 XL-1致病性測定

致病性測定結(jié)果（圖2）顯示,接種PDA培養(yǎng)基的對照組未產(chǎn)生病斑，接種XL-1菌餅的處理組發(fā)病，隨著接種時間的延長病斑面積逐漸增大：接種后第2天，菌餅邊緣長出菌絲，菌餅覆蓋處葉片組織出現(xiàn)小病斑，病斑直徑約1 cm；第3天病斑面積增大且菌絲透過葉片生長；第5天葉片表面出現(xiàn)大量霉層，第6天霉層布滿整個葉片。對病斑組織再次進(jìn)行病原菌分離獲得相同菌絲，證明新林1號楊葉部病斑由XL-1引起。

圖2 XL-1致病性測定Fig.2 Determination of pathogenicity of XL-1

2.3 XL-1分子生物學(xué)鑒定

提取XL-1菌絲DNA，利用DHS NanoPro測定DNA濃度為68.953 ng·μL-1，A260/A280為1.96。DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一明亮（圖3A），證明DNA質(zhì)量較好。以DNA為模板，ITS1/ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得大小約為500 bp的目的條帶（圖3B）。PCR產(chǎn)物送至TaKaRa（大連）生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示目的片段

行BLAST序列比對，獲得的相似序列均為Botrytis屬真菌，大多數(shù)為B.cinerea和B.fabae，其中與登陸號為MH212236.1的B.cinerea覆蓋度為100%，相似性為100%。下載排名靠前的B.cinerea和B.fabae序列，利用MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹（圖4），XL-1與B.cinerea聚為一支，親緣關(guān)系較近。另外通過GenBnak下載Botrytis屬標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS序列，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖5），結(jié)果顯示XL-1同樣與B.cinerea聚為一支，故將XL-1鑒定為B.cinerea（灰葡萄孢）?；移咸焰邽榻z孢綱（Hyphomycetes）叢梗孢目（Miniliales）叢梗孢科（Moniliaceae）葡萄孢屬（Botrytis）。

3 結(jié)論與討論

圖3 DNA電泳結(jié)果Fig.3 Results of DNA electrophoresis

圖4 基于ITS序列N-J法構(gòu)建進(jìn)化樹Fig.4 Construction of phylogenetic tree based on ITS gene using N-J method

圖5 基于N-J法構(gòu)建XL-1與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Construction of phylogenetic tree of XL-1 and standard strains based on N-J method

楊樹是遼寧省平原地區(qū)的主要造林樹種，在防護(hù)林和用材林的建設(shè)中均占有重要地位，具有防風(fēng)固沙、水土保持、農(nóng)田防護(hù)、固碳釋氧、凈化空氣等作用，同時還承擔(dān)著產(chǎn)業(yè)建設(shè)的重任，為社會提供大量木材，解決木材短缺、供給不足的問題[1]。在楊樹生長過程中，經(jīng)常會受到各種病原菌的侵染，其中葉部病害較為常見，如楊樹黑斑病[4]、楊葉銹病[5-6]、楊樹葉枯病[7-8]等，目前關(guān)于楊樹灰霉病的研究報道還比較少。楊樹灰霉病主要危害楊樹的莖和葉，在新植楊樹中發(fā)生較重，影響楊樹生長，降低了造林成活率，嚴(yán)重時可以導(dǎo)致楊樹大面積死亡[9-10]。段冰冰研究表明Del/Ros基因在新疆楊（P.alba var.pyramidalis）的株系過表達(dá)，可顯著提高新疆楊葉片中的丹寧、花青素、槲皮素、山奈酚以及總酚等黃酮類物質(zhì)的含量，進(jìn)一步提高了其對灰霉病的抗病能力[9]。吉海龍研究了長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）T05對灰霉病菌的抑菌活性，菌落對峙培養(yǎng)結(jié)果顯示T05對灰霉病菌抑菌率達(dá)88.4%，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉病菌抑菌率達(dá)91.9%[10]。

灰霉菌又稱灰葡萄孢菌，是一種廣寄主性的、能夠引起多種植物幼苗、果實(shí)及儲藏器官的猝倒、落葉、花腐、爛果及爛窖的病源菌[11]。潮濕時病部表層產(chǎn)生大量的灰色霉層（分生孢子梗和分生孢子），稱為灰霉病?；移咸焰弑徽J(rèn)為是新鮮水果蔬菜中最重要的采后病原菌之一，也被認(rèn)為是全球范圍第二重要的植物病原菌[12-13]。它對各種重要經(jīng)濟(jì)作物的災(zāi)難性影響，造成全球每年100億~1000億美元不等的經(jīng)濟(jì)損失[14]。在葡萄（Vitis viniferax×V.labrusca'Shuijing'）[15]、番茄（Solanumlyco persicum）[16]、草莓（Fragaria×ananassa）[17]、人參（Panax ginseng）[18]、煙草（Nicotiana tabacum）[19]、藍(lán)莓（Vaccinium spp.）[20]、浙貝母（Fritillaria thunbergii）[21]中均有報道。對于灰霉病菌的鑒定，一般基于形態(tài)特征并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定來完成。形態(tài)特征一般從菌落形態(tài)、菌絲體、分生孢子及分生孢子梗等方面進(jìn)行初步鑒定；分子生物技術(shù)鑒定應(yīng)用最為廣泛的是rDNA-ITS序列分析，如應(yīng)用rDNA-ITS序列分析對蝴 蝶 蘭（Phalaenopsis amabilis）[22]、香 蔥（Allium ascalonicum）[23]、煙草[24]、番茄[25]等灰霉病的鑒定。在真核生物基因組的編碼核糖體基因中有5SrDNA、5.8SrDNA、18SrDNA和28SrDNA這樣4種，其中18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元，其中的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）,包括ITS1及ITS2兩部分[26]。ITS序列通過與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索比對,序列相似性為95%～99%，可以鑒別為相同屬；序列相似性≥99%，可以鑒別為相同種[27]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因被應(yīng)用于病原真菌的鑒定，如甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)、組蛋白（Histone）、翻譯延伸因子1-α（Elongation factor，EF1-α）、微管蛋白(β-tubulin，BT1和BT2)、幾丁質(zhì)合成酶(chitin synthase，CHS)等[28-29]。

本研究從新林1號楊1年生扦插苗上分離獲得一種引起葉部病害的病原菌XL-1，結(jié)合病原菌菌落形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析對病原菌種屬地位進(jìn)行了鑒定，其中與登陸號為MH212236.1的B.cinerea覆蓋度為100%，相似性為100%，系統(tǒng)發(fā)育分析與B.cinerea聚為一支，雖然未進(jìn)行多基因聯(lián)合分析，從比對結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析可以確定分離病原菌為灰葡萄孢（B.cinerea）。該病原菌侵染楊樹葉片后可迅速蔓延，導(dǎo)致整個葉片發(fā)霉腐爛，嚴(yán)重影響楊樹的生長發(fā)育。下一步需要針對該病原菌的生物學(xué)特性、病原菌對不同楊樹品種的致病能力和致病機(jī)理以及防治方法等進(jìn)行深入研究，提出楊樹灰霉病綜合防治方法，以減輕其對楊樹的危害。