云 菲，楊永鋒，馬一瓊，王寶林，陳紅麗*

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)文化路95號 450002

2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)東路29號 450000

近年來，由于化學(xué)氮肥的過度施用使氮肥利用率降低，土壤酸化加重，且造成我國許多地區(qū)特別是華南、華東、京津和東北大部分區(qū)域土壤有效鉬嚴(yán)重缺乏［1-2］。河南耕地土壤平均有效鉬含量為0.078 mg·kg-1，處于嚴(yán)重缺鉬狀態(tài)的土壤（有效鉬含量＜0.15 mg·kg-1）面積占總耕地面積的93%以上［3-4］?？緹熥鳛橄层f作物，鉬含量的臨界值為0.13 mg·kg-1［5］，僅靠土壤中有限的鉬含量不能滿足煙株生長發(fā)育的需要，缺鉬直接影響煙株體內(nèi)氮素的吸收與利用，從而制約煙葉產(chǎn)質(zhì)量的提高［6］。適量施用鉬肥有助于調(diào)節(jié)植物體內(nèi)氮素的運(yùn)輸與分配，葉片硝態(tài)氮同化酶和抗氧化酶活性顯著提高，同時催化硝酸鹽向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化，降低植物體內(nèi)硝態(tài)氮的積累，從而提高植物的氮素利用率［7］。胡珍蘭等［8］研究發(fā)現(xiàn)，施用鉬肥可促進(jìn)冬小麥在拔節(jié)期和抽穗期將吸收的氮素分配到生長中心。陳志青等［9］研究表明，相同氮肥施用水平下，施用離子鉬和納米鉬肥可顯著提高水稻各器官的氮素積累量，并提高氮肥偏生產(chǎn)力、氮素農(nóng)學(xué)利用率、生理利用率和吸收利用率。此外，鉬肥對煙株總氮、可溶性蛋白、游離氨基酸含量的影響受供氮水平的制約［10］。高氮素水平下增施鉬肥可降低上部葉煙堿含量，施用鉬肥對生育后期的煙葉NO3--N 含量減少具有一定的促進(jìn)作用［11］。龔治翔等［12］研究表明，施用鉬肥能顯著增加中、高氮水平下烤煙干物質(zhì)積累量及生育前期煙葉光合色素含量，且隨氮素水平的提高，生育后期煙葉中硝酸還原酶活性增強(qiáng)，NO3--N 含量減少，低氮水平下施用鉬肥對烤煙“增糖降堿提鉀”具有顯著促進(jìn)作用。因此，合理的氮鉬配施對烤后煙葉化學(xué)品質(zhì)的提高具有顯著的協(xié)同效應(yīng)［13］。目前有關(guān)不同氮素水平下配施鉬肥對烤煙氮素積累及氮組分變化的影響機(jī)制尚不明確，為此探討了氮鉬肥配施對烤煙光合特性、氮素積累、含氮化合物含量及烤后煙葉氮組分的影響，揭示煙株體內(nèi)主要氮組分含量變化對氮鉬互作效應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制，旨在篩選出最優(yōu)的氮鉬肥配施方式進(jìn)而為優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)基本情況

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)置在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌科教園區(qū)（北緯34°01′，東經(jīng)113°49′），該地區(qū)屬于暖溫帶季風(fēng)氣候。供試土壤采自河南省許昌市襄城縣（北緯33°51′，東經(jīng)113°28′）。土壤類型為潮土，土壤質(zhì)地為砂壤土，有機(jī)質(zhì)含量12.48 g·kg-1，pH 7.95，速效磷7.72 mg·kg-1，速效鉀124.66 mg·kg-1，堿解氮58.46 mg·kg-1，有效鉬含量0.043 mg·kg-1。土壤經(jīng)風(fēng)干并用脛腐康土壤消毒劑（鄭州惠農(nóng)有害生物防治有限公司）進(jìn)行熏蒸消毒后過0.5 mm×1.0 mm 網(wǎng)篩，將肥料與土壤混合攪拌均勻后裝盆，盆高45 cm，盆口直徑40 cm，盆底直徑30 cm，每盆裝土20 kg，行株距120 cm×50 cm。供試烤煙品種為K326。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

采用兩因素三水平完全交互試驗(yàn)設(shè)計，設(shè)置低、中、高3個氮素營養(yǎng)水平，分別為N0（0 g·kg-1土）、N0.15（0.15 g·kg-1土）、N0.3（0.30 g·kg-1土），每個氮素水平下分別設(shè)置3個鉬肥梯度，分別為Mo0（0 mg·kg-1土）、Mo0.15（0.15 mg·kg-1土）、Mo0.3（0.30 mg·kg-1土），共計9個處理。其中，氮肥和鉬肥分別為分析純NH4NO3（氮含量35%）、鉬酸銨［（NH4）6Mo7O24·4H2O］（鉬含量54%）；各處理磷肥（KH2PO4）和鉀肥（K2SO4）水平保持一致，每1 kg土中P2O5含量為0.23 g，K2O 含量為0.45 g。每處理30 盆，每盆栽煙1 株。煙苗于2019 年5月20 日移栽，按照烤煙栽培技術(shù)規(guī)程［14］進(jìn)行管理。生育期內(nèi)各處理灌水量保持一致，灌溉用水為去離子水，以避免其他因素對肥料施用效果的干擾。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

在煙株生長的關(guān)鍵時期（移栽后30、45、60、75和90 d），選取生長一致且受光方向相同的功能葉片進(jìn)行光合指標(biāo)的測定。同時，測定各時期鮮煙葉中可溶性蛋白、游離氨基酸含量及硝酸還原酶活性，并取殺青煙樣用于干物質(zhì)和氮素積累的計算，每處理測定3株，每株測定3次，取平均值。

1.3.1 光合指標(biāo)的測定

采用LI-6400 便攜式光合作用測定系統(tǒng)（美國LI-COR 公司）測定中部功能葉的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）。

1.3.2 氮素積累量的測定

參照標(biāo)準(zhǔn)方法YC/T 161—2002［15］測定氮含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。計算公式：

1.3.3 氮代謝關(guān)鍵酶活性及含氮化合物含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定可溶性蛋白含量［16］，采用活體法測定硝酸還原酶活性［16］，采用茚三酮溶液顯色法測定游離氨基酸含量［16］。

1.3.4 干物質(zhì)積累量的測定

從移栽后30 d 開始，每隔5 d 取樣1 次，每處理隨機(jī)選取3株代表性煙株，將根、莖和葉分開稱取鮮質(zhì)量，于105 ℃殺青15 min，65 ℃恒溫烘干，稱其干質(zhì)量，并計算干物質(zhì)積累量。

1.3.5 烤后煙葉氮組分的測定

參照國標(biāo)GB 2635—1992［17］對烤后煙葉進(jìn)行分級，利用AA3 連續(xù)性流動分析儀（SEAL，德國BRANLUEBBE公司），參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法測定中部煙葉煙堿［18］和總氮［15］含量。每處理重復(fù)3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2013 和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制；使用新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)；利用SPSS Amos 軟件建立結(jié)構(gòu)模型分析相關(guān)因子與烤后煙葉主要氮組分（總氮和煙堿）含量的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮鉬肥配施對烤煙氣體交換參數(shù)的影響

如圖1a 所示，隨著氮素水平的增加，Pn 呈先增加后降低的變化趨勢，中等氮素水平最有利于Pn的提高，分別較低氮、高氮處理增加4.64%～104.01%和1.38%～82.40%。整個生育期內(nèi)，在移栽后60 d N0.15Mo0.15處理的Pn 達(dá)到最大值，隨后下降。不同氮素條件下增施鉬肥均能夠促進(jìn)葉片Pn的提高，且在生育前期效果較顯著，施用鉬肥處理的Pn分別較對照增加9.98%～58.00%（N0）、0.86%～38.39%（N0.15）和0.19%～30.17%（N0.3）。Gs 在生長前期（移栽后30 d 至60 d）呈持續(xù)上升趨勢，在移栽后60 d N0.15Mo0.3處理達(dá)到最大值（0.87 mmol·m-2·s-1），生長后期（移栽后75 d 至90 d），Gs 迅速下降，導(dǎo)致進(jìn)入氣孔的光合反應(yīng)原料供應(yīng)不足，與之對應(yīng)的Pn也隨之降低。施用氮肥顯著促進(jìn)了Gs的提高，不同氮素處理的Gs 增加比例以移栽后45 d最高，N0、N0.15、N0.3水平下分別比移栽后30 d 增加30.03%～40.74%、83.63%～140.28%、171.12%～250.50%；同一氮素水平下，Gs隨著鉬肥水平的增加而增大（圖1b）。整個生育期內(nèi)Ci 的變化范圍在212.67～306.67 μmol·mol-1之間，隨著施氮量的增加Ci降低，以N0.3水平下的Ci最低。同一氮素水平下，施用鉬肥量增加會引起Ci的降低，這可能是由于氮鉬肥配施提高了葉片同化CO2的能力，使細(xì)胞間隙的CO2消耗速率增加，最終造成Ci下降［10］（圖1c）。

圖1 氮鉬配施對烤煙葉片氣體交換參數(shù)的影響Fig.1 Effects of combined application of nitrogen and molybdenum fertilizers on gas exchange parameters of flue-cured tobacco leaves

2.2 氮鉬肥配施對烤煙氮代謝關(guān)鍵酶及含氮化合物含量的影響

硝酸還原酶（NR）是一種水溶性鉬黃蛋白，受NO3-和Mo共同誘導(dǎo)［19］。由圖2a可知，NR活性隨氮素水平的升高而增加，N0水平下，氮代謝下降時間較早，在移栽后45 d NR開始下降，葉片出現(xiàn)早衰；N0.15和N0.3水平下，在移栽后60 d NR 達(dá)到峰值，生育后期葉片氮代謝運(yùn)轉(zhuǎn)速度減慢，NR迅速降低。整個生育期內(nèi)Mo0.3處理的NR 活性比對照提高8.19%～35.19%，以中等氮素水平下增加比例較高。可溶性蛋白（SP）含量的高低可反映植物對氮素的同化能力，在氮代謝過程中起著代謝庫的作用［20］。低氮條件下，在移栽后45 d SP達(dá)到峰值，中、高氮處理在移栽后60 d SP達(dá)到最高值，進(jìn)入成熟期后煙株光合能力下降，SP合成減弱，同時含量降低。提高氮素水平有利于SP 的合成，除移栽后30 d 外，SP 含量隨著施氮量的增加而增加，中、高氮處理的SP 比低氮處理分別增加19.4%～44.98%和6.38%～31.16%。施用鉬肥對SP 含量的影響受不同氮素水平的制約，以N0.15Mo0.3處理的SP含量增幅最高，移栽后45 d和60 d分別較對照增加37.75%和46.89%（圖2b）。游離氨基酸（FAA）是植物體內(nèi)氮素同化物的主要運(yùn)輸形式，與煙株體內(nèi)氮素代謝和煙葉品質(zhì)密切相關(guān)［21］。如圖2c 所示，游離氨基酸（FAA）含量呈先升高后降低的變化趨勢，除N0的FAA 最大值出現(xiàn)在移栽后45 d外，N0.15、N0.3均在移栽后60 d FAA達(dá)到最大值，F(xiàn)AA 含量隨氮素水平的提高而顯著增加。中、低氮水平下均以Mo0.3處理的FAA含量最高，分別較未施鉬處理提高20.79%～43.41%和11.09%～95.85%。高氮水平下，則以Mo0.15處理的FAA 含量最高，比對照提高0.09%～150.87%。

圖2 氮鉬肥配施對烤煙葉片硝酸還原酶活性、可溶性蛋白及游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effects of combined application of molybdenum and nitrogen fertilizers on nitrate reductase activity（NR),soluble protein（SP）content and free amino acid（FAA）content of flue-cured tobacco leaves

2.3 氮鉬肥配施對烤煙各器官氮素積累和利用的影響

植株氮素積累量是植株干物質(zhì)量與氮素含量的乘積，同時也是植株氮素營養(yǎng)豐缺水平與群體生長發(fā)育狀況的綜合反映指標(biāo)［22-23］。葉片是煙草的收獲器官，增加氮用量會顯著提高氮素在葉片中的積累，其中以N0.15Mo0.3處理葉片的氮素積累量最大，比對照提高224.03%，這與其氮素吸收效率最高有關(guān)。不同氮素水平下，中、高氮肥處理的煙株氮素積累量較高，N0.15水平下，施用鉬肥處理的氮素吸收效率比對照增加9.35%～76.98%；中、低氮水平下，隨著施鉬量的提高煙株的氮素累積量增加，施鉬處理較未施鉬處理分別增加24.68%～30.77%（N0）和3.69%～43.47%（N0.15）。高氮肥條件下，煙株的氮素吸收效率降低，施用鉬肥處理的氮素積累量較未施鉬處理降低7.57%～11.18%（N0.3）。氮鉬肥以及二者的互作效應(yīng)對煙株各組分（根、莖、葉）氮積累量的影響均達(dá)到顯著水平（表1）。將氣體交換參數(shù)、含氮化合物與煙葉氮素積累量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析可知，F(xiàn)AA、NR、Gs、Pn、Ci 均與葉片中氮素的積累呈顯著相關(guān)（r=0.93**、0.89**、0.85*、0.62*、-0.95**），其中，F(xiàn)AA 對煙葉中氮素積累促進(jìn)作用最大，Ci 則對氮素積累起到負(fù)向效應(yīng)。

表1 氮鉬肥配施對烤煙各器官氮素積累和利用的影響①Tab.1 Effects of combined application of nitrogen and molybdenum fertilizers on nitrogen accumulation and utilization of each organ of flue-cured tobacco

2.4 氮鉬肥配施對烤煙干物質(zhì)積累量的影響

如圖3所示，煙株干物質(zhì)積累量（DM）隨生育時期的延長而增加，不同氮素水平間表現(xiàn)為N0.15＞N0.3＞N0，在N0和N0.15水平下干物質(zhì)積累量隨鉬含量的升高而增加，N0Mo0.3和N0.15Mo0.3處理的干物質(zhì)積累量分別比對照增加30.30%～61.01%和53.7%～171.01%，以中氮水平下增加比例最高，這與N0.15Mo0.3處理葉片的氮素積累量最大相一致。而在N0.3水平下，施用鉬肥處理在生育后期表現(xiàn)出對干物質(zhì)積累的促進(jìn)效果，移栽75 d 和90 d 分別比對照增加10.37%～14.46%和11.28%～28.18%。氮、鉬及其互作效應(yīng)對煙株干物質(zhì)積累量增加的貢獻(xiàn)率分別為50.60%、37.65%和11.75%，說明氮素是影響煙株干物質(zhì)積累量的主導(dǎo)因素，鉬素對干物質(zhì)積累有促進(jìn)效應(yīng)，二者共同作用有利于煙株生物量的積累和產(chǎn)量形成。

圖3 氮鉬配施對烤煙干物質(zhì)積累量的影響Fig.3 Effects of combined application of nitrogen and molybdenum fertilizers on dry matter accumulation of flue-cured tobacco

2.5 氮鉬肥配施對烤后煙葉主要氮組分含量的影響

由圖4可知，煙株NR、FAA和DM是影響烤后煙葉總氮（Total N）、煙堿（Nicotine）含量的主要因素。其中，DM 直接影響煙葉總氮和煙堿含量（路徑系數(shù)分別為0.60 和0.65）；NR 每提高1個標(biāo)準(zhǔn)單位，總氮和煙堿含量分別增加0.58個和0.24個標(biāo)準(zhǔn)單位。除直接效應(yīng)外，NR 還通過影響FAA 和SP 間接影響煙葉總氮和煙堿含量；Gs 不僅直接影響煙葉總氮和煙堿含量，還能通過影響FAA和Pn間接影響煙葉氮組分含量；Ci 對煙葉總氮和煙堿含量的影響呈顯著的負(fù)效應(yīng)，并通過影響DM 和Pn 間接影響煙葉總氮和煙堿含量。將烤后煙葉總氮和煙堿含量作為因變量與含氮化合物、氣體交換參數(shù)等相關(guān)因子進(jìn)行回歸分析，得到最優(yōu)回歸方程，見表2。對方程求R2并進(jìn)行顯著性測驗(yàn)，結(jié)果與圖4相對應(yīng)，煙株干物質(zhì)積累量對總氮和煙堿含量的影響顯著，可解釋其含量變化的86.1%和81.5%。

圖4 氮鉬配施條件下相關(guān)因子對烤后煙葉主要氮組分(總氮和煙堿)影響的結(jié)構(gòu)模型Fig.4 Structural equation model for effects of related factors on main nitrogen components of flue-cured tobacco treated with combined application of nitrogen and molybdenum fertilizers

表2 烤后煙葉主要氮組分與影響因子間的回歸分析Tab.2 Regression analysis of main nitrogen components and impact factor for flue-cured tobacco leaves

3 討論

①本試驗(yàn)條件下，不同氮素水平對Pn的影響表現(xiàn)為N0.15＞N0.3＞N0，增施鉬肥可促進(jìn)3 種氮素水平下葉片Pn的提高，說明合理的氮鉬配施可提高光系統(tǒng)的穩(wěn)定性，提高煙葉光合碳同化能力，緩解氮素虧缺或過量條件下由于光合抑制物增加導(dǎo)致的光合作用受阻［24-25］，進(jìn)而為煙株生物量的增加奠定基礎(chǔ)。與N0、N0.15相比，高氮條件下產(chǎn)生報酬遞減效應(yīng)，施用鉬肥處理的Pn增長速率反而較低，這與胡珍蘭等［8］、王曉林等［26］的研究結(jié)果相似。②本研究中發(fā)現(xiàn)，低氮條件下由于煙株光合碳同化能力較弱，光合產(chǎn)物積累較少，為NR本身或?yàn)檫€原反應(yīng)過程提供的還原力有限，氮代謝下降時間較早，但隨著施用鉬肥量的增加，NR 活性、SP 和FAA 含量提高，促進(jìn)了煙株體內(nèi)氮素營養(yǎng)的吸收與轉(zhuǎn)化，從而緩解了葉片早衰對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生的不利影響；NR活性隨著氮用量的增加而提高，但當(dāng)還原速度低于硝態(tài)氮的積累速度時會造成煙葉內(nèi)硝酸鹽的累積，中、高氮條件下煙株氮代謝旺盛，配施鉬肥可提高NR 活性，加速硝態(tài)氮向銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化，減少硝酸鹽的積累，進(jìn)而提高煙葉安全性。這與劉紅耀［27］、Moussa等［28］、門中華等［29］的研究結(jié)果相似。③由于煙株打頂后莖不再生長，而葉片和根系繼續(xù)生長，因此施氮處理的烤煙各部位氮素積累量表現(xiàn)為葉片＞根部＞莖部。煙株優(yōu)先將大部分氮素分配到葉片中，有利于光合作用效率的提高，進(jìn)而促進(jìn)了葉片生物量的增加［30-31］。氮鉬肥及其互作效應(yīng)對煙株干物質(zhì)積累量增加的貢獻(xiàn)率分別為50.60%、37.65%和11.75%，說明氮素是影響煙株干物質(zhì)積累量的主導(dǎo)因素，鉬素對干物質(zhì)積累也有促進(jìn)效應(yīng)，二者的協(xié)同增效有利于煙株產(chǎn)量的形成。N0.15Mo0.3處理的生物量最高，這與中等氮素水平下配施鉬肥的葉片氮素吸收效率最大相一致，說明在適宜的氮素水平下配施鉬肥可優(yōu)化氮素在葉片中的供給與分配，增強(qiáng)烤煙的光合碳同化能力，最終促進(jìn)煙株生長及物質(zhì)積累，這與胡承孝等［32］、崔國明等［33］的研究結(jié)果相似。④烤后煙葉中主要氮組分總氮和煙堿含量受DM 及NR 的影響較大，此外，氣體交換參數(shù)中Gs不僅直接影響主要氮組分含量，還通過Pn和FAA間接影響總氮和煙堿含量。綜上所述，合理的氮鉬配施可通過提高Pn 和Gs 進(jìn)而促進(jìn)煙株光合碳同化能力提高，優(yōu)化氮素在各組分中的分配，從而調(diào)控NR活性、FAA、DM含量，最終促進(jìn)干物質(zhì)的積累，協(xié)調(diào)烤后煙葉氮組分含量，提高煙葉品質(zhì)。

4 結(jié)論

合理的氮鉬肥配施能夠顯著提高煙葉的凈光合速率，促進(jìn)光合碳同化能力及氮素吸收效率提高，有利于煙株各組分生物量的積累。本試驗(yàn)條件下，以N0.15Mo0.3處理最有利于煙株生長和干物質(zhì)積累。氮鉬肥配施還可以通過調(diào)控?zé)熑~中NR 活性、FAA 和DM 含量，進(jìn)而協(xié)調(diào)烤后煙葉中氮組分含量。因此，在煙葉生產(chǎn)過程中，針對缺鉬煙田可通過氮肥與鉬肥配施促進(jìn)煙株氮素的吸收轉(zhuǎn)化，緩解低氮條件下煙葉早衰，避免高氮水平下硝酸鹽積累，從而在一定程度上改善烤后煙葉品質(zhì)。